內向整流鉀通道激動劑對異丙腎誘發心肌肥厚大鼠心律失常的抑制作用及機制研究

陳依春，李超紅，楊明珠，王曉露，封啟龍

(1.山西醫科大學生理學系，細胞生理學省部共建教育部重點實驗室，山西 太原　030001；2.新鄉醫學院第一附屬醫院，河南省神經病學研究所，河南 衛輝　453000)

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內向整流鉀通道激動劑對異丙腎誘發心肌肥厚大鼠心律失常的抑制作用及機制研究

陳依春1，李超紅2，楊明珠1，王曉露1，封啟龍1

(1.山西醫科大學生理學系，細胞生理學省部共建教育部重點實驗室，山西 太原030001；2.新鄉醫學院第一附屬醫院，河南省神經病學研究所，河南 衛輝453000)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.019

目的研究內向整流鉀通道激動劑扎考必利(zacopride，Zac)對異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)誘發的心肌肥厚大鼠心律失常的抑制作用及其電生理機制。方法① 51只SD大鼠(200～230 g)，隨機分為對照組、ISO組和ISO+Zac組(n=17)。連續7 d經腹腔注射5 mg·kg-1ISO，建立大鼠心肌肥厚模型；② 利用體表心電圖觀察Zac對ISO誘發的心肌肥厚大鼠心律失常的效應；③ 應用全細胞膜片鉗技術觀測Zac對模型組大鼠心肌細胞內向整流鉀電流(IK1)、靜息電位(RMP)、延遲后除極(DADs)及觸發活動(TA)的影響。結果① M型超聲心動圖顯示，與對照組相比，ISO組大鼠左室舒張末期內徑(LVEDD)和左室收縮末期內徑(LVESD)均明顯降低，左室后壁舒張末期厚度(LVPWd)和室間隔舒張末期厚度(IVSd)均增高(P<0.05)，提示ISO誘發建立大鼠心肌肥厚模型成功;② 體表心電圖顯示，ISO組肥厚大鼠88.89%發生室性心律失常(頻發室性期前收縮)，生理鹽水對照組大鼠未觀察到心律失常的發生。在連續7 d給予15 μg·kg-1Zac干預后，肥厚大鼠心律失常發生率降至11.11%(P<0.05);③ 與對照組相比，ISO組大鼠RMP由(-71.05±1.27) mV降低至(-69.38±1.21) mV(P<0.05)；連續7 d給予15 μg·kg-1Zac后，RMP增加至(-73.86±1.33) mV，較對照組和ISO組均明顯增大(P<0.05);④ ISO+Zac組大鼠單個心肌細胞DADs和TA發生率較ISO致心肌肥厚組明顯降低，由88.24%降低至11.76%(P<0.05);⑤ 與對照組相比，ISO組大鼠內向整流鉀通道電流(IK1)明顯降低，在給予Zac(15 μg·kg-1)后IK1明顯增加(P<0.05)。結論選擇性IK1通道激動劑Zac可明顯抑制ISO誘發的心肌肥厚大鼠心律失常的發生，其機制與它通過增強IK1使膜電位負值增大和抑制延遲后除極的效應有關。

心律失常；內向整流鉀通道；靜息電位；延遲后除極；全細胞膜片鉗；心肌肥厚

心肌肥厚是一種主要發生在長期壓力負荷過重情況下的代償性改變，通過心肌總量增加，收縮力加強，使心臟得以維持正常的排血功能，并保持相當的儲備力。但肥大心肌需氧增加，冠狀動脈供血量相對不足，往往導致嚴重的心律失常及/或心功能惡化[1]。研究表明[2]，心肌肥厚并發心衰患者中有一半出現多種形態的心律失常，并經常由此發生猝死。因此，探索防治心肌肥厚過程中心律失常發生的新途徑，具有重要的理論和臨床意義。

內向整流鉀通道(IK1通道)電流是心肌最主要的背景電流，參與靜息電位的維持和動作電位3期終末復極[3-4]，并與心肌興奮性和心律失常的發生密切相關[5-7]。動物實驗證明，心衰時IK1的減弱，可導致膜電導降低，使內向的鈉鈣交換電流引發較強的去極化，從而促使延遲后除極(DADs)和觸發活動(TA)的發生率增加[8]。而DADs及其觸發的TA與多種心律失常特別是惡性心律失常的發病密切相關，一直是抗心律失常實驗研究和臨床治療的靶點[9-10]。因此，適度激活IK1通道[11]是否可以逆轉上述心律失常發生的病理過程，即通過增強IK1，使膜電導增加，從而減小靜息期誘發DADs發生的內向鈉鈣交換電流，產生抗心律失常效應。本研究擬應用IK1通道選擇性激動劑和心肌肥厚引起心律失常的動物模型驗證這一設想。

扎考必利(zacopride，Zac)屬苯甲酰胺衍生物，為5-羥色胺3(5-HT3)受體阻斷劑和5-羥色胺4(5-HT4)受體激動劑，是Liu等[12]報道的首個IK1通道選擇性激動劑，可特異性適度增大IK1，增量不超過40%，她們研究了Zac激活IK1通道的抗心律失常作用，觀察到Zac可通過增強大鼠IK1，抑制烏頭堿(aconitine)誘發的室性心律失常和延遲后除極(DADs)。但Zac對心肌肥厚誘發的心律失常是否有效，至今未見報道。本研究使用ISO建立心肌肥厚大鼠心律失常的模型，利用體表心電圖記錄觀察了Zac的抗心律失常作用。利用全細胞膜片鉗技術，觀察Zac對心肌肥厚模型單個心肌細胞的靜息電位、DADs及相關離子通道的作用，進一步探討其抗心律失常的可能機制。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1實驗動物健康SPF級成年Sprague-Dawley(SD)大鼠220～230 g，♂，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，許可證號：SCK-(軍)2014-0013。自由進食，飲水，室溫控制在(25±2)℃。

1.1.2藥品與試劑異丙腎上腺素(isoproterenol hydrochloride)，批號：3A/156653，購買于英國Tocris公司；扎考必利(zacopride hydrochloride)，批號：3A/159084，購買于英國Tocris公司；膠原酶P(collagenase P)，購買于德國Bochringer Mannhein公司；磷酸肌酸二鈉鹽(Na2-phosphocreatine)、三磷酸腺苷鎂鹽(Mg-ATP)、4-氨基吡啶(4-AP)、5′-三磷酸腺苷二鉀(K2-ATP)、牛磺酸(taurine)、HEPES、L-谷氨酸(L-Glutamic)、氯化鋇(BaCl2)、氯化銫(CsCl)、乙二胺四乙酸(glycol ether diamine tetraacetic acid，EGTA)均購買于美國Sigma公司；NaCl、KCl、NaH2PO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、KCl、MgCl2均購自Sangon Biotech公司；其余試劑均為國產分析純產品。

1.1.3溶液配制① 臺氏液(mmol·L-1)：NaH2PO40.33，NaCl 140，KCl 5.4，MgCl21.0，glucose 10.0，HEPES 5.0，CaCl21.8，使用NaOH調節pH至7.38。② 無鈣臺氏液：不含CaCl2的臺氏液。③ KB液(mmol·L-1)：HEPES 10.0，KCl 40.0，Taurine 20.0，KH2PO425.0，EGTA 1.0，glucose 10.0，MgSO43.0，L-谷氨酸50.0，使用KOH調節pH至7.38。④ 酶液(mmol·L-1)：無鈣臺氏液中加入Taurine 20.0 mmol·L-1，Collagenase P 0.07～0.1 g·L-1，使用NaOH調節pH至7.38。⑤ 動作電位(AP)電極內液(mmol·L-1)[13]：Mg-ATP 5.0，HEPES 10.0，磷酸肌酸二鈉鹽5.0，KCl 140.0，MgCl22.0，使用KOH調節pH至7.20。細胞外液(mmol·L-1)：KCl 5.4，glucose 10.0，CaCl22.5，NaCl 134.0，MgCl21.0，HEPES 10.0，使用NaOH調節pH至7.40。⑥ 內向整流鉀電流(IK1)電極內液(mmol·L-1)：K2-ATP 3.0，KCl 150.0，EGTA 5.0，MgCl21.0，4-AP 5.0，HEPES 5.0，Mg-ATP 1.0，使用KOH調節pH至7.30。細胞外液為臺氏液中加入0.5 mmol·L-1CdCl2以阻斷L-型鈣通道。

1.1.4儀器BL-420F生物機能實驗系統：成都泰盟軟件有限公司；膜片鉗放大器(Axopatch200B)：美國Axon Instruments公司；數模轉換器(Digidate1440A)：美國Axon Instruments公司；微電極拉制儀(PC-10)：日本Narishige公司；液壓式微操縱器(MHW-103)：日本Narishige公司；Langendorff心臟灌流系統：澳大利亞AD Instruments公司；倒置顯微鏡(1X71)：德國Olympus公司。

1.2方法

1.2.1大鼠心肌肥厚模型制備異丙腎上腺素(ISO)誘發大鼠在體心肌肥厚模型制備，取51只健康SD大鼠200～230 g。將其隨機分成3組：① 對照組：每日給予0.5 mL的生理鹽水(NS)腹腔內注射。② ISO組：每日給予5 mg·kg-1的ISO溶于0.5 mL的NS腹腔內注射，制備大鼠心肌肥厚模型[13-15]。③ ISO+Zac組：每日給予5 mg·kg-1的ISO和15 μg·kg-1的Zac溶于0.5 mL的NS腹腔內注射。以上3組大鼠均連續給藥7 d，每天稱重1次，根據體重變化調整給藥劑量，最后1次給藥24 h后開始實驗。

1.2.2大鼠超聲心動圖檢查最后1次給藥24 h后，各組大鼠用30 mg·kg-1水合氯醛麻醉，仰臥位固定于鼠板上，剃毛暴露胸部。采用美國GE公司的vivid-7超聲儀進行大鼠心功能檢測。測量的指標主要包括：左心室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)、左心室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)、左心室后壁舒張末期厚度(left ventricular posterior wall end-diastolic thickness，LVPWd)、室間隔舒張末期厚度(interventricular septum end-diastolic thickness，IVSd)、左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室短軸的縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。各個指標均取3個連續測量心動周期的平均值。

1.2.3大鼠在體體表心電圖記錄最后一次給藥24 h后，各組大鼠用30 mg·kg-1水合氯醛腹腔內注射麻醉，將肢體導聯連接固定好之后，采用BL-420F生物機能實驗系統記錄大鼠Ⅱ導聯心電圖，觀察1h內室性心律失常的發生率、室性期前收縮(VPB)個數、ST段抬高幅度。ST段測量方法參考Yamamoto等[16]所用方法。

1.2.4大鼠單個心肌細胞的分離各模型組大鼠用40 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，斷頭頸動脈放血，快速開胸取心臟，在提前預冷并以100%氧氣充灌的4℃無鈣臺氏液中仔細修剪，經主動脈逆行插管將心臟懸掛于Langendorff灌流裝置上，以100%氧氣充灌的無鈣臺氏液恒壓(7.35 kPa)、恒溫(37℃)灌流心臟10 min，待心臟充盈后，改為酶液循環灌流15～20 min，待心室變大，變軟后剪取左心室肌組織置于KB液中，用眼科剪輕輕剪碎，用尖端圓潤的玻璃吸管輕輕吹打3～5 min后，用孔徑為150 μm的濾網過濾得到單個細胞，保存于KB液中，室溫下靜置3 h讓其穩定后進行實驗。

1.2.5全細胞膜片鉗記錄吸取1～2滴細胞懸液滴入倒置顯微鏡的細胞槽(約1 mL)內，靜置8～10 min，待細胞充分貼壁后，用臺氏液灌流復鈣，流速約2 mL·min-1，在高倍鏡下選取長桿狀、紋理清晰、表面光滑的心肌細胞作為實驗對象，將充灌電極內液的玻璃微電極(電阻約2～5 MΩ)輕輕移至細胞表面，施加負壓使電極尖端和細胞膜之間形成高阻封接(電阻達GΩ)，負壓破膜后，進行膜電容補償和串聯電阻補償，使用Axopatch200B膜片鉗放大器、Digidate1440A數模轉換器及Pclamp9.0采集、貯存及分析離子電流。

1.2.6模型組大鼠單個心肌細胞延遲后除極記錄形成全細胞記錄模式后，先觀察所記錄細胞的靜息電位，然后用記錄動作電位的細胞外液灌流，用15 ms、3 Hz的連續刺激作為條件刺激，誘發延遲后除極(DADs)。

1.2.7模型組大鼠單個心肌細胞內向整流鉀電流記錄記錄內向整流鉀電流(IK1)的細胞外液為臺氏液中加入0.5 mmol·L-1CdCl2以阻斷ICa-L。鉗制電位-40 mV，給予細胞0.5 Hz、500 ms、躍階10 mV從-120 mV～+20 mV的去極化脈沖刺激激活IK1。膜電流大小使用電流密度(pA/pF)表示。

2　結果

2.1各組大鼠超聲心動圖檢測結果各組大鼠M型超聲心動圖檢查結果顯示，與對照組相比，ISO組大鼠LVEDD和LVESD均明顯降低(P<0.05)，LVPWd和IVSd以及LVEF和LVFS均增高(P<0.05)，提示ISO組大鼠室壁增厚，心室腔縮窄，呈現向心性心肌肥厚和收縮功能增強，心肌肥厚模型建立成功。ISO+Zac組大鼠與ISO組大鼠相比，LVEDD和LVESD均增加，但與對照值仍有明顯差異(P<0.05)；LVPWd、IVSd以及LVEF和LVFS均降低，且接近對照水平(Tab 1、Fig 1)。

2.2Zac可減輕ISO誘發的心肌肥厚大鼠心律失常各組大鼠體表心電圖檢查顯示，對照組大鼠在監測中均未觀察到心律失常的發生。ISO組大鼠88.89%發生室性心律失常，100%發生ST段抬高。在給予15 μg·kg-1Zac后，ISO+Zac組大鼠心律失常的發生率降低至11.11% (P<0.05)，但與心肌缺血相關的ST段變化未見明顯改善，與ISO組大鼠相比無差異(Tab 2、Fig 2)。

Tab 1　Characteristics of echocardiogram in model ±s,n=9)

ISO: isoproterenol; Zac: zacopride; LVEDD: left ventricular end-diastolic dimension; LVESD: left ventricular end-systolic dimension; LVPWd: left ventricular posterior wall end-diastolic thickness; IVSd: interventricular septum end-diastolic thickness; LVEF: left ventricular ejection fraction; LVFS: left ventricular fractional shortening.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsISO.

Fig 1　The M-mode echocardiographic images of model rats in different treatment groups

M-mode echocardiographic images showing marked concentric hypertrophy and cardiac dysfunction in ISO-treated rats in contrast to rats in control group.The structure and functional abnormality improved significantly in rats treated with ISO+Zac.

Tab 2Comparison of arrhythmic incidence and ECG ST-segment changes in rats

GroupIncidenceofventriculararrhythmia/%IncidenceofST-segmentelevation/%ST-segmentelevation/mVControl000ISO88.89*100*0.224±0.018*ISO+Zac11.11*#100*0.200±0.011*

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsISO

Fig 2　Representative electrocardiogram(II limb lead) showing inhibitory effect of Zac on arrhythmia in isoproterenol-induced myocardial hypertrophic rats

A: Condensed ECG tracings in rats of differently treated groups;B:Representative ECG tracing at different time points;a:normal ECG tracing;b:VPB and ST-segment elevation;c:ST-segment elevation.

2.3Zac可增大心肌細胞靜息電位，抑制ISO所致肥厚心肌延遲后除極全細胞膜片鉗結果顯示，對照組、ISO組、ISO+Zac組單個心肌細胞RMP分別為(-71.05±1.27)、(-69.38±1.21)、(-73.86±1.33) mV。組間比較，ISO組小于對照組，ISO+Zac組分別大于對照組和ISO組(P<0.05)，見Fig 3。電流鉗模式下，對照組、ISO組和ISO+Zac組大鼠單個心肌細胞DADs發生率分別為0%、88.24%和11.76%。與ISO組相比，ISO+Zac組大鼠單個心肌細胞DADs發生率明顯降低(P<0.05)(Fig 4、5)。2.4Zac可增強ISO組大鼠下調的IK1在鉗制電位-100 mV和-60 mV時，ISO組心肌細胞IK1電流密度(pA/pF)分別為(-16.62±1.63)和(1.73±0.23)，與對照組(-20.36±1.40)和(2.38±0.15)相比明顯降低(P<0.05)。在給予15 μg·kg-1Zac后，ISO+Zac組IK1電流密度在-100 mV和-60 mV時分別達到(-26.95±1.12)和(4.04±0.40)，均明顯高于ISO組和對照組(P<0.05)(Fig 6)。可見Zac可有效消除ISO對IK1的抑制作用，增強心肌細胞IK1。

Fig 3　Zac significantly increased resting membrane potential(RMP) in isolated rat ventricular myocytes(n=10)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsISO.

Fig 4　Zac significantly inhibited DADs in isoproterenol-induced myocardial hypertrophic rat cardiomyocytes

DADs: delayed afterdepolarizations.

Fig 5　Bar graph showing Zac significantly inhibited incidence of DADs in isolated ventricular myocytes of isoproterenol-induced myocardial hypertrophic rats(n=17)

#P<0.05vsISO.

Fig 6　Zac effectively rescued IK1suppression to normal level in ventricular myocytes of isoproterenol-induced hypertrophic rats

A: RepresentativeIK1trace recorded using 500 ms, 10 mV voltage steps from -120 to+20 mV. Holding potential was set as -40 mV;B:Effects of Zac onIK1current-voltage(I-V) relationship in isolated rat ventricular myocytes in control, ISO and ISO+Zac group;C:Expand plots for the outward components ofIK1from B.

3　討論

心肌肥厚是心臟因長期壓力負荷過重而發生心力衰竭過程中的一個代償性階段，常伴有心律失常和心功能變化[17]。本研究通過腹腔注射大劑量ISO誘發大鼠心肌肥厚的慢性動物模型，首次觀測了Zac對心肌肥厚模型動物電活動的影響。結果表明，Zac可明顯降低ISO誘發的心肌肥厚模型動物的心律失常發生率。

我們進一步探討了Zac抑制模型動物心律失常發生的電生理機制。利用全細胞膜片鉗研究證實，Zac可明顯增大肥厚心肌細胞的IK1，增大RMP，抑制條件刺激下誘發的DADs，這些效應都是Zac抑制ISO誘發的心肌肥厚模型動物心律失常發生的重要機制。膜電位增大，可降低心肌細胞的興奮性；增加鈉通道的可利用度，提高心肌的傳導性；增大心肌靜息膜電導，減小膜電流變化引起的膜電位波動，增加膜的電穩定性[11]。這些變化都是與Zac激動IK1，導致膜電位增大相關的[10]。DADs一直被認為是觸發性心律失常的重要機制，它的發生與胞內鈣超載和內向鈉鈣交換電流增強相關[8]。心電圖ST段代表心室各部分心肌細胞處于去極化狀態，ST段抬高表示心肌缺血或損傷[6]，本研究中ST段抬高可能是ISO致心肌肥大，心肌代謝和耗氧量增加，從而出現心肌缺血。在研究中發現，Zac并不影響ST段改變，表明它并不干預心肌代謝與供血過程。

我們的研究結果證明了選擇性IK1通道激動劑Zac對心肌肥厚模型動物心律失常具有抑制作用，其機制可能與它通過增強IK1、抑制延遲后除極的效應有關。這為適度增強IK1通道是一條有效的抗心律失常途徑提供了新的實驗依據。

(致謝：本研究在山西醫科大學生理學系細胞生理學省部共建教育部重點實驗室完成，感謝實驗室提供的儀器及技術支持；感謝吳博威教授及趙錄英老師對實驗技術的指導。)

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Cardiac arrhythmia suppression byIK1channel agonist in isoproterenol-induced myocardial hypertrophic rats and investigation on its mechanism

CHEN Yi-chun1, LI Chao-hong2, YANG Ming-zhu1, WANG Xiao-lu1, FENG Qi-long1

(1.DeptofPhysiology,ShanxiMedicalUniversity,KeyLaboratoryofCellularPhysiologyofShanxiProvinceandMinistryofEducation,Taiyuan030001,China;2.theFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,HenanInstituteofNeurology,WeihuiHenan453000,China)

AimTo investigate the effect of zacopride(Zac) on cardiac arrhythmia in isoproterenol(ISO)-induced myocardial hypertrophic rats and the underlying electrophysiological mechanisms.Methods① Fifty-one rats were randomly divided into control group(n=17), ISO group(n=17) and ISO+Zac group(n=17). Rat model with cardiac arrhythmia and hypertrophy was established by intraperitoneal ISO(5 mg·kg-1) injection.② ECGs were recorded to observe the effects of Zac on arrhythmia in model rats.③ Whole-cell patch clamp was applied to record inwardly rectifier potassium current(IK1), resting membrane potential(RMP) and amplicated delayed afterdepolarizations(DADs).Results① Echocardiographic examination showed that, left ventricular end-diastolic dimension(LVEDD) and left ventricular end-systolic dimension(LVESD) significantly decreased in rats in ISO group compared with control group, whereas left ventricular posterior wall end-diastolic thickness(LVPWd) and interventricular septum end-diastolic thickness(IVSd) increased(P<0.05), suggesting rat model of isoproterenol-induced myocardial hypertrophy was successfully established.② ECGs showed that 88.89% of rats in ISO group had ventricular premature beats(VPBs), which significantly decreased to 11.11% after the application of Zac (P<0.05).③ Values of RMP decreased from (-71.05±1.27) mV in control group to (-69.38±1.21) mV in ISO group(P<0.05). After Zac administration, RMP significantly increased to (-73.86±1.33) mV compared with control and ISO group(P<0.05).④ DADs and TA incidence significantly decreased from 88.24% in ISO group to 11.76% in ISO+Zac group(P<0.05).⑤ Compared with control group,IK1density was markedly reduced in ISO group, whereas Zac could effectively rescueIK1suppression to normal level.ConclusionsZac, as a selectiveIK1channel agonist, can significantly inhibit cardiac arrhythmia in isoproterenol-induced myocardial hypertrophic rats, which is mainly attributed to increased RMP by enhancingIK1and subsequent suppression of DADs.

cardiac arrhythmia; inward rectifier potassium current; resting membrane potential; delayed afterdepolarizations; whole-cell patch clamp technique; myocardial hypertrophy

2016-03-15,

2016-04-18

國家自然科學基金資助項目(No 30900492)；山西省青年科學基金資助項目(No 2009021043-1)；山西省高校“131”領軍人才工程項目；山西省高等學校優秀青年學術帶頭人支持項目

陳依春(1990-)，女，碩士生，研究方向：心肌電生理，E-mail：15835116973@163.com；

封啟龍(1976-)，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：心肌電生理，通訊作者，E-mail:fengqilong@163.com

A

1001-1978(2016)08-1127-07

R-332；R322.11；R329.24；R541.702.2； R542.2

網絡出版時間：2016-7-19 10:43網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.038.html