白藜蘆醇調控Th1和Th2應答抑制小鼠日本血吸蟲病肝臟纖維化的研究

張偉偉，朱繼峰，王　任，高雅楠，張軍峰，佟書娟

(1.南京中醫藥大學病原與免疫學教研室，江蘇 南京　210023；2.江蘇省現代病原生物學重點實驗室，江蘇 南京　211166)

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白藜蘆醇調控Th1和Th2應答抑制小鼠日本血吸蟲病肝臟纖維化的研究

張偉偉1，朱繼峰2，王任1，高雅楠1，張軍峰1，佟書娟1

(1.南京中醫藥大學病原與免疫學教研室，江蘇 南京210023；2.江蘇省現代病原生物學重點實驗室，江蘇 南京211166)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.012

目的探討白藜蘆醇對日本血吸蟲病纖維化的作用，并分析其對Th1和Th2應答的影響。方法45只C57BL/6小鼠感染日本血吸蟲3周后，隨機分為A、B、C 3組，A組為感染組，B組為灌胃白藜蘆醇治療組，C組為灌胃吡喹酮治療組,另取15只正常C57BL/6小鼠為健康對照D組。在感染第13周，取小鼠的肝臟，應用天狼猩紅染色觀察肝臟纖維化程度，并檢測肝臟中IL-13、IFN-γ和TGF-β mRNA的表達情況。另取脾臟淋巴細胞，采用流式細胞術檢測Th1和Th2細胞占總T淋巴細胞的比例。結果感染第13周，與A組相比，B組和C組小鼠肝臟纖維化程度明顯減輕(P<0.01)，B組小鼠的Th1細胞比例明顯增高(P<0.05)，Th2細胞比例明顯降低(P<0.01)，B組小鼠外周血清中的抗可溶性成蟲抗原(SWA)的IgG2a明顯增多(P<0.05)，而抗可溶性蟲卵抗原(SEA)的IgG1明顯減少(P<0.01)，B組小鼠肝臟中IFN-γ mRNA的表達量明顯增高(P<0.05)，而IL-13、TGF-β mRNA的表達水平明顯降低(P<0.01)。結論白藜蘆醇通過增強日本血吸蟲感染小鼠的Th1應答，降低Th2應答，明顯抑制日本血吸蟲感染小鼠肝臟纖維化程度。

日本血吸蟲；白藜蘆醇；吡喹酮；纖維化；Th1；Th2

血吸蟲病是一種嚴重危害全球多個地區人民健康的慢性感染性免疫疾病[1]。其最主要的病理損傷是由沉積在肝臟中的蟲卵導致的肉芽腫及繼發的纖維化，能夠阻塞竇前靜脈, 導致門脈高壓, 從而引起肝、脾腫大,上消化道出血及腹水等癥狀, 嚴重者可危及生命[2]。現在的研究表明，CD4+T細胞應答在纖維化發生發展過程中發揮關鍵作用，尤其是Th1/Th2細胞的極化及其免疫調節與血吸蟲肝臟纖維化的發生發展密切相關。Th1細胞通過產生INF-γ等細胞因子有效抑制肝星狀細胞的增殖和活化，從而下調血吸蟲病的纖維化程度, 而Th2細胞則能夠產生大量的IL-13和TGF-β，促進成纖維細胞的形成和膠原蛋白的合成與沉積[3]。目前，探討血吸蟲病的免疫學基礎，以期開發新的治療方案和藥物，對治療血吸蟲病人具有積極的意義。

白藜蘆醇是廣泛存在于葡萄、虎杖等多種藥用植物中的一種天然多酚類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤和抗炎作用[4-6]。已有研究報道，白藜蘆醇對四氯化碳和酒精導致的肝臟纖維化具有明顯的抑制作用。同時，有人也發現白藜蘆醇伍用吡喹酮能夠有效治療血吸蟲感染小鼠的纖維化[7-8]。這些研究均提示白藜蘆醇本身同樣也具有抗纖維化的作用，但相關研究尚未見報道，且其機制尚不清楚。同時有研究報道了白藜蘆醇對人外周血T細胞的增殖、淋巴細胞母細胞化以及IL-2、INF-γ 產生的影響[9]。這就提示白藜蘆醇可能通過調節血吸蟲感染過程中的T細胞免疫應答，從而影響相應的病理。本研究采用白藜蘆醇灌胃日本血吸蟲感染小鼠，探討白藜蘆醇對日本血吸蟲感染小鼠Th1/Th2細胞極化以及相應的肝臟纖維化的影響，為白藜蘆醇治療日本血吸蟲病等感染性免疫疾病提供新的理論基礎和治療策略。

1　材料與方法

1.1實驗動物與陽性釘螺清潔級6～8周齡♀ C57BL/6小鼠60只, 購自南京醫科大學實驗動物中心； 日本血吸蟲感染釘螺購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1.2試劑白藜蘆醇(純度為98%以上，批號為KA080CA14)購自上海源葉生物技術有限公司。吡喹酮購自南京制藥廠有限公司(批號為20091202)。流式抗體倉鼠抗小鼠CD3e-APC、大鼠抗小鼠CD4-FITC、大鼠抗小鼠IFN-γ-PE、大鼠抗小鼠IL-4-PE均購自eBioscience公司。破膜固定劑試劑盒(Fix/Perm Cell Permeabilization Kit)購自BD公司。小鼠IL-13、INF-γ、TGF-β引物購自上海英駿生物技術有限公司。酶聯吸附反應HRP結合的大鼠抗小鼠IgG1和IgG2a抗體購自BD公司，TMB底物購自BD公司。TRIzolTM購自上海英駿生物技術有限公司，逆轉錄試劑盒購自Fermantas公司，SYBR Green PCR Master Mix購自Roche公司。

1.3感染模型的建立和分組取6～8周齡♀ C57BL/6小鼠45只，每鼠經腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴(12±2)條。感染3周后，感染小鼠隨機均分為3組，每組15只。實驗共設立4組： A組小鼠為感染組，B組小鼠為灌胃白藜蘆醇治療組，感染6周后連續6周灌胃給予白藜蘆醇20 mg·kg-1·d-1，C組小鼠為灌胃吡喹酮治療組，在感染后第3、6周灌胃給予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1×3 d, D組小鼠為健康對照組。

1.4病理學檢查在感染第13周取各組小鼠肝組織固定，石蠟包埋，切片，天狼猩紅染色，于低倍鏡(×100)下分別觀察肝組織中的纖維化程度，采用Image-Pro Plus 圖像處理分析軟件分析天狼猩紅染色的平均光密度。

1.5流式細胞術檢測脾淋巴組織中Th1和Th2細胞比例在感染第13周，取各組小鼠的脾臟淋巴結組織研磨制備成單細胞懸液，并以完全RPMI 1640培養液調節濃度至1×109·L-1。在反應體系中加入1 mg·L-1佛波酯(PMA)、50 mg·L-1離子霉素及0.7 mL·L-1Golgistop，置于37 ℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中培養6 h。將細胞用PBS緩沖液洗1遍并重懸于100 μL PBS緩沖液中，加入CD3e-APC(0.2 g·L-1)和CD4-FITC(0.5 g·L-1)抗體，充分混勻后于4 ℃避光孵育20 min。以緩沖液洗1遍，加入Fixation/Permeabilization Solution 1 mL，并于4 ℃避光孵育40 min。1 500 r·min-1離心后棄去上清，以100 μL Perm/Wash Buffer 重懸細胞后，分別加入抗IFN-γ-PE (0.2 g·L-1)或抗IL-4-PE(0.2 g·L-1)抗體，置4 ℃避光孵育20 min。PBS緩沖液洗1遍后，以500 μL PBS緩沖液重懸細胞，用流式細胞儀(FACS Calibur，Becton Dickinson公司)檢測。

1.6ELISA檢測血清中IgG1和IgG2a在感染第13周對各組小鼠進行內眥取血，10 000 r·min-1離心后取上清即為血清。預先用血吸蟲成蟲抗原(SWA)和血吸蟲蟲卵抗原(SEA)以4 mg·L-1的最佳濃度包被酶標板，40 g·L-1脫脂奶粉封閉。加入稀釋度為1 ∶100血清孵育，洗脫后分別在包被SWA和SEA的酶標板中加入稀釋度為1 ∶1 000 HRP標記的anti-mouse IgG2a和anti-mouse Ig G1孵育，洗脫后TMB顯色，終止顯色后，立即在酶標讀數儀450 nm的波長下檢測吸光度。

1.7實時定量RT-PCR檢測肝組織中的INF-γ、IL-13、TGF-β mRNA在感染第13周每組小鼠肝組織取50 mg，用TRIzolTM提取肝組織總RNA，按M-MLV轉錄cDNA。IL-4、INF-γ、TGF-β的反應體系都為SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，反轉錄cDNA 5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 3 μL，總體積20 μL。進行實時熒光定量PCR，反應條件為：95℃ 10 min， 40個循環：60℃ 60 s，95℃ 15 s，溶解曲線60℃～90℃保證擴增為單一產物。以Ct值進行結果分析，采用相對量法與內參GAPDH比較。計算公式為：2-ΔCT,ΔCt=Ct gene-Ct control。

1.8統計學分析統計作圖用GraphPad Prism 4.0軟件，采用SPSS 15.0軟件進行統計分析。兩組間差異比較采用Student′st檢驗。

Fig 1　The hepatic fibrosis in different groups

A: The degree of hepatic fibrosis; B: The mean density of hepatic fibrosis.**P<0.01vsinfected group

2　結果

2.1不同處理組小鼠肝臟的纖維化程度日本血吸蟲感染后第13周，光鏡下健康對照組小鼠的肝臟未見任何病理改變，而感染組、白藜蘆醇治療組、吡喹酮治療組小鼠的肝臟中都可見膠原纖維沉積(Fig 1A)。在纖維化程度和范圍上，感染組最嚴重，白藜蘆醇治療組和吡喹酮治療組較感染組明顯減輕(P<0.01),而白藜蘆醇治療組和吡喹酮治療組之間差異沒有統計學意義(P>0.05)( Fig 1B )。結果提示白藜蘆醇與吡喹酮一樣都能明顯抑制肝臟纖維化程度。

Fig 2　Proportions of Th1 (A), Th2 (B) cells in different groups

*P<0.05,**P<0.01vsinfected group;##P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vspraziquantel group

2.2不同處理組小鼠的Th1、Th2細胞比例與健康對照組比較，日本血吸蟲感染13周的感染組、白藜蘆醇治療組、吡喹酮治療組小鼠脾臟淋巴細胞中Th1細胞(CD3+CD4+IFN-γ+)占總T細胞的比例明顯增加(P<0.01)，并且白藜蘆醇治療組的Th1細胞比例明顯高于感染組(P<0.05)和吡喹酮治療組(P<0.01)，而感染組和吡喹酮治療組的Th1細胞比例并無差異(P>0.05)(Fig 2A)。同時，感染組、白藜蘆醇治療組、吡喹酮治療組小鼠脾臟淋巴細胞中Th2細胞(CD3+CD4+IL-4+T細胞)占總T細胞的比例也明顯高于健康對照組小鼠(P<0.01)，并且白藜蘆醇治療組和吡喹酮治療組的Th2細胞比例均明顯低于感染組(P<0.01)，但是白藜蘆醇治療組和吡喹酮治療組之間差異沒有統計學意義(P>0.05)(Fig 2B)。

2.3不同處理組小鼠血清中的抗SWA-IgG2a和抗SEA-IgG1表達水平為了進一步驗證Th1和Th2細胞應答情況，檢測了各組小鼠血清中的抗SWA-IgG2a和抗SEA-IgG1表達水平。與健康對照組比較，感染13周后，感染組、白藜蘆醇治療組、吡喹酮治療組小鼠血清中的抗SWA-IgG2a的表達水平都明顯增加(P<0.01)，并且白藜蘆醇治療組抗SWA-IgG2a的表達水平明顯高于感染組(P<0.05)和吡喹酮治療組(P<0.05)，而感染組和吡喹酮治療組則沒有差異(P>0.05)(Fig 3A)。抗SEA-IgG1的檢測結果發現，感染組、白藜蘆醇治療組、吡喹酮治療組小鼠血清中的表達水平較健康對照組也都明顯增加(P<0.01)，并且白藜蘆醇治療組(P<0.01)和吡喹酮治療組(P<0.05)的抗SEA-IgG1表達水平明顯低于感染組，而白藜蘆醇治療組和吡喹酮治療組之間差異沒有統計學意義(P>0.05)(Fig 3B)。

Fig 3　Production of anti-SWA IgG2a (A) and anti-SEA IgG1 (B)

*P<0.05,**P<0.01vsinfected group;##P<0.01vscontrol group;△P<0.05vspraziquantel group

2.4不同處理組小鼠肝臟中INF-γ、IL-13、TGF-β的表達水平為了進一步闡明白藜蘆醇抗日本血吸蟲病肝臟纖維化的機制，又檢測了與Th1/Th2免疫反應相關，同時又是參與肝臟纖維化發生發展的重要細胞因子INF-γ、IL-13、TGF-β的表達情況。結果如Fig 4所示，感染13周后，感染組、白藜蘆醇治療組、吡喹酮治療組小鼠肝臟中的INF-γ、IL-13、TGF-β的mRNA表達水平都明顯高于健康對照組小鼠(P<0.01)。并且白藜蘆醇治療組肝臟中的INF-γ mRNA表達水平較感染組和吡喹酮治療組明顯增高(P<0.05)，但白藜蘆醇治療組肝臟中IL-13、TGF-β的mRNA表達水平明顯低于感染組(P<0.01)。另外發現，白藜蘆醇治療組和吡喹酮治療組小鼠肝臟IL-13、TGF-β的mRNA表達水平之間差異都沒有統計學意義(P>0.05)。

Fig 4　Expression of INF-γ (A),IL-13 (B), TGF-β (C) in livers from different groups

*P<0.05,**P<0.01vsinfected group;##P<0.01vscontrol group;△P<0.05vspraziquantel group

3　討論

血吸蟲病是一種嚴重危害人類健康的寄生蟲病。目前，全世界有78個國家和地區流行血吸蟲病，感染者超過2億[10]。我國主要流行日本血吸蟲病，至2014年底全國仍有血吸蟲病人11.5萬余例[11]。迄今的研究表明，血吸蟲病是一種“免疫性”疾病。在血吸蟲感染過程中, 蟲體的各個發育階段, 如童蟲、成蟲和蟲卵的抗原成分能夠刺激機體, 誘發機體一系列免疫應答及產生相應的病理損害, 這涉及到體液免疫和細胞免疫等諸多因素復雜的反應及調節,其中T淋巴細胞(尤其是Th1和Th2細胞)發揮了極其重要的作用，如Th1細胞通過分泌INF-γ抑制，Th2細胞通過產生IL-13、TGF-β促進肝臟纖維化的形成發展[3]。因此，尋找通過調節免疫應答減輕血吸蟲病病理的治療藥物是十分必要的。

目前的常用抗血吸蟲藥吡喹酮主要是通過有效殺蟲和直接對肝臟作用減輕纖維化程度，對CD4+T細胞應答影響不大，因此仍然不能改變纖維化的進程[12]。而近幾年的研究發現一種中藥化合物白藜蘆醇，同樣可以明顯抑制肺部和酒精性肝纖維化，其機制可能是通過抑制Th17細胞應答發揮抗纖維化的作用[7,13]。白藜蘆醇是否同樣可以通過調節Th1和Th2細胞應答，從而對血吸蟲病發揮抗肝臟纖維化作用？與設想一致，本研究首先發現經白藜蘆醇治療的感染小鼠肝臟的纖維化程度明顯減輕，并且效果與吡喹酮沒有統計學差異。這提示白藜蘆醇也同樣具有治療血吸蟲病纖維化的潛能。進一步的免疫細胞檢測發現經白藜蘆醇治療后，Th1細胞比例明顯増高，而Th2細胞比例則明顯下降，可以提示白藜蘆醇可以通過上調Th1細胞應答和下調Th2細胞應答，從而有效抑制肝臟纖維化程度。文獻報道血吸蟲感染過程中，機體內抗SWA- IgG2a和抗SEA-IgG1的水平可以分別反映Th1細胞和Th2細胞的應答情況[14]。檢測結果發現，白藜蘆醇同樣可以上調抗SWA- IgG2a和下調抗SEA-IgG1的表達水平，這個實驗表明血吸蟲感染過程中白藜蘆醇的確是與增強的Th1細胞、減弱的Th2細胞反應存在聯系，也進一步佐證我們的推測。

肝臟纖維化的形成主要是由于相關的免疫細胞因子和炎癥因子，如INF-γ、IL-13、TGF-β等在肝臟中持續激活肝星狀細胞，產生大量細胞外基質沉積在肝臟中[12]。因此，又進一步檢測了白藜蘆醇治療后Th1細胞因子INF-γ和Th2細胞因子IL-13、TGF-β在肝臟中的表達情況，結果發現在肝臟中檢測到的INF-γ和IL-13、TGF-β的表達水平變化趨勢與檢測到的Th1細胞和Th2細胞比例變化是相一致的。這個結果充分表明白藜蘆醇治療通過增強Th1細胞應答，上調INF-γ表達，同時通過減弱Th2細胞應答，下調IL-13、TGF-β表達，共同抑制肝臟纖維化程度。研究已經明確在血吸蟲感染過程中，血吸蟲的成蟲抗原(SWA)可誘導巨噬細胞向M1型轉化，繼而可以有效地增強Th1細胞應答。而在蟲卵產生以后，其分泌的可溶性蟲卵抗原(SEA)促使巨噬細胞又向M2型巨噬細胞極化，從而上調Th2細胞應答[15-16]。因此,巨噬細胞血吸蟲感染不同階段向M1/M2的極化決定了Th1和Th2細胞的分化。而有課題組也發現，白藜蘆醇可以促進LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞向M2型極化改變[17]，說明白藜蘆醇對巨噬細胞的極化有調控作用。這些研究結果提示在血吸蟲感染過程中，白藜蘆醇可能在巨噬細胞向M1/M2的極化的過程中發揮作用，進而調控了Th1和Th2免疫應答的發生發展，值得今后更深入的研究。在實驗中，同樣發現吡喹酮治療后對Th2細胞應答也有所調節，也提示了吡喹酮可能不僅是通過殺蟲和直接對肝臟作用發揮抗纖維化作用，也可能是通過調節T細胞免疫應答造成，這也值得進一步的探究。

綜上所述，白藜蘆醇作為一種重要的中藥單體，在臨床上已經被證明具有良好的抗氧化和抗炎等作用，本研究發現白藜蘆醇還具有免疫調節作用，其通過上調Th1細胞應答，下調Th2細胞應答，從而有效抑制血吸蟲病肝臟纖維化程度，但具體的機制還未有深入研究，有待于繼續探尋，從而為白藜蘆醇的進一步研究和開發利用提供實驗依據。

(致謝：本文實驗主要是在江蘇省現代病原生物學重點實驗室和南京中醫藥大學基礎醫學院實驗室分部完成，在此誠摯感謝對本實驗提供幫助的老師和同學！)

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Resveratrol inhibited hepatic fibrosis in mice with schistosomiasis japonica by modulating Th1 and Th2 responses

ZHANG Wei-wei1, ZHU Ji-feng2, WANG Ren1, GAO Ya-nan1, ZHANG Jun-feng1, TONG Shu-juan1

(1.DeptofPathogenandImmunology,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanjing210023，China;2.JiangsuKeyLaboratoryofPathogenBiology,NanjingMedicalUniversity，Nanjing211166，China)

AimTo observe the antifibrogenic effect of resveratrol on mice with schistosomiasis japonica and its effect on Th1 and Th2 responses.MethodsForty-five mice infected withS.japonicumcercariae for 3 weeks were randomly divided into three groups named as infection group(A), resveratrol group(B)and praziquantel group(C). Fifteen normal mice were taken as normal control group(D). In the 13th week post-infection, all mice were sacrificed and the liver tissues were removed. Histopathological changes were observed in the liver of all groups. Splenocytes were prepared from spleens of mice withS.japonicuminfection and the proportions of Th1 and Th2 cells in T cells were determined by FACS respectively. RT-PCR was used to detect the relative IFN-γ,IL-13,TGF-β mRNA levels in liver tissue.ResultsAfter treatment, the degrees of liver fibrosis in groups B and C decreased in the 13th week post-infection(P<0.01). Compared to group A, the proportions of Th1 cells in group B significantly increased(P<0.05) and the proportions of Th2 cells in group B decreased significantly(P<0.01). The level of anti-SWA IgG2a in group B was significantly higher(P<0.05), while the anti-SEA IgG1 level in group B was lower(P<0.01) than that in group A. The hepatic expression of IFN-γ mRNA level in group B was higher than that in group A(P<0.05), and IL-13,TGF-β mRNA levels in group B were lower than in group A(P<0.01).ConclusionResveratrol has an antifibrogenic effect through upregulating Th1 cell response and downregulating Th2 cell response in mice infected withSchistosomajaponicum.

Schistosomajaponicum; resveratrol; praziquantel; fibrosis; Th1; Th2

2016-04-17；

2016-05-12

南京中醫藥大學基礎醫學院青年科技創新基金項目(No 14JCQN04)

張偉偉(1987-)，女，博士，講師，研究方向：中醫藥抗感染與免疫機制，E-mail:allien242@126.com；

佟書娟(1966-)，女，碩士，教授，碩士生導師,研究方向：中醫藥抗感染與免疫機制，通訊作者，E-mail: tongshujuan6@sina.com

A

1001-1978(2016)08-1091-07

R-332；R284.1；R322.47；R392.11；R392.12；R532.21；R575.2

網絡出版時間：2016-7-19 10:43網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.024.html