miR-193b在宮頸癌中的表達與功能及其對化療敏感性的影響*

杜文霞，姬 霞

(河南省中醫院婦產科，河南鄭州450002)

miR-193b在宮頸癌中的表達與功能及其對化療敏感性的影響*

杜文霞△，姬 霞

(河南省中醫院婦產科，河南鄭州450002)

目的:探討微小RNA-193b(miR-193b)在不同宮頸組織中的表達以及其對順鉑作用于宮頸癌細胞敏感性的影響，并初步探討其作用機制。方法:實時熒光定量PCR(qPCR)檢測不同宮頸組織中miR-193b的表達水平。采用脂質體將miR-193b-inhibitor轉染至HeLa細胞，Transwell法、CCK-8法和免疫蛋白印跡法分別檢測細胞遷移數、細胞對順鉑的敏感性以及細胞中PTEN、Akt、p-Akt和P-糖蛋白(P-gp)的蛋白水平。結果:qPCR結果顯示miR-193b在正常宮頸組織及宮頸糜爛組織中呈低表達，在宮頸上皮內瘤變和宮頸癌組織中的表達明顯上升;轉染miR-193b-inhibitor后，HeLa細胞遷移數明顯減少(P＜0.05)，順鉑對HeLa細胞活力的抑制作用進一步增強(P＜0.05)，細胞中PTEN的蛋白表達明顯上調(P＜0.05)，Akt的蛋白表達無明顯變化，p-Akt和P-gp的蛋白水平明顯下調(P＜0.05)。結論:miR-193b在宮頸癌組織中呈高表達，沉默miR-193b可增加HeLa細胞對順鉑的敏感性，作用機制可能與PTEN-PI3K/Akt通路有關。

微小RNA-193b;宮頸癌;HeLa細胞;順鉑

宮頸癌在全球范圍內發病率位于女性惡性腫瘤中第2位，85%以上的患者處于發展中國家［1］。中國每年宮頸癌的發病率占全球四分之一以上，一般為35歲以上婦女，但近年來有逐漸年輕化的趨勢［2］。目前公認的發病機理是高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染，已有2種治療宮頸癌的預防性疫苗上市，主要針對HPV-16和18亞型，但由于疫苗價格昂貴，針對性強而無法推廣［3］?；熓峭砥趯m頸癌治療的主要手段之一，但治療中產生的耐藥性對臨床的治療效果有嚴重的阻礙。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼、具調控功能的小分子單鏈RNA，長度為21～22個堿基對，主要參與生長發育、器官形成、細胞增殖與凋亡等許多生物學過程。近年研究發現其與腫瘤發生發展密切相關。隨著對miRNA與腫瘤的研究逐漸深入，已有報道指出miRNA可以影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［4］。miR-193b編碼基因位于人16pI3、12，是一種非編碼小分子 RNA。研究發現miR-193b通過抑制cyclin D1來抑制癌細胞增殖，且通過下調髄樣細胞白血病序列表達來調控黑色素瘤的發生［5］。

本研究通過檢測不同宮頸組織中miR-193b的表達，利用miR-193b-inhibitor轉染HeLa細胞后，觀察細胞對順鉑敏感性的變化，初步探討其機制。

材料和方法

1 材料

1.1 材料 HeLa細胞株購于上海細胞生物研究所;胎牛血清、DMEM培養基和Opti-MEM培養基購于Gibco;LipofectamineTM2000、TRIzol和qPCR引物購于 Invitrogen;質粒 pcDNA3.1-miR-193b-inhibitor和空載質粒pcDNA3.1購于上海吉瑪制藥技術有限公司;順鉑(diamminedichloroplatinum，DDP)購于齊魯制藥有限公司;人第10號染色體缺失的磷酸酶(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)、蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB/ Akt)、p-Akt、P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、β-actin抗體購于Santa Cruz;CCK-8溶液購于Dojindo;其它試劑均為分析純。

1.2 樣本收集 選取2010年1月～2014年12月河南省中醫院正常宮頸組織樣本30例，經病理鑒定為宮頸糜爛組織樣本40例，宮頸上皮內瘤變樣本38例，宮頸癌組織樣本54例，年齡為30～65歲。取得組織后立即置于－80℃液氮中冷凍保存。所有患者在收集樣本前未進行任何放射治療，化學治療，且所有樣本獲取時經過本院倫理委員會的同意。

2 方法

2.1 qPCR測定各宮頸組織中miR-193b的表達

取適量正常宮頸組織、宮頸糜爛組織、宮頸上皮內瘤變和宮頸癌組織，按照TRIzol說明書裂解細胞，使用氯仿提取總RNA，用紫外分光光度法測定RNA樣品的A260nm值，并進行定量。建立逆轉錄反應，miR-193b的上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’;內參照U6上游引物為5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’，下游引物為 5’-ATTCGCACTGGATACGACCAGACTC-3’。擴增條件為95℃5 min;94℃30 s、60℃30 s、72℃1 min，35個循環。采用2－ΔΔCt方法計算相對表達量。

2.2 細胞培養、分組與轉染 HeLa細胞株用含10%胎牛血清的DMEM液體培養基培養，置于5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養。設空白對照(control)組、脂質體組(Lipo組)、轉染空載質粒pcDNA3.1組(pcDNA3.1組)和轉染 miR-193b-inhibitor質粒組(miR-193b-inhibitor組)。取相應組別處于穩定對數生長期的細胞，消化后置于96孔板中，待細胞密度到達約為60%時，更換新鮮無血清培養基繼續培養12 h，將上述各組(空白對照組除外)分別溶解于Opti-MEM培養基中，加入LipofectamineTM2000，按說明書操作，進行轉染。

2.3 Transwell小室檢測細胞遷移能力 將處于對數生長期的各組細胞，計數后調整細胞濃度為0.5× 109/L，于Transwell小室的上室中加入100 μL細胞懸液，下室中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液。在5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養24 h，PBS洗2次，10%甲醛固定15 min，結晶紫染色30 min，于倒置顯微鏡下觀察、計數。

2.4 CCK-8法檢測轉染后HeLa細胞對DDP的敏感性 將處于對數生長期的各組細胞接種于96孔板，細胞貼壁后，分別加入DDP(0.01 μmol/L，0.1 μmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L)，空白對照組不加入DDP，繼而培養24 h后，或加入DDP 5 μmol/L，分別培養12 h、24 h、36 h、48 h后，棄去上清液，每孔加入CCK-8溶液10 μL，在5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養4 h，用酶標儀于450 nm處測量吸光度(A)值。

2.5 Western blot檢測相關蛋白表達 離心收集經相應處理的各組細胞，提取總蛋白并測定蛋白濃度，每泳道加入50 μg蛋白進行SDS-PAGE分離，電轉至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBS緩沖液封閉1 h，加入相應I抗，4℃過夜，再加入相應II抗，室溫1 h化學發光法顯色，成像掃描分析系統保存圖像并分析。

3 統計學處理

采用SPSS 15.0軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，方差齊性檢驗后做方差分析，用Bonferroni校正的t檢驗進行各組均數間兩兩比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 qPCR檢測各宮頸組織中miR-193b的表達水平

采用qPCR測定正常宮頸組織、宮頸糜爛組織、宮頸上皮內瘤變和宮頸癌組織中miR-193b的表達水平。結果表明正常宮頸組織和宮頸糜爛組織中miR-193b的表達水平很低，二者間差異無統計學顯著性;宮頸上皮內瘤變和宮頸癌組織中miR-193b的表達水平顯著高于正常宮頸組織和宮頸糜爛組織，且二者的表達呈上升趨勢，見圖1。

Figure 1.miR-193b expression in various cervical tissues.1: normal cervical tissues(n=30);2:cervical erosion tissues(n=40);3:cervical intraepithelial neoplasia tissues(n=38);4:cervical cancer tissues(n= 54).Mean±SD.*P＜0.05 vs normal cervical tissues.圖1 各宮頸組織中miR-193b的表達水平

2 miR-193b-inhibitor抑制HeLa細胞的遷移能力

Transwell法檢測下調miR-193b對HeLa細胞的遷移能力的影響，結果顯示轉染miR-193b-inhibitor后，細胞遷移數顯著低于control組(P＜0.05)，pcDNA3.1組、Lipo組和control組之間差異無統計學顯著性，見圖2。

3 miR-193b-inhibitor增強HeLa細胞對DDP的敏感性

分別給予不同濃度(0.01～10 μmol/L)DDP培養24 h，細胞活力被顯著抑制，并隨DDP濃度增大而抑制作用增強，與0.01 μmol/L濃度組相比差異有統計學顯著性(P＜0.05);另外，給予5 μmol/L DDP分別與細胞培養12 h、24 h、36 h、48 h后，細胞活力同樣被顯著抑制，并隨DDP培養時間增加而增強，與12 h組相比差異有統計學顯著性(P＜0.05)。轉染了miR-193b-inhibitor則可進一步增強DDP對HeLa細胞活力的抑制作用，與相應control組相比差異具有統計學顯著性。提示沉默miR-193b增強HeLa細胞對DDP的敏感性。見表1、2。

Figure 2.The effect of miR-193b-inhibitor on the migration of HeLa cells(×200).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖2 下調miR-193b對HeLa細胞遷移率的影響

表1 沉默miR-193b增強HeLa細胞對不同濃度DDP的敏感性Table 1.miR-193b-inhibitor augmented the sensitivity of HeLa cells to DDP at different concentrations(Mean±SD.n=3)

表2 沉默miR-193b DDP處理不同時間的HeLa細胞的敏感性的影響Table 2.Eeffect of miR-193b-inhibitor on the sensitivity of HeLa cells to DDP for different time(Mean±SD.n=3)

4 下調miR-193b對HeLa細胞中PTEN、Akt、p-Akt和P-gp蛋白水平的影響

轉染miR-193b-inhibitor后，進一步通過Western blot檢測PTEN、Akt、p-Akt和P-gp的蛋白水平，結果顯示PTEN的蛋白表達明顯上調(P＜0.05)，Akt的蛋白水平沒有變化，p-Akt和P-gp的蛋白水平明顯下調(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects of miR-193b-inhibitor on the protein levels of PTEN，Akt，p-Akt and P-gp of HeLa cells.Mean ±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group.圖3 沉默miR-193b對HeLa細胞PTEN、Akt、p-Akt和P-gp蛋白水平的影響

討論

多項研究發現，在宮頸癌細胞中，微小RNA的表達異常與癌變的進展及細胞的耐藥性有關。劉琳等［6］發現在宮頸癌組織和HeLa細胞中，miR-21呈高表達，促進腫瘤增殖，miR-143和miR-373呈低表達，起抑癌基因的作用。劉穎等［7］研究發現miR-193b在子宮內膜癌HEC-1A細胞中表達明顯增高。我們研究發現miR-193b在宮頸癌組織中呈高表達，而在正常組織和宮頸糜爛組織中呈低表達，表明miR-193b在宮頸癌變中具有特異性。下調 miR-193b后子宮內膜癌細胞侵襲能力下降。體外研究發現HNscc的FaDu細胞系敲除miR-193b可以導致癌細胞增殖、遷徙和侵襲能力降低，同樣體內實驗中敲除miR-193b亦可抑制腫瘤細胞的形成［8］。本實驗中Transwell染色法結果表明沉默miR-193b后，HeLa細胞的遷移細胞數明顯減少，提示miR-193b與宮頸癌細胞的遷移細胞數呈正相關。

順鉑是目前化療中最常用的藥物之一，化療藥物治療可為患者最大程度地保留卵巢和子宮陰道，但由于腫瘤細胞存在耐藥性，治療效果欠佳。我們發現，轉染miR-193b-inhibitor后可增強順鉑對HeLa細胞的抑制作用。PTEN在多種腫瘤細胞中的常常呈異常表達狀態，PTEN蛋白是PI3K/Akt信號途徑的負性調節因子，使PI3K的3-磷酸化位點去磷酸化［9］。PI3K/Akt信號途徑在細胞的增殖、衰老、凋亡等生命活動中起重要作用［10］。P-gp是由多藥耐藥基因編碼的跨膜蛋白，與腫瘤對化療的敏感性密切相關。已有研究證明在前列腺癌細胞中，PI3K/Akt信號通路途徑激活后，P-gp的蛋白表達增加［11］。Western blot檢測結果發現，HeLa細胞中PTEN的蛋白表達明顯上調，Akt的蛋白表達沒有變化，p-Akt和P-gp的蛋白水平明顯下調，提示PTEN激活后，使PI3K/Akt信號通路途徑的活性受到抑制，進而抑制了p-Akt和P-gp的蛋白水平，提高了HeLa細胞對順鉑的敏感性。

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(責任編輯:陳妙玲，余小慧)

Expression and significance of miR-193b in cervical cancer

DU Wen-xia，JI Xia

(Department of Obstetrics and Gynecology，Henan Province Hospital of TCM，Zhengzhou 450002，China.E-mail:hnduwenxia@163.com)

AIM:To investigate the expression of microRNA-193b(miR-193b)in the cervical tissues，and further to explore the effect of silencing miR-193b on diamminedichloroplatinum(DDP)-treated HeLa cell viability.METHODS:The expression levels of miR-193b in different cervical tissues were examined by qPCR.After transfection of miR-193b-inhibitor，the cell migration was determined by Transwell assay，the sensitivity of HeLa cells to DDP was measured by MTT assay，the protein levels of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten(PTEN)，protein kinase B (Akt)，p-Akt and p-glycoprotein(P-gp)were determined by Western blot.RESULTS:The mRNA level of miR-193b was significantly increased in the cervical cancer tissues compared with normal cervical tissues(P＜0.05).Knockdown of miR-193b obviously inhibited migration and enhanced sensitivity to DDP of HeLa cells(P＜0.05).Additionally，after transfection of miR-193b-inhibitor，the expression of PTEN was increased，whereas the protein levels of p-Akt and P-gp were decreased(P＜0.05).CONCLUSION:miR-193b is highly expressed in the cervical cancer tissues.Inhibition of miR-193b augments the sensitivity to DDP of HeLa cells，at least in part，through PTEN-PI3K/Akt signaling pathway.

MicroRNA-193b;Cervical cancer;HeLa cells;Diamminedichloroplatinum

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.014

1000-4718(2016)07-1241-05

2015-11-24

2016-03-01

河南省中醫藥管理局科研課題(No.2014ZY02013)

△Tel:0371-60908722;E-mail:hnduwenxia@163.com