3，5-二羥基甲苯與L-肌肽對酪氨酸酶的抑制作用

劉 臨，黃 浩

(1.江西宜春學院化學與生物工程學院，江西宜春 336000；2.江西宜春學院應用化學與化學生物學重點實驗室，江蘇宜春 336000)

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3，5-二羥基甲苯與L-肌肽對酪氨酸酶的抑制作用

劉 臨1，2，黃 浩1，2

(1.江西宜春學院化學與生物工程學院，江西宜春 336000；2.江西宜春學院應用化學與化學生物學重點實驗室，江蘇宜春 336000)

[目的]研究3，5-二羥基甲苯與L-肌肽對酪氨酸酶活性的抑制作用。[方法]從新鮮蜜梨中提取酪氨酸酶，以鄰苯二酚為底物，研究3，5-二羥基甲苯、L-肌肽對酪氨酸酶活性的影響。[結果]3，5-二羥基甲苯與L-肌肽對酪氨酸酶均有一定的抑制作用。[結論]L-肌肽對酪氨酸酶的抑制作用強于3，5-二羥基甲苯。

酪氨酸酶；3，5-二羥基甲苯；L-肌肽；抑制率

酪氨酸酶(EC1.14.18.1)[1-3]又稱多酚氧化酶，是黑色素代謝的關鍵酶，存在于植物、人和動物等多種生物組織中。黑色素對皮膚顏色和色素的沉積起決定性作用。它是一種金屬酶，含有銅離子，構成酪氨酸酶催化反應的活性中心，能夠催化單酚和二酚氧化成醌，并使醌在非酶促條件下形成終產物黑色素[4]。皮膚美白劑種類繁多，其中一大類通過抑制皮膚酪氨酸酶活性或阻斷生成黑色素的氧化反應，從而減少黑色素的生成達到增白美膚之效。皮膚美白劑的開發研究已成為推動美容護膚化妝品發展的一個重要方向，該類美白劑對酪氨酸酶活性抑制作用的強弱成為衡量其美白效果的重要指標[5-6]。

蜜梨酪氨酸酶具有單酚羥化酶和二酚加氧酶雙酶活性，單酚酶可以先羥化酪氨酸產生鄰二羥基苯丙氨酸(即L-多巴)，二酚酶再將其氧化成為相應的多巴醌，進一步反應后生成一系列引起褐化的色素類物質[7]。筆者通過酪氨酸酶催化反應后生成醌，而醌有顏色，在某個可見波長上有明顯吸收峰。生成醌的量越多，在此可見波長上的吸收值越大。同等條件下，加入3，5-二羥基甲苯、L-肌肽后醌的生成量會減少，在此可見波長上的吸收值變小。筆者以鄰苯二酚代替酪氨酸為底物，研究3，5-二羥基甲苯、L-肌肽對酪氨酸酶的抑制作用。

1　材料與方法

1.1材料供試材料為市場上購買的新鮮蜜梨。

1.2主要試劑3，5-二羥基甲苯(國藥集團化學試劑有限公司，化學純)，L-肌肽(天津一方科技有限公司，對照品)，鄰苯二酚(天津市永大化學試劑有限公司，分析純)，丙酮、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉(國產分析純)。

1.3主要儀器TGL20M高速臺式冷凍離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)，Lamada35紫外可見分光光度計(美國PE)，JJ-2B組織搗碎勻漿機(常州華冠儀器有限公司)，JB-5定時雙向恒溫磁力攪拌器(常州華冠儀器有限公司)，BSA224S-CW電子分析天平(上海皖寧精密科學儀器有限公司)，HH-4數顯恒溫水浴箱(國華電器)。

1.4方法

1.4.1酪氨酸酶的提取。

1.4.1.1 丙酮粉的制備[8]。取新鮮蜜梨果肉組織200 g，用塑料刀切碎塊放入高速組織搗碎機，同時加入冰丙酮320 mL(-25 ℃預泠)，攪拌8 min，混合液真空抽濾，直至成白色粉末，即得丙酮粉，-25 ℃下保存。

1.4.1.2酪氨酸酶液的制備。稱取丙酮粉4 g，加入80 mL磷酸緩沖液(pH 6.5)[9]，在-1 ℃下用磁力攪拌機勻漿40 min，放入冰凍高速離心機于-1 ℃、12 000 r/min離心40 min，取上清液即得酪氨酸酶粗提液。

1.4.2以鄰苯二酚為底物的酪氨酸酶最大吸收波長的確定。在比色杯中用微量移液管加入0.2 mL酶液，再將3.0 mL鄰苯二酚溶液(0.2 mol/L)用移液管加入，以3.0 mL鄰苯二酚溶液(0.2 mol/L)中加入0.2 mL雙蒸餾水為對照，在波長375～600 nm測定吸光度變化。

1.4.3抑制劑對酪氨酸酶的抑制。

1.4.3.1不同濃度3，5-二羥基甲苯對酪氨酸酶的抑制[10]。用pH 6.5的磷酸緩沖液配制0.2 mol/L的鄰苯二酚和1.0、3.0、5.0、8.0、10.0 mmol/ L的3，5-二羥基甲苯。

在比色杯中按順序加入0.1 mL酶液、0.1 mL蒸餾水、2.8 mL鄰苯二酚(0.3 mol/L)，以2.8 mL鄰苯二酚(0.2 mol/L)中加入0.2 mL雙蒸餾水為對照，立即于425 nm處掃描，并記錄30 s處的OD值(A)。

在比色杯中按順序加入0.1 mL酶液、0.1 mL各濃度的3，5-二羥基甲苯(分別做5個濃度的試驗)，再加入2.8 mL鄰苯二酚(0.2 mol/L)，以2.8 mL鄰苯二酚(0.3 mol/L)中加入0.2 mL雙蒸餾水為對照，立即于425 nm處進行掃描，并記錄30 s處的OD(B)。

3，5-二羥基甲苯以鄰苯二酚為底物對酪氨酸酶的抑制率計算公式：I=(A-B)/A×100%。

1.4.3.2不同濃度L-肌肽(L-camosine)對酪氨酸酶的抑制[11]。用pH 6.5的磷酸緩沖液分別配制0.1、0.25、0.50、0.75、1.0 mmol/ L的L-肌肽。在比色杯中按順序加入0.1 mL酶液、0.1 mL各濃度的L-肌肽(分別做5個濃度的試驗)，再加入2.8 mL鄰苯二酚(0.2 mol/L)，以2.8 mL鄰苯二酚(0.3 mol/L)中加入0.2 mL雙蒸餾水為對照，立即于425 nm處進行掃描，并記錄30 s處的OD值(C)。

L-肌肽以鄰苯二酚為底物對酪氨酸酶的抑制率計算公式：I=(A-C)/A×100%。

2　結果與分析

2.1酪氨酸酶的最大吸收波長經紫外可見分光光度計在波長375～600 nm處掃描，結果見圖1。由圖1可知，以鄰苯二酚為底物，在425 nm處有最大吸收峰，故蜜梨酪氨酸酶以鄰苯二酚為底物時，最大吸收波長為425 nm。

圖1　酪氨酸酶以鄰苯二酚為底物的吸收波長Fig.1　Absorption wavelength of tyrosinase with catechol as substrate

2.2以鄰苯二酚為底物時2種藥物對酪氨酸酶的影響

2.2.1不同濃度3，5-二羥基甲苯對酪氨酸酶的抑制。由圖2可知，3，5-二羥基甲苯對酪氨酸酶的抑制作用與濃度相關，濃度越大，抑制效果越明顯。當3，5-二羥基甲苯濃度達10 mmol/L時，其對酪氨酸酶的抑制率可達66.69%。

圖2　3，5-二羥基甲苯濃度與抑制率Fig.2　3,5-dihydroxytoluene concentration and inhibition rate

2.2.2不同濃度L-肌肽對酪氨酸酶的抑制。由圖3可知，L-肌肽對酪氨酸酶的抑制作用分為低濃度組(L-肌肽濃度在0.5 mmol/L以下)和高濃度組(L-肌肽濃度在0.5 mmol/L以上)，2種濃度的效果不同。L-肌肽低濃度組基本上對酪氨酸酶無抑制作用，L-肌肽高濃度組，濃度越大對酪氨酸酶的抑制作用越強。當L-肌肽濃度為1 mmol/L時，其對酪氨酸酶的抑制率為21.25%。

圖3　L-肌肽濃度與抑制率 Fig.3　L-camosine concentration and inhibition rate

3　結論與討論

3，5-二羥基甲苯又名苔黑酚或地衣酚，是一種重要的有機合成中間體，臨床上可做消炎藥，在醫藥領域有廣泛應用。L-肌肽是由β-丙氨酸和組氨酸構成的二肽(β-Ala-L-His)，臨床可做抗白內障藥物。以酪氨酸酶篩選化妝品美白添加劑時，經試驗比較，選擇從蜜梨提取酪氨酸酶，其酶活力較強，酶的最適pH和熱穩定性接近，但與從雪梨中提取的酪氨酸酶最大吸收波長有所不同[12]。由于酶活性對作用條件溫和的特殊要求，酪氨酸酶的提取和酶活測定極其重要，它直接關系到后面一系列試驗結果的準確性，因此，整個過程要嚴格按照要求進行試驗操作。

該研究結果表明，3，5-二羥基甲苯、L-肌肽對酪氨酸酶均有一定的抑制作用；在相同濃度下(3，5-二羥基甲苯、L-肌肽2種藥劑的濃度均為1 mmol/L時)，L-肌肽對酪氨酸酶的抑制作用(抑制率為21.25%)高于3，5-二羥基甲苯(抑制率為6.88%)。以鄰苯二酚為底物，L-肌肽對酪氨酸酶的抑制作用強于3，5-二羥基甲苯，且二者的抑制率均隨著濃度的增大而增大。該研究為2種藥劑作為化妝品美白添加劑以抑制黑色素的形成、祛除皮膚色斑提供了理論依據[12]。

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Inhibition Effect of 3,5-dihydroxytoluene and L-camosine on Tyrosinase Activity

LIU Lin1,2, HUANG Hao1,2

(1. College of Biological and Chemical Engineering, Yichun University, Yichun, Jiangxi 336000; 2. Key Laboratory of Jiangxi University for Applied Chemistry and Chemical Biology, Yichun University, Yichun, Jiangxi 336000)

[Objective] To study the inhibition effect of 3,5-dihydroxytoluene (DHT) and L-camosine on tyrosinase activity. [Method] The effects of 3,5-dihydroxytoluene and L-camosine on the activity of tyrosinase extracted from fresh snow pear were analyzed with catechol as substrate. [Result] Both 3,5-dihydroxytoluene and L-camosine had certain inhibition effect on tyrosinase activity. [Conclusion] The inhibition effect of L-camosine on tyrosinase activity was stronger than that of 3,5-dihydroxytoluene.

Tyrosinase; 3,5-dihydroxytoluene; L-camosine; Inhibition rate

劉臨(1964- )，男，江西高安人，高級實驗師，從事分析化學教學與研究。

2016-05-09

Q 55

A

0517-6611(2016)19-119-02