SREBP-2沉默抑制衣霉素誘導的軟骨細胞內質網應激

謝 靜， 史棟梁， 郭會卿

(河南省中醫院風濕骨病科，河南鄭州450002)

SREBP-2沉默抑制衣霉素誘導的軟骨細胞內質網應激

謝 靜， 史棟梁， 郭會卿△

(河南省中醫院風濕骨病科，河南鄭州450002)

目的:探究固醇調節元件結合蛋白2(SREBP-2)對衣霉素誘導的軟骨細胞內質網應激(ERS)的影響。方法:分離人正常軟骨細胞和骨關節炎(OA)軟骨細胞培養，衣霉素和SREBP-2 siRNA分別處理正常軟骨細胞。24 h后，實時熒光定量PCR檢測對微小RNA-185(miR-185)表達的影響，流式細胞術檢測對細胞凋亡的影響，Western blot法檢測對SREBP-2、CHOP、p-eIF2α和ATF4等ERS相關蛋白，Bcl-2、Bax和caspase-3等凋亡相關蛋白水平的影響;caspase-3活性試劑盒檢測對細胞caspase-3活性的影響。結果:與對照組相比，OA組和衣霉素組SREBP-2表達增加，miR-185表達降低(P＜0.05)。SREBP-2 siRNA轉染可明顯阻斷衣霉素引起的miR-185降低(P＜0.05)。miR-185過表達能夠下調SREBP-2蛋白水平(P＜0.05)。與對照組相比，OA組和衣霉素組CHOP、peIF2α和ATF4的蛋白水平明顯上調，Bcl-2表達下調，Bax和caspase-3表達增加(P＜0.05);SREBP-2沉默處理則顯著逆轉上述蛋白表達(P＜0.05)。細胞凋亡率與上述細胞凋亡相關蛋白的變化趨勢一致(P＜0.05)。與衣霉素組相比，SREBP-2 siRNA轉染明顯下調caspase-3活性，miR-185抑制則明顯逆轉上述作用(P＜0.05)。結論: SREBP-2沉默可通過上調miR-185抑制衣霉素誘導的軟骨細胞ERS和細胞凋亡。

固醇調節元件結合蛋白2;衣霉素;內質網應激;軟骨細胞;微小RNA-185

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種常見的以關節軟骨退行性病變和繼發性骨質增生為特征，并伴隨關節周圍滑膜炎癥的慢性關節疾病。研究表明，軟骨細胞凋亡為軟骨退變的主要誘因和分子生物學基礎。其中，氧化損傷、炎癥損傷、免疫功能失衡等病理機制在該病發生發展過程中扮演著重要角色。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是由各種刺激引起的亞細胞器病理狀態，因內質網腔內錯誤折疊蛋白積聚而產生的一種適應性反應。文獻顯示，衣霉素(tunicamycin，Tuni)處理的軟骨細胞可作為研究OA疾病發展的細胞模型［1］，衣霉素通過引起ERS導致軟骨細胞凋亡［2］。因此，可通過阻斷ERS，減少軟骨細胞凋亡，進而降低OA患者的軟骨缺失，最終防治OA發生與發展。

最新研究表明，OA可能是一種代謝類疾?。?］。固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory elementbinding proteins，SREBPs)是調節脂類代謝的轉錄因子，在膽固醇穩態平衡中發揮關鍵作用［2］。有報道SREBP-2與OA病理過程相關［4］。因此，本實驗旨在探究SREBP-2對衣霉素誘導的軟骨細胞ERS和細胞凋亡的影響以及相關機制。

材料和方法

1 材料與試劑

衣霉素(Sigma);Lipofectamine 2000、胰酶(Invitrogen);胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、DMEM/F12培養基(Gibco);微小 RNA-185(micro-RNA-185，miR-185)熒光定量PCR檢測試劑盒(Gene Copia);BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo);6孔板(Corning);ECL、caspase-3活性檢測試劑盒、HRP標記的山羊抗鼠II抗和山羊抗兔II抗(碧云天生物技術研究所);anti-miR-185 mimics和scrambled mimics(銳博生物公司);靶向人SREBP-2 siRNA、scrambled siRNA以及兔多抗Bcl-2、Bax、β-actin、ATF4和CHOP (Santa Cruz);兔多抗caspase-3(Upstate);兔單抗peIF2α(CST);0.2%Ⅱ型膠原酶(Millipore);其它試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 軟骨細胞的分離、培養和傳代 正常軟骨細胞和OA軟骨細胞分別來自河南中醫學院第二附屬醫院創傷截肢患者和OA行膝關節置換術患者，此過程均得到河南中醫學院倫理委員會批準和患者完全知情同意。術中無菌條件下削取足量關節面軟骨，移至無血清DMEM/F12培養基，冰上保存。去除多余組織，切成小顆粒，PBS洗滌后，加入0.25%胰蛋白酶液，37℃搖床中放置30 min。棄酶液，PBS洗3次。加入0.2%Ⅱ型膠原酶溶液，37℃搖床中放置4 h。120目篩網過濾，收集懸液。1 000 r/min離心7 min，PBS洗3次后，用含10%FBS的完全培養基重懸，在37℃、5%CO2條件下培養，隔天換液，保持培養條件穩定。

2.2 細胞分組處理及轉染 將培養軟骨細胞分為OA軟骨細胞組、正常軟骨細胞組、衣霉素組、SREBP-2 siRNA組和衣霉素+SREBP-2 siRNA組。將軟骨細胞按每孔4×105接種6孔板，按照Lipofectamine 2000說明書，分別將 50 nmol/L SREBP-2 siRNA、scrambled siRNA、anti-miR-185 mimics和 scrambled mimics轉染正常軟骨細胞。48 h后，進行實驗處理。各組細胞用相應處理的培養基孵育時間一致。無水乙醇配制衣霉素儲液，實驗前用含0.5%FBS培養基稀釋至0.5 mg/L。

2.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞miR-185的表達 將軟骨細胞或者轉染后軟骨細胞按每孔4×105個接種6孔板，過夜后無血清處理。12 h后，向各組分別加相應處理的培養液。miR-185表達的檢測嚴格按microRNA檢測試劑盒說明書進行。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 將軟骨細胞或者轉染后軟骨細胞按每孔4×105個的密度接種6孔板，過夜后無血清處理。12 h后，向各組分別加相應處理的培養液。作用24 h后收集細胞，預冷PBS洗滌，加入預冷75%乙醇，4℃固定4 h以上。離心棄上清，PBS洗滌后，加入500 μL binding buffer懸浮細胞。加入5 μL Annexin V-EGFP混勻后，再加入5 μL PI，混勻。室溫、避光、反應5～15 min。1 h內，上機流式細胞儀檢測分析。

2.5 Western blot檢測細胞相關蛋白表達 將軟骨細胞或者轉染后軟骨細胞按每孔4×105接種6孔板，過夜后無血清處理。12 h后，向各組分別加相應處理的培養液。作用24 h后收集細胞，加RIPA裂解液，提取細胞全蛋白。經BCA定量、上樣、SDSPAGE分離、轉膜、封閉、I抗孵育、II抗孵育和ECL顯影等步驟，檢測各組細胞相關蛋白表達。

2.6 Caspase-3活性的檢測 獲取細胞裂解液，置于冰上，按試劑盒說明進行操作，使用酶標儀在405 nm處測定caspase-3的活性。

3 統計學處理

實驗數據采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，各組均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 SREBP-2和miR-185在軟骨細胞中的表達

通過酶兩步消化法成功獲得原代人正常軟骨細胞和OA軟骨細胞。與正常軟骨細胞對照組相比，OA組和衣霉素組SREBP-2蛋白表達顯著增加，miR-185水平顯著降低(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of SREBP-2 and miR-185 in the normal chondrocytes and OA chondrocytes.Tuni:tunicamycin.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs OA group;#P＜0.05 vs control group.圖1 SREBP-2和miR-185在正常軟骨細胞和OA軟骨細胞中的表達

2 衣霉素處理下SREBP-2和miR-185表達相互調節

SREBP-2 siRNA轉染正常軟骨細胞可顯著降低SREBP-2蛋白表達，上調miR-185水平(P＜0.05)。與正常軟骨細胞對照組相比，OA組和衣霉素組miR-185水平降低，SREBP-2蛋白水平增加，SREBP-2 siRNA轉染則明顯上調miR-185水平(P＜0.05)，miR-185過表達則下調衣霉素誘導的SREBP-2蛋白水平(P＜0.05)?？梢?，衣霉素處理下，SREBP-2和miR-185表達相互影響，相互調節，見圖2。

Figure 2.SREBP-2 and miR-185 expression interacted with each other in the normal chondrocytes with tunicamycin(Tuni)treatment.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs OA group;#P＜0.05 vs control group.圖2 衣霉素處理下正常軟骨細胞SREBP-2和miR-185表達相互影響

3 SREBP-2沉默抑制衣霉素誘導的ERS

Western blot結果顯示，與正常軟骨細胞對照組相比，OA組和衣霉素組CHOP、p-eIF2α和ATF4蛋白表達顯著增加，SREBP-2沉默則作用相反。而且SREBP-2沉默顯著下調衣霉素誘導的ERS相關蛋白表達(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects of tunicamycin(Tuni)and SREBP-2 silencing on ERS in the normal chondrocytes.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs OA group;#P＜0.05 vs control group.圖3 衣霉素和SREBP-2沉默處理對正常軟骨細胞ERS的影響

4 SREBP-2沉默抑制衣霉素誘導的細胞凋亡

Western blot結果顯示，與正常軟骨細胞對照組相比，OA組和衣霉素組Bax和caspase-3蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著減少(P＜0.05); SREBP-2沉默組則作用相反。而且SREBP-2沉默處理可顯著抑制衣霉素引起的細胞凋亡(P＜0.05)。流式細胞術結果顯示，細胞凋亡率與上述細胞凋亡相關蛋白表達趨勢一致(P＜0.05)，見圖4。

5 抑制miR-185表達可阻斷SREBP-2沉默引起的軟骨細胞caspase-3活性降低

與正常軟骨細胞對照組相比，OA組和衣霉素組細胞相對caspase-3活性明顯升高。而SREBP-2 si RNA轉染明顯下調衣霉素引起的細胞相對caspase-3活性升高，miR-185抑制則阻斷SREBP-2沉默引起的軟骨細胞caspase-3活性降低(P＜0.05)，見圖5。

討論

OA是一種衰老性疾病，是老年人關節疼痛和致殘的主要原因。該病最早最主要的病理變化是由關節軟骨起始，影響包括軟骨下骨、滑膜、關節囊、肌腱韌帶及周圍肌肉組織在內的整個關節結構，導致關節軟骨全部脫失，最終關節畸形和功能喪失。若OA患者能早期確診并進行干預，可避免關節結構和功能進一步惡化，降低中晚期OA發生率和致殘率。因此，尋找新的OA分子標記將有助于OA的早期診斷、治療和發病機制的研究。

軟骨細胞是關節軟骨中惟一細胞類型，在維持正常軟骨代謝中具有關鍵作用。軟骨細胞凋亡引起的細胞數目減少是OA最主要的病理表現之一，進而導致OA發生。細胞凋亡主要通過死亡受體途徑、線粒體途徑、內質網途徑等3種信號通路發生。適度ERS具有細胞保護作用，過高和持久的ERS則可通過誘導ERS相關蛋白表達和激活相關信號通路，導致細胞凋亡。研究發現，ERS引起的軟骨細胞凋亡促進關節軟骨退化［2］。SREBP-2在OA軟骨細胞中高表達，與OA病理過程密切相關［4］。miR-185在多種癌組織中低表達［5］，miR-185下調可作為人軟骨肉瘤診斷和預后的潛在生物標記［6］，而且miR-185可抑制衣霉素誘導的ERS［7］。本研究表明，與人正常軟骨細胞相比，OA對照組和衣霉素組SREBP-2表達增加，miR-185降低;SREBP-2沉默可顯著上調衣霉素引起的miR-185降低。

SREBPs是與固醇調節元件DNA序列結合的轉錄因子，能激活膽固醇代謝和生物合成基因［8］，促進低密度脂蛋白攝取［9］。研究發現，SREBP-2通過與Smad3相互作用，參與調控關節軟骨主要結構成分的形成［10］。ERS可誘導SREBP-2激活和細胞凋亡，引發腎臟近曲小管細胞損傷［11］。此外，miR-185具有心肌保護作用，能抑制ERS誘導的心肌細胞凋亡［7］。文獻進一步表明，miR-185可通過調控肝細胞中SREBP-2及相關聯基因的表達和活性，維持膽固醇穩態，且SREBP-2的調節作用依賴于miR-185表達，SREBP-1c能通過膽固醇反應反饋回路調節miR-185表達［9］。miR-185能通過下調 SREBP-1和SREBP-2及其靶基因表達，調控前列腺癌細胞中脂肪生成和膽固醇產生，引發caspase依賴性的細胞凋亡，抑制腫瘤進程［12］。本研究亦發現，OA組和衣霉素處理組軟骨細胞CHOP、p-eIF2α和ATF4上調，Bcl-2表達下調，Bax和caspase-3表達明顯增加，miR-185水平下調;SREBP-2沉默則顯著抑制衣霉素引起的ERS升高和凋亡增加，并上調miR-185水平。而且，miR-185過表達下調衣霉素引起的SREBP-2增加，miR-185抑制則阻斷SREBP-2沉默引起的軟骨細胞 caspase-3活性降低。可見，SREBP-2和miR-185之間相互影響，相互調節，在衣霉素誘導的軟骨細胞ERS和細胞凋亡過程中共同發揮著重要作用。

Figure 4.The effects of tunicamycin(Tuni)and SREBP-2 silencing on the apoptosis of the normal chondrocytes.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs OA group;#P＜0.05 vs control group.圖4 衣霉素和SREBP-2沉默處理對正常軟骨細胞細胞凋亡的影響

Figure 5.The effects of tunicamycin(Tuni)，SREBP-2 silencing and miR-185 inhibition on caspase-3 activity in the normal chondrocytes.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs OA group;#P＜0.05 vs control group.圖5 衣霉素、SREBP-2沉默和miR-185抑制處理對正常軟骨細胞caspase-3活性的影響

綜上所述，本實驗初步探究發現SREBP-2沉默可通過上調miR-185抑制衣霉素誘導的軟骨細胞內質網應激和細胞凋亡。但是SREBP-2沉默在軟骨細胞凋亡中的作用以及調控OA進程的分子機制仍需進一步研究。SREBP-2有望成為針對OA疾病的分子作用靶點，亦為其它衰老相關性疾病的預防和治療提供新思路。

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(責任編輯:陳妙玲，羅 森)

Effect of SREBP-2 silencing on tunicamycin-induced endoplasmic reticulum stress in chondrocytes

XIE Jing，SHI Dong-liang，GUO Hui-qing

(Department of Rheumatism Bone Disease，Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450002，China.E-mail:qujining@yeah.net)

AIM:To explore the effect of sterol regulatory element-binding protein 2(SREBP-2)on tunicamycin-induced endoplasmic reticulum stress(ERS)in chondrocytes.METHODS:After isolation of human normal chondrocytes and osteoarthritis(OA)chondrocytes，the normal cells were cultured and treated with tunicamycin and SREBP-2 siRNA.After 24 h treatment，fluorescent quantitative RT-PCR(RT-qPCR)was applied to quantify microRNA-185(miR-185)levels.The cell apoptotic rate was determined by flow cytometry.The expression of SREBP-2 and ERS-related proteins，C/EBP homologous protein(CHOP)，phosphorylated eukaryotic initiation factor-2 α(p-eIF2α)and activating transcription factor 4(ATF4)，and the expression of apoptosis-related proteins，Bcl-2，Bax and caspase-3，were determined by Western blot.The caspase-3 activity kit was used to determine the caspase-3 activity.RESULTS:Compared with human normal chondrocytes，both SREBP-2 up-regulation and miR-185 down-regulation were observed in OA chondrocytes (P＜0.05).SREBP-2 siRNA transfection enhanced tunicamycin-inhibited miR-185 level(P＜0.05).miR-185 overexpression reduced tunicamycin-induced SREBP-2 expression(P＜0.05).OA control group and tunicamycin treatment group consistently resulted in ERS and cell apoptosis with concomitant enhancement of CHOP，p-eIF2α and ATF4 proteins，increases in Bax and caspase-3 proteins，and reduction of Bcl-2(P＜0.05).However，SREBP-2 silencing significantly reversed these effects(P＜0.05).The apoptotic rates were consistent with the expression tendency of apoptosis-related proteins(P＜0.05).SREBP-2 siRNA transfection markedly down-regulated tunicamycin-induced caspase-3 activity，which was notably blocked by miR-185 inhibition(P＜0.05).CONCLUSION:SREBP-2 silencing may inhibit tunicamycin-induced ERS and cell apoptosis via up-regulating miR-185 expression.

Sterol regulatory element-binding protein 2;Tunicamycin;Endoplasmic reticulum stress;Chondrocytes;MicroRNA-185

R684.3;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.022

1000-4718(2016)07-1291-06

2016-01-28

2016-05-10

△Tel:0371-60979803;E-mail:qujining@yeah.net