唑來膦酸抑制U937細胞增殖及誘導凋亡*

范蕊芳， 劉玲玲， 張 玲， 郭小燕， 王曉珍， 林東軍△

(1中山大學附屬第三醫院血液科，廣東廣州510630;2廣東省婦女兒童醫院兒科，廣東廣州510010)

唑來膦酸抑制U937細胞增殖及誘導凋亡*

范蕊芳1， 劉玲玲1， 張 玲1， 郭小燕2， 王曉珍1， 林東軍1△

(1中山大學附屬第三醫院血液科，廣東廣州510630;2廣東省婦女兒童醫院兒科，廣東廣州510010)

目的:研究唑來膦酸(ZOL)對人類急性髓系白血病細胞U937的增殖抑制及促凋亡作用。方法: CCK-8法檢測不同時間ZOL對U937細胞的生長抑制率;流式細胞術檢測ZOL對U937細胞周期的影響;Annexin V-PI法及Hoechst 33342法檢測ZOL作用前后細胞凋亡情況變化，JC-1檢測ZOL對U937細胞線粒體膜電位變化的影響;克隆形成實驗檢測U937細胞克隆形成能力;Western blot法檢測ZOL對U937細胞周期和凋亡相關蛋白的變化。結果:CCK-8結果顯示ZOL可以抑制U937細胞的活力，并呈時間-劑量依賴性;Annexin V-PI及Hoechst 33342結果顯示ZOL可以促進U937細胞凋亡，且呈時間-劑量依賴性;JC-1結果顯示ZOL可以明顯降低U937細胞線粒體膜電位;PI法證實ZOL將U937細胞周期阻滯在S期，克隆形成實驗證實0.2 mmol/L ZOL可以完全抑制U937細胞的克隆形成能力;Western blot結果顯示ZOL作用于U937細胞48 h后細胞周期相關蛋白p21表達顯著增強，促凋亡蛋白Bax表達增強，抑凋亡蛋白Bcl-2表達明顯減弱。結論:ZOL抑制U937細胞的增殖和克隆形成主要是由于抑制了細胞周期相關蛋白表達，同時ZOL可以促進U937細胞凋亡，這種作用主要是通過調節線粒體凋亡途徑相關蛋白來實現的。

唑來膦酸;U937細胞;細胞周期;細胞凋亡

急性髓系白血病是一組由造血干細胞惡變引起的惡性克隆性疾病，它是以骨髓中幼稚的腫瘤細胞增殖浸潤，進而影響正常造血功能，臨床主要表現為貧血、出血、感染。目前臨床上對于白血病的原發病治療有化療、分子靶向治療和造血干細胞移植等手段。造血干細胞移植由于需要嚴格的配型、費用大及移植物抗宿主病等缺點限制了其廣泛開展，傳統的化療方案雖然能使50%～75%患者獲得完全緩解，但只有20%～30%患者獲長期無病生存，大部分獲得完全緩解的患者2年內復發、死亡，如何提高化療藥物的敏感性、降低耐藥率成為亟待解決的問題。分子靶向治療一直是近十年來白血病治療的研究熱點，分子靶向藥物與常規化療方案聯合以提高治療效果，減少耐藥，為復發難治性白血病患者提供新的治療策略。

唑來膦酸(zoledronic acid，ZOL)是第3代雙膦酸鹽類藥物，主要通過抑制破骨細胞活性和誘導破骨細胞凋亡來抑制骨吸收，用于治療惡性高鈣血癥、多發性骨髓瘤及其它惡性腫瘤導致的骨質破壞。近年來國內外多項臨床前及臨床研究表明唑來膦酸具有一定的抗腫瘤效應［1］，該效應主要有抑制腫瘤細胞增殖［2-3］、阻滯腫瘤細胞的周期進展［4］、促進腫瘤細胞凋亡［5-6］、抑制腫瘤血管的形成［7-8］以及抑制腫瘤黏附遷移能力［5，9］等，在多種實體瘤及血液系統腫瘤中發現唑來膦酸可以明顯抑制腫瘤細胞的生長并促進其凋亡。本課題主要研究第3代雙膦酸鹽藥物ZOL對人類髓系白血病細胞U937的增殖抑制、促凋亡作用及對細胞周期的影響，檢測ZOL對細胞凋亡、細胞周期相關基因及蛋白的影響，探討唑來膦酸臨床可能的抗白血病作用機制。

材料和方法

1 主要試劑

唑來膦酸購自Sigma;胎牛血清、RPMI-1640培養基購自Gibco;CCK-8購自Dojindo;Annexin V-PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，各種 I抗及II抗購自Santa Cruz;JC-1探針購自碧云天;甲基纖維素為R＆D產品;其它生化試劑為進口分裝或國產分析純產品。

2 主要方法

2.1 細胞培養 U937細胞株為中山大學血液病研究所保存，使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，于5%CO2、37℃飽和濕度條件培養箱中培養，取對數生長期細胞進行實驗并根據實驗需要分組。

2.2 CCK-8法檢測藥物對U937細胞活力的影響

U937細胞培養于96孔板，分別給予不同濃度 (1 mmol/L、0.8 mmol/L、0.6 mmol/L、0.4 mmol/L、0.2 mmol/L、0.1 mmol/L、0.05 mmol/L和0.025 mmol/ L)的ZOL作用24 h、48 h和72 h，檢測前每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續孵育4 h，于450 nm波長的酶標儀測定吸光度。

2.3 流式細胞術檢測細胞周期 U937細胞培養于6孔板，0.2 mmol/L和0.4 mmol/L ZOL作用24 h、48 h和72 h后收集細胞，1 000 r/min離心5 min， PBS洗滌2次，然后用70% 冰乙醇固定過夜，予碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色后流式細胞術測定細胞周期。

2.4 Annexin V-PI法檢測細胞凋亡 收集細胞PBS洗滌2次，1 000 r/min離心5 min，再將細胞重懸于500 μL的binding buffer，先后加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，輕輕混勻，避光放置15 min，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。

2.5 細胞凋亡的形態學觀察 收集細胞，PBS洗滌1次，加入Hoechst 33342(10 mg/L)染液500 μL，混勻后置于37℃水浴鍋中孵育15 min，然后PBS洗滌3次，在有紫外光的熒光顯微鏡下觀察，并隨機拍照，計數凋亡細胞的數量。

2.6 JC-1熒光探針檢測細胞線粒體膜電位變化

收集細胞重懸于0.5 mL細胞培養液中，其中陽性對照組加入0.5 μL的CCCP，處理20 min。實驗組及陽性對照組細胞中各加入0.5 mL JC-1染色工作液，細胞培養箱中37℃ 孵育20 min。然后予JC-1染色緩沖液洗滌2次后重懸細胞，流式細胞術檢測膜電位變化情況。

2.7 甲基纖維素克隆形成實驗 將空白組及藥物處理后的U937細胞培養于甲基纖維素中，5%CO2、37℃ 飽和濕度條件培養箱中培養1周后觀察克隆形成情況

2.8 Western blot檢測細胞周期、凋亡相關蛋白的表達 收集細胞加入細胞裂解液100 μL室溫下孵育15 min，4℃ 下12 000 r/min離心10 min，收集上清，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，等量蛋白上樣，10%SDS-PAGE進行蛋白分離，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，TBST洗滌1次，麗春紅染色后置于5%牛血清白蛋白封閉液中封閉1 h，加入I抗孵育4℃過夜，TBST洗滌3次后加入II抗孵育1 h，于暗室中曝光，β-actin作為內參照。

3 統計學處理

使用SPSS 17.0統計軟件分析數據，數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較分析用t檢驗或方差分析，以 P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 ZOL對U937細胞活力的抑制作用

CCK-8法檢測結果顯示，0.025 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L和1 mmol/L的ZOL對U937細胞活力在24 h即開始有抑制作用(P＜0.05)，隨著ZOL終濃度的升高和作用時間的延長，細胞活力受抑制越明顯，ZOL對U937生長的抑制呈時間劑量依賴性(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.ZOL inhibited the viability of U937 cells determined by CCK-8 assay.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 mmol/L.圖1 ZOL抑制U937細胞的活力

2 ZOL對U937細胞周期的影響

用PI法檢測ZOL對U937細胞周期的影響，如圖2所示，ZOL作用于U937 48 h后，與對照組相比，U937細胞在S期的細胞比例由38.82%±1.18% 增加至62.16%±1.34%，而G2-M期的比例相應減少，提示ZOL可以將細胞周期阻滯在S期。

Figure 2.ZOL induced S phase arrest in the cell cycle of the U937 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 mmol/L.圖2 ZOL將U937細胞周期阻滯在S期

3 ZOL誘導U937細胞的凋亡

Annexin V-PI染色觀察結果顯示，與對照組相比，0.2 mmol/L和0.4 mmol/L的ZOL作用于U937細胞24 h的凋亡率分別4.88%±0.04% 和5.41% ±0.11%，72 h的凋亡率分別為20.12% ±0.91% 和28.56%±1.49%，由此顯示，ZOL作用于U937細胞24 h時對細胞凋亡的誘導作用不明顯，當作用時間達到48 h和72 h，與對照組相比，ZOL對U937細胞均起到明顯誘導凋亡的作用(P＜0.05)。Hoechst 33342染色結果顯示0.2 mmol/L和0.4 mmol/L的ZOL處理了48 h的U937細胞，可以在顯微鏡下觀察到部分細胞核碎裂，計數100個細胞，凋亡率分別為17.13% ±0.86% 和29.78±1.23%，進一步證實ZOL可以誘導U937細胞凋亡，見圖3。

4 ZOL對細胞線粒體膜電位的影響

0.2 mmol/L和0.4 mmol/L終濃度的ZOL作用于U937細胞48 h后經JC-1熒光探針處理后，開始出現發出綠色熒光的細胞群，之后隨著藥物作用時間的延長或藥物作用終濃度的升高，發出綠色熒光的細胞群比例明顯增加，與對照組相比，差異有統計學顯著性(P＜0.05)。提示唑來膦酸誘導U937細胞的線粒體去極化，降低線粒體膜電位，見圖4。

5 ZOL抑制U937細胞克隆形成

甲基纖維素克隆形成實驗結果顯示經過7 d培養，未加藥組細胞可見到克隆形成率為83.00%± 3.30%，經0.2 mmol/L和0.4 mmol/L的ZOL處理過的細胞均未見到克隆形成，表明0.2 mmol/L的ZOL已經完全抑制了U937細胞的克隆形成能力(P＜0.05)，見圖5。

6 ZOL對p21、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

Western blot實驗結果顯示0.2 mmol/L和0.4 mmol/L終濃度的ZOL作用于U937細胞48 h后，與對照組相比，p21和Bax蛋白的表達增加，Bcl-2蛋白的表達下降，其中對p21的作用最明顯，且隨著藥物濃度增加而增強，見圖4。

討論

隨著分子靶向藥物的開發、化療方案的改革以及造血干細胞移植術的開展，急性髓系白血病的治療取得了巨大的進展，許多患者經過治療后可以達到長期無病生存，但仍有部分患者存在緩解后復發，對于疾病復發的患者，治療難度大，有效治療方法少，再次緩解率降低，是急性髓系白血病治療失敗的主要原因。近年來人們致力于新的分子靶向藥物的開發，希望能發現一類藥物與常規的化療藥物聯用，發揮更強的抗白血病效應，克服復發和耐藥的難題。

Figure 3.ZOL induced apoptosis in the U937 cells.A:the U937 cells treated ZOL were stained with Annexin V-PI and subjected to flow cytometry analysis;B:the U937 cells treated with different concentrations of ZOL for 48 h were stained with Hoechst 333342 and examined under a fluorescence microscope(×400).Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 mmol/L.圖3 ZOL誘導U937細胞凋亡

Figure 4.ZOL reduced mitochondrial membrane potential.The U937 cells treated with ZOL were assessed by monitoring JC-1.JC-1 accumulated in mitochondrial to form red fluorescent aggregate at high membrane potential.When the membrane potential decreased，green fluorescence JC-1 monomer formed in the cytosol.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 mmol/L.圖4 ZOL降低U937細胞線粒體膜電位

Figure 5.The effects of ZOL on the expression of apoptosis-related proteins and the colony formation capacity in the U937 cells.A: the protein expression was detected by Western blot;B:the U937 cells treated with ZOL at various concentrations were incubated in methylcellulose culture for 2 weeks and the colony formation capacity was completely suppressed.Mean±SD.n= 3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 mmol/L.圖5 ZOL對U937細胞內凋亡相關蛋白表達及克隆形成能力的影響

在多種人類的腫瘤中，ras發生突變并持續激活，導致腫瘤細胞惡性增殖和凋亡抑制，對該信號通路的研究有利于尋找相應靶向治療藥物，2005年Yoshitoshi Ohtsuka在Blood上闡述了ZOL可以在體外抑制ras信號持續激活的幼年型慢性粒單核細胞白血病細胞的增殖和分化，ZOL被證實亦可以減少多發性骨髓瘤患者骨骼相關并發癥、減輕腫瘤負荷，延長多發性骨髓瘤患者的生存時間、降低死亡率［10］。在慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)中，Chuah等［11］證實ZOL可以無視甲磺酸伊馬替尼的耐藥機制，和伊馬替尼聯用協同抑制CML細胞的增殖，誘導其凋亡。

p21是最早發現的cyclin依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)抑制劑，幾乎可以抑制全部的cyclin/CDK復合體的活性，被認為可以在細胞周期的多個環節起作用。本研究發現ZOL能明顯抑制U937細胞的活力，將細胞周期阻滯在S期，同時檢測到ZOL作用于U937后p21表達明顯增加，我們推測ZOL通過上調p21表達從而抑制cyclin/CDK復合體的活性將細胞周期阻滯在S期，與之前的報道一致。

涉及細胞凋亡的信號通路包括線粒體介導的凋亡通路和死亡受體介導的凋亡通路。在線粒體介導的凋亡通路中，外界刺激信號傳到線粒體上，通過凋亡相關蛋白Bcl-2家族進行調節，當Bax/Bcl-2比例增加的時候可以觸發線粒體外膜的滲透性發生改變，從而誘導細胞凋亡［12］。在我們研究中，Annexin V-PI和Hoechst 33342檢測結果均表明ZOL可以誘導U937細胞凋亡，這種作用在24 h時表現不明顯，隨著時間及劑量的增加，凋亡率逐漸增加，呈時間劑量依賴性，為了明確唑來膦酸的促凋亡作用機制，我們檢測了唑來膦酸作用于U937后的細胞膜電位變化情況，發現細胞膜電位的消失與凋亡率呈正相關，Western blot結果提示Bcl-2隨著藥物濃度的增加逐漸減少，Bax隨著藥物濃度的增加逐漸增加，進一步證實唑來膦酸通過改變Bax/Bcl-2比例進而影響細胞線粒體膜電位水平促進白血病細胞的凋亡。

本實驗初步證實ZOL可以抑制U937細胞活力并誘導其凋亡，主要是通過上調促凋亡因子及下調凋亡抑制因子進而影響線粒體膜電位水平來實現的。ZOL在臨床中用于治療多發性骨髓瘤或惡性腫瘤骨轉移導致的骨破壞，與常規化療藥物相比毒副作用少，此外，由于ZOL具有親骨髓性，臨床常規劑量注射ZOL后，ZOL可以迅速積聚到破骨細胞中，隨后釋放到骨髓，我們猜想，ZOL可以與一些常規的化療藥物聯用，對骨髓中的白血病細胞甚至治療后殘存的白血病殘留病灶起到較為徹底的清除作用，同時減低化療藥物引起的毒副作用，為臨床提供新的治療策略。

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(責任編輯:陳妙玲，羅 森)

Zoledronic acid inhibits proliferation and induces apoptosis in U937 cells

FAN Rui-fang1，LIU Ling-ling1，ZHANG Ling1，GUO Xiao-yan2，WANG Xiao-zhen1，LIN Dong-jun1

(1Department of Hematology，The Third Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China;2Department of Pediatrics，Guangdong Women and Children Hospital，Guangzhou 510010，China.E-mail:lindongjun0168 @163.com)

AIM:To study the antiproliferation and proapoptotic effects of zoledronic acid(ZOL)on human acute myeloid leukemia cell line U937.METHODS:The viability of U937 cells was detected by CCK-8 assay.The cell cycle of the U937 cells was analyzed by flow cytometry with PI staining.Apoptotic rate was assessed by flow cytometry with Annexin V-PI and Hoechst 33342 staining.Mitochondrial membrane potential was detected by JC-1 assay.Methylcellulose was used to assess colony formation.The protein levels of p21，Bcl-2 and Bax were determined by Western blot.RESULTS:ZOL inhibited the viability of U937 cells.ZOL induced S-phase cell cycle arrest in the U937 cells.The results of flow cytometry analysis with Annexin V-PI and Hoechst 33342 staining showed that ZOL also induced apoptosis in a doseand time-dependent manner.Mitochondrial membrane potential assay was also used to verify the apoptosis.The apoptotic rate was consistent with the reduction of mitochondrial membrane potential.Colony formation assay showed that ZOL significantly inhibited the colony formation capacity of the U937 cells.This was achieved by the induction of S-phase cell cycle arrest，and up-regulation of Bax and p21，and down-regulation of Bcl-2.CONCLUSION:ZOL inhibits cell proliferation by regulating the expression of cell cycle-related protein，and induces apoptosis via the mitochondrial apoptotic pathway.

Zoledronic acid;U937 cells;Cell cycle;Apoptosis

733.7;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.011

1000-4718(2016)07-1221-06

2016-01-21

2016-04-06

廣東省醫學科研基金資助項目(No.B2013134)

△Tel:020-85252227;E-mail:lindongjun0168@163.com