亞甲藍對百草枯中毒大鼠胸腺T淋巴細胞亞群與氧化應激的影響*

杜 斌， 陳俊良， 唐篩娣， 陳 煒， 龐慶豐

(江南大學無錫醫學院，江蘇無錫214122)

［文章編號］ 1000-4718(2016)07-1307-05

·短篇論著·

亞甲藍對百草枯中毒大鼠胸腺T淋巴細胞亞群與氧化應激的影響*

杜 斌， 陳俊良， 唐篩娣， 陳 煒， 龐慶豐△

(江南大學無錫醫學院，江蘇無錫214122)

［文章編號］ 1000-4718
(2016)07-1307-05

目的:研究亞甲藍(methylene blue，MB)對百草枯(paraquat，PQ)中毒大鼠胸腺T淋巴細胞亞群免疫功能與氧化應激的影響。方法:選取Wistar雄性大鼠40只，隨機分為正常組、模型組、MB低劑量(2 mg·kg－1· d－1)組和MB高劑量(4 mg·kg－1·d－1)組。72 h后HE染色法觀察胸腺組織形態，比色法測定各組胸腺組織SOD活性及MDA含量，免疫組化試劑盒檢測Bcl-2和Bax和CD4及CD8的表達。結果:MB組胸腺皮、髓質分界清楚，胸腺細胞MDA含量減少，SOD活性增加，抗氧化能力提高，Bcl-2和Bax表達量下調、Bcl-2/Bax的比值增加，CD4陽性表達提高。結論:MB能夠改善PQ對胸腺細胞的氧化損傷，調節胸腺T淋巴細胞亞群在皮質和髓質區的分布，從而緩解機體持續性損傷。

亞甲藍;百草枯中毒;氧化應激;T淋巴細胞亞群

百草枯(paraquat，PQ)為聯吡啶類滅生性除草劑，其致死率極高［1］。PQ中毒可引起多臟器的損害，其中以氧化損傷、線粒體功能障礙、炎細胞活化、蛋白酶失衡等為主［2-3］。亞甲藍(methylene blue，MB)成本低廉，簡便易得，安全范圍寬且副作用小，在危重病治療中可作為抗氧化劑應用［4］。

目前本實驗室已證實MB能減輕PQ中毒引起的急性肺損傷［5］。因此，本實驗著重研究MB對PQ大鼠中毒氧化應激損傷與T淋巴細胞亞群免疫功能之間的關系及影響，為進一步闡明亞甲藍對百草枯大鼠中毒免疫調節作用的機制提供實驗證據。

材料和方法

1 試劑和儀器

亞甲藍(蘇州濟川制藥有限公司);百草枯(上海惠豐生物農藥有限公司);兔IgG-免疫組化試劑盒SABC即用型、兔抗Bcl-2抗體和兔抗Bax抗體(博士德公司);免疫組化染色試劑盒和兔抗CD4抗體(北京博奧森生物技術有限公司);兔抗CD8抗體、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和考馬斯亮蘭蛋白試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。RM2135石蠟切片機(Lecia);80i正置熒光顯微鏡(Nikon);U410超低溫冰箱、5804R多功能臺式離心機(Eppendorf); TG16A-WS臺式離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司);TS-8型漩渦混勻器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司);DK-8B型電熱恒溫水浴槽(上海精宏實驗設備有限公司);ME204E電子天平(METTLER TOLEDO)。

2 方法

2.1 實驗設計 SD雄性大鼠40只，體質量250～280 g，購自浙江大學實驗動物中心，許可證號為SCXK(浙)2014-0001。自由飲水，標準飼料。隨機分為正常組、模型組、MB低劑量(2 mg·kg－1·d－1)組和MB高劑量(4 mg·kg－1·d－1)組。每組10只。自造模之日起，除正常組外，其余各組一次染毒灌胃百草枯35 mg/kg［6］。造模2 h起，正常組、模型組灌胃生理鹽水，其它各組MB灌胃給藥，每日1次。72 h后取大鼠胸腺，胸腺左葉于－70℃冷凍保存，待檢測。胸腺右葉固定于10%甲醛溶液中，待組織病理學檢查。

2.2 胸腺組織學觀察 取胸腺右葉組織放入10%甲醛溶液中固定，常規HE染色，顯微鏡下觀察。

2.3 氧化損傷指標的測定 取胸腺左葉組織，用冰鹽水漂洗，剔除脂肪及結締組織，吸水紙吸干，稱重，放入10 mL離心管中;加入適量的冷生理鹽水，2 000 min/r勻漿10 s，間歇30 s，反復3次制成10%的組織勻漿;使用冷凍離心機，4℃、3 500 min/r離心10 min，取上清液測定胸腺組織中SOD的活性和MDA的含量。各指標測定按照試劑盒說明書進行操作。

2.4 SABC免疫組化試劑盒檢測Bcl-2和Bax表達陽性細胞 常規脫蠟至水，根據SABC免疫組化試劑盒說明，電爐煮沸法進行抗原修復，3%H2O2滅活內源性酶，切片于0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)，滴加正常山羊血清封閉液(50 μL)、Bcl-2或Bax抗體、生物素化山羊抗小鼠抗體(50 μL)及SABC(50 μL)，DAB顯色劑，光鏡下控制顯色時間，待細胞核呈棕黃色時，終止反應;再用蘇木精復染，逆梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.5 Bcl-2及Bax陽性細胞表達計分標準［7］每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)，根據著色程度及著色細胞陽性范圍進行計算，著色程度以不著色者為0分，著色淡者為1分，中等著色為2分，著色深者為3。著色細胞陽性范圍以無著色為0分，著色陽性細胞小于1/3為1分，著色陽性細胞1/3～1/2為2分，著色陽性細胞大于1/2為3分;將每張切片著色程度與著色細胞陽性范圍得分各自相加為其最后計分。

2.6 免疫組化SP法檢測CD4和CD8表達陽性細胞 處死大鼠時胸腺標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，厚4 μm，連續切片，每例標本分別標記CD4、CD8抗體(稀釋度均為1∶200)，DAB顯色，光鏡下觀察細胞著色情況，CD4+和CD8+均為細胞膜染棕黃色。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件中的one-way ANOVA方法對實驗數據進行組間差異顯著性檢驗，組間兩兩比較采用SNK-q法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 胸腺組織的病理觀察

正常組胸腺皮、髓質分界清楚，細胞分布于皮質，淋巴細胞較密集，核呈紫藍色，胞漿較少，為淡紅色;髓質部網狀細胞染色較淺。模型組胸腺皮質區淋巴細胞呈松散狀分布，細胞間隙增寬;皮、髓質分界較模糊，網狀細胞減少。MB低、高劑量組胸腺皮髓質分界明顯，皮質增厚，淋巴細胞密集，細胞結構清晰，形態規則，見圖1。

Figure 1.Observation of thymus pathology in each group (×200).圖1 各組大鼠胸腺的病理觀察

2 胸腺組織SOD活性和MDA含量的變化

與正常組比較，模型組大鼠胸腺組織的SOD含量顯著下降(P＜0.05)，MDA含量顯著升高(P＜0.05);與模型組比較，MB低劑量組、高劑量組大鼠胸腺組織的SOD活性均明顯升高(P＜0.05)，MDA含量明顯下降(P＜0.05);MB低劑量組與高劑量組間比較差異無統計學顯著性，見表1。

3 大鼠胸腺組織Bcl-2和Bax的表達

Bcl-2與Bax陽性結果呈棕黃色，主要分布于胞膜及胞質內，深淺不均。與正常組相比，模型組胸腺淋巴細胞Bax和Bcl-2蛋白表達量有所增加，差異有統計學顯著性(P＜0.05);與模型組相比，MB低劑量組和高劑量組胸腺淋巴細胞Bax和Bcl-2蛋白表達量明顯減少，Bcl-2/Bax比值明顯升高(P＜0.05)，差異有統計學顯著性，MB低劑量組與高劑量組之間比較差異無統計學顯著性(P＞0.05)，見圖2、表2。

表1 MB對PQ中毒大鼠胸腺組織的SOD活性和MDA含量變化的影響Table 1.The effects of methylene blue(MB)on SOD and MDA in the rat thymus with paraquat poisoning(Mean±SD.n=10)

Figure 2.The expression of Bcl-2 and Bax in the thymus tissue of each group(immunohistochemistry，×200).圖2 各組大鼠胸腺Bcl-2和Bax表達的改變

表2 MB對PQ中毒大鼠胸腺組織Bcl-2和Bax表達的影響Table 2.The effects of methylene blue(MB)on Bcl-2 and Bax of thymus in rats with paraquat poisoning(Mean±SD.n=10)

4 大鼠胸腺組織CD4和CD8的表達

CD4和CD8陽性結果呈棕黃色，主要分布于胞膜，深淺不均。正常組胸腺有明顯的皮質和髓質分界，皮質、髓質區以不同發育階段的淋巴細胞為主，皮質區CD4和CD8陽性表達低于髓質區。模型組胸腺皮質和髓質分界不清，CD4和CD8陽性表達較少，且皮質、髓質區陽性表達無變化。與模型組比較，MB低、高劑量組CD4陽性表達明顯，CD8陽性表達較少，見圖3。

Figure 3.The expression of CD4 and CD8 in the thymus tissue of each group(immunohistochemistry，×200).圖3 各組大鼠胸腺CD4和CD8表達的改變

討論

胸腺是重要的中樞免疫器官之一，是T淋巴細胞分化的重要場所。因此胸腺結構的衰退和功能下降勢必會影響機體的體液、細胞免疫功能，導致機體免疫功能失調［8］。胸腺皮、髓質分界是否明顯，皮質是否增厚，淋巴細胞密集程度等形態學結構能間接反映胸腺功能水平。本實驗中，MB低、高劑量組胸腺皮、髓質分界清楚，未見其它明顯變化。因此，MB對胸腺功能有一定的保護作用。

在PQ中毒后，機體出現持續性氧化損傷，消耗大量SOD，同時機體氧自由基產生過多，從而使MDA含量增高，SOD活性下降［9］。研究表明通過增加SOD活性，降低MDA水平，可以判斷PQ中毒后早期炎癥損害有所減輕［10］。本實驗中，MB通過減少胸腺細胞MDA水平，增加SOD活性，從而減少PQ對機體早期造成的持續性氧化損傷。

PQ對機體造成的持續性氧化損傷，胸腺出現凋亡時，可能對機體免疫細胞造成一定損傷。關于Bcl-2和Bax參與機體細胞凋亡的機制可能與通過調節抗氧化系統阻止細胞凋亡發生有關［11］。Bcl-2 和Bax作為凋亡相關蛋白，兩者的作用是相互拮抗的，Bcl-2/Bax比值似乎較Bcl-2表達對抑制凋亡更有意義［12］。MB在PQ中毒大鼠模型中可減輕胸腺細胞持續凋亡，其作用機制與下調Bcl-2和Bax表達量、增加Bcl-2/Bax的比值有關。

T淋巴細胞是機體重要的免疫細胞，不同淋巴細胞亞群的數量發生異常時，可引起機體細胞免疫功能紊亂［13］。正常胸腺的皮質、髓質區CD4和CD8陽性表達分布不同，皮質區CD4和CD8陽性表達低于髓質區。MB低、高劑量組CD4陽性表達有差異，CD8陽性表達無差異。因此，MB可能使CD4/CD8比值出現增高，可緩解機體的免疫抑制狀態，調節機體免疫細胞間的相互作用，從而改善PQ引起機體持續性免疫功能的紊亂。

因此，MB能夠改善PQ對機體造成的持續性氧化損傷，可能與其通過緩解PQ對胸腺細胞的氧化損傷，調節胸腺T淋巴細胞亞群皮質、髓質區的分布，從而緩解機體持續性損傷。本研究為探索PQ中毒的發病機制和臨床應用提供了一種新思路。胸腺組織細胞及血液中Bcl-2、Bax、CD4和CD8的定量研究及兩者之間的關系沒有進一步探討，也是本實驗室今后研究的方向。

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(責任編輯:陳妙玲，羅 森)

Effect of methylene blue on T-lymphocyte subsets and oxidative stress in rat thymus with paraquat poisoning

DU Bin，CHEN Jun-liang，TANG Shai-di，CHEN Wei，PANG Qing-feng

(School of Wuxi Medicine，Jiangnan University，Wuxi 214122，China.E-mail:qfpang@jiangnan.edu.cn)

AIM:To illustrate the effect of methylene blue(MB)on T-lymphocyte subsets and oxidative stress of the thymus in rats with paraquat(PQ)poisoning.METHODS:Male SD rats(n=40)were randomly assigned to 4 groups:normal group，control group，low-dose(2 mg·kg－1·d－1)MB group and high-dose(4 mg·kg－1·d－1)MB group.After 72 h，the pathological morphological changes of the thymus were observed under microscope with HE staining.The SOD activity and MDA content were measured by colorimetry method.The expression of Bcl-2，Bax，CD4 and CD8 was determined by immunohistochemical method.RESULTS:In MB group，the thymus tissue showed good corticomedullary demarcation.MDA content decreased and SOD activity increased，indicating that the ability of antioxidation enhanced.Bcl-2 and Bax expression was down-regulated，Bcl-2/Bax ratio increased，and CD4 positive cells increased.CONCLUSION:MB protects against oxidative damage induced by PQ，and regulates the distribution of T-lymphocyte subsets in the cortex and medulla，thus relieving the persistent body damage.

Methylene blue;Paraquat;Oxidative stress;T-lymphocyte subsets

R994.6

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.025

2016-01-07

2016-04-06

國家自然科學基金資助項目(No.81270126)

△Tel:0510-85328363;E-mail:qfpang@jiangnan.edu.cn