HPLC-DAD法測定化妝品中非法添加的21種磺胺類抗生素

錢葉飛，賈昌平

(蘇州市食品藥品檢驗所，江蘇　蘇州　215104)

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HPLC-DAD法測定化妝品中非法添加的21種磺胺類抗生素

錢葉飛，賈昌平

(蘇州市食品藥品檢驗所，江蘇蘇州215104)

建立高效液相色譜法同時測定化妝品中非法添加21種磺胺類抗生素的檢測方法。采用Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，以甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫，流速為0.9 mL·min-1，柱溫為33 ℃，檢測波長為268 nm。21種磺胺類成分的線性范圍為1.0～40.0 μg·mL-1(磺胺二甲基噠嗪、磺胺喹惡啉和磺胺硝苯的線性為0.5～20.0 μg·mL-1)，相關系數均大于0.99。方法的檢出限為0.09～0.36 μg·mL-1，平均回收率在89.1%～112.8%之間，相對標準偏差小于9%。該方法簡單，準確，分離效果好，能夠滿足化妝品中磺胺類物質的檢測。

磺胺類藥物；高效液相色譜法；化妝品

近年來，許多化妝品品牌推出了防曬、美白、祛斑、祛痘的功效的產品，國內市場日益繁榮，而化妝品也成為人們日常生活中的必備品。然而，有不法商家為謀取暴利，在產品中添加了能增加其功效而可能損害身體健康的物質-磺胺類抗生素。文獻表明使用過多的磺胺類抗生素最終會導致人體產生耐藥性[1]。我國的《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中也明確規(guī)定了磺胺類抗生素為化妝品組分中的禁用物質[2]。這就需要建立一種全面準確檢測化妝品中磺胺類物質的分析方法。目前磺胺類藥物的檢測方法有很多，如滴定法、分光光度法、薄層色譜法、毛細管電泳法、流動注射分析法、近紅外光譜法、原子吸收光譜法、免疫測定法、液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-質譜法、氣相色譜-質譜法等。HPLC法是化妝品中檢測磺胺類藥物最常用的方法。楊艷偉等[3]采用HPLC法測定化妝品中11中磺胺類化合物。李潔等[4]采用HPLC法同時測定化妝品中9種磺胺。沈宋利等[5]采用超聲萃取-高效液相色譜法測定膏類化妝品中14種磺胺類物質。本實驗結合前人工作經驗，采用較為常用的HPLC-DAD法，建立同時測定化妝品中非法添加21種磺胺類抗生素的分離檢測方法，并進行方法學驗證。用此方法對市場上的13種祛痘類化妝品進行檢測，結果表明該方法簡單，準確，分離效果好，能夠較為全面監(jiān)測化妝品中磺胺類抗生素。

1　實　驗

1.1儀器、試劑與材料

Waters e2695型高效液相色譜儀，配有2998 型二極管陣列檢測器，Waters公司，Synergy system型超純水儀，密理博公司，KQ-300DA型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司，Thermo Scientific HERAEUS BIOFUGE PRIMOR型高速離心機；甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純，其他試劑為分析純，實驗用水為超純水。

21種磺胺對照品：磺胺、磺胺胍、磺胺乙酰、磺胺嘧啶、磺胺二甲異嘧啶鈉、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲惡唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲噻二唑、琥珀?；前粪邕?、磺胺甲惡唑、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺二甲異惡唑、磺胺多辛、磺胺二甲基噠嗪、磺胺硝苯、磺胺喹惡啉，均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

對照溶液制備：分別精密稱取21種磺胺類藥物對照品10 mg，分別置10 mL棕色容量瓶中，加入適量2%甲醇溶液，渦旋使溶解，加2%甲醇溶液至刻度。即得質量濃度為1 mg·mL-1的標準儲備液(注：其中磺胺胍需加入鹽酸溶液溶解，而琥珀?；前粪邕?、磺胺喹噁啉、磺胺硝苯則需加入氫氧化鈉溶液使之溶解)。

取上述對照品溶液各1 mL于25 mL容量瓶中(磺胺二甲基噠嗪、磺胺喹惡啉、磺胺硝苯各取0.5 mL)，加2%甲醇溶液至刻度，混勻，即得磺胺二甲基噠嗪、磺胺喹惡啉、磺胺硝苯濃度均為20 μg·mL-1，而其他18種對照品的質量濃度均為40 μg·mL-1的混合對照品儲備液。

1.2樣品處理

準確稱取化妝品約1.0 g于10 mL刻度離心管中，加入2%甲醇溶液適量，渦旋，加甲醇溶液至刻度，搖勻(必要時可加入氯化鈉破乳)，于15000 r·min-1高速離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液供高效液相色譜測定。整個操作在避光條件下進行。

加標樣品：精密稱取陰性樣品約1.0 g，置10 mL刻度離心管中，加入一定量的混合對照品溶液，再加入適量2%甲醇溶液，渦旋，定容至刻度。將溶液以15000 r·min-1高速離心10 min，取上清液過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液用于高效液相色譜測定。

1.3實驗條件

圖1　21種磺胺標準品混合色譜圖

色譜條件：色譜柱：Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相：以甲醇為流動相A，以0.1%甲酸為流動相B，進行梯度洗脫0～6 min 3%A，6～15 min 3%～19%A，15～22 min 19%～23% A，22～26 min 23%～24% A，26～34 min 24% A，34～36 min 24%～60% A，36～45 min 60%～95% A，45～50 min 95% A；流速：0.9 mL·min-1；柱溫：

33 ℃；樣品室溫度：4 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：268 nm。將混合對照品溶液在該條件下進樣測定，記錄色譜圖(見圖1)，從色譜圖中可以看出21種標準物質分離良好。

2　結果與討論

2.1實驗條件的考察

2.1.1色譜條件的優(yōu)化

檢測器選擇二極管陣列檢測器，是因為與傳統(tǒng)的紫外檢測比較，其能夠對色譜峰進行光譜掃描，且掃描所得的特征吸收峰能夠進一步了解物質的信息，可增強方法的專屬性?；前奉愃幬镌?50～290 nm波長區(qū)間有較強的吸收，考慮所有物質的紫外吸收，選擇268 nm較為合適。

由于所分析的21種磺胺類抗生素極性差異較大，所以采用梯度洗脫。為了獲得良好的分離效果，本實驗對流動相進行了優(yōu)化。有機相選擇了甲醇，可獲得良好分離效果?？紤]到磺胺類藥物的結構中含有伯胺基和磺酰胺基，呈酸堿兩性，在水相中加入酸，可以抑制弱堿性的氨基解離。本實驗參照文獻比較了0.1%甲酸[6]、0.1%磷酸[7]、0.1%乙酸[8]添加到含水流動相中的分離情況，0.1%磷酸和0.1%乙酸分離效果均不理想。最終確定選用0.1%甲酸為水相。

色譜柱溫的變化會直接影響磺胺類抗生素的分離效能和分析速度，溫度升高，化合物保留時間縮短，分離度減小，可能影響基線分離；溫度降低，可使色譜柱選擇性增大，有利于組分的分離和色譜柱穩(wěn)定性提高。本實驗分別考察柱溫為30 ℃、33 ℃和35 ℃時的分離情況。比較不同溫度下的色譜圖，可以看出，33 ℃的柱溫是最好的選擇。

2.1.2提取溶劑的選擇

磺胺類藥物是含有對氨基苯磺酰胺結構的一類藥物，對光不穩(wěn)定，所以在配制對照品溶液時，要避光操作。因大多數磺胺類藥物能溶于甲醇，首先選擇了50%的甲醇溶液，然而，進樣檢測后發(fā)現，出現了很強的溶劑效應，嚴重影響了弱保留物質的峰型。降低甲醇的百分含量，選用2%甲醇作為提取溶液，達到了很好的效果。期間，對于一些難溶的磺胺類藥物，加酸(鹽酸)或加堿(氫氧化鈉)使之溶解。對于大多數化妝品，以2%甲醇水溶液提取，高速離心后，上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣。

2.2方法學考察

2.2.1線性

將上述“1.1”中配制好的混合對照品儲備液逐級稀釋成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg·mL-1，其中磺胺二甲基噠嗪、磺胺喹惡啉、磺胺硝苯的質量濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg·mL-1。將這一系列不同質量濃度的混合標準溶液進樣測定，記錄色譜圖，以峰面積y為縱坐標，濃度x為橫坐標，進行線性擬合，從而得到線性方程和相關系數?；前范谆鶉}嗪、磺胺喹惡啉和磺胺硝苯的線性范圍為0.5～20.0 μg·mL-1，其余成分的線性范圍為1.0～40.0 μg·mL-1。結果見表1。

表1　21種磺胺類標準品線性關系、LOD、LOQ、精密度、回收率及穩(wěn)定性

2.2.2檢出限(LOD)與定量限(LOQ)

取陰性樣品按“1.2”中加標樣品的制備方法，加入稀釋一定倍數混合對照品溶液，進樣，測定其信噪比。根據測得的信噪比，按比例相應的減小或增加進樣濃度，根據21種對照品S/N=3時溶液濃度計算檢出濃度，S/N=10時溶液濃度計算定量濃度，結果見表1。

2.2.3回收率和精密度試驗

以不含磺胺類藥物非法添加的化妝品為基質，分別在3個添加水平進行回收率測定?；前范谆鶉}嗪、磺胺硝苯、磺胺喹惡啉3個添加水平為0.5、1、2.5 μg·mL-1，其余均為1、2、5 μg·mL-1，結果發(fā)現21種物質的平均回收率在89.1%～112.8%之間，相對標準偏差小于9%(詳見表1)，表明方法的準確度較好。將混合對照品溶液按“1.3”的色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄各物質色譜峰面積。結果顯示，各化合物的峰面積RSD值均小于2%，表明儀器精密度良好，結果見表4。

2.2.4穩(wěn)定性

磺胺類抗生素本身是不穩(wěn)定的物質，遇光容易發(fā)生變質，易降解。針對物質的不穩(wěn)定性，本次實驗采取了兩個措施，第一，整個實驗過程中避光操作；第二，HPLC的樣品室溫度調至4 ℃。在該條件下，取濃度為1.0、10.0、40.0 μg·mL-1的磺胺對照品混合溶液，于自動進樣器中，分別于1、2、4、8、12、24 h進樣，計算峰面積，考察24 h的穩(wěn)定性，結果顯示穩(wěn)定性良好。

2.3樣品測定

按照“1.2”方法處理樣品，并在“1.3”條件下進樣測定，根據樣品的色譜圖和光譜圖來判斷樣品中是否含有磺胺類藥物。選擇了市場上13種祛痘類化妝品進行檢測，首先根據保留時間比對色譜峰，然后，比較疑似峰與目標物質峰的光譜圖，進一步確認。結果13種化妝品均未檢出21種磺胺類藥物。

3　結　論

本文建立了HPLC-DAD同時檢測化妝品中非法添加21種磺胺類抗生素的方法。通過單因素實驗對影響色譜分離及化合物提取的主要因素做了考查，最終確定了合適的流動相種類、柱溫、洗脫梯度及提取溶劑，取得了良好的分離效果。對所建立的分析方法進行的方法學驗證表明該方法線性回收率良好、靈敏度高，適用于化妝品中非法添加磺胺類抗生素的定性、定量檢測，為化妝品監(jiān)管、規(guī)范化妝品市場及維護消費者的切身利益提供有力的技術支撐。

[1]J E Hyde, P F Sims.Sulfa-drug resistance in plasmodium falciparum[J].Trends in Parasitology,2001,17(6)：265-266.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部.化妝品衛(wèi)生規(guī)范[S].2007.

[3]楊艷偉,朱英.HPLC法測定化妝品中11種磺胺類化合物[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2006,16(11):1343-1344.

[4]李潔,王萍,鄭和輝.HPLC法同時測定化妝品中9種磺胺[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2009,19(11):2526-2527.

[5]沈宋利,盧珩俊,陶松,等.超聲萃取-高效液相色譜法測定膏類化妝品中14種磺胺類物質[J].分析試驗室,2013,32(10):121-124.

[6]馬強,王超,王星,等.化妝品中21中磺胺類藥物的高效液相色譜檢測及質譜確證[J].分析測試學報,2008,27(S1):211-215.

[7]李俊鎖,李西旺,魏廣智,等.雞肝組織中磺胺類藥物多殘留分析法[J].畜牧獸醫(yī)學報,2002,33(5):468-472.

[8]楊曉松,余輝菊,邱莎.基質固相分散萃取-高效液相色譜-熒光檢測法測定動物性食品中磺胺類藥物殘留[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2013,23(5):1109-1112.

Determination of 21 Sulfonamides Illegally Added into Cosmetics by HPLC-DAD

QIANYe-fei,JIAChang-ping

(Suzhou Institute for Food and Drug Control, Jiangsu Suzhou 215104, China)

To establish a method for determination of 21 sulfonamides illegally added into cosmetics, the high performance liquid chromatography with photodiode array detector (HPLC-DAD) was adopted. The analysis was performed on a waters symmetry C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)column with methanol and 0.1% formic acid aqueous solution as mobile phase by gradient elution. The flow rate was 0.9 mL·min-1and column temperature was 33 ℃. The detection wavelength was set at 268 nm. The linearity ranged from 1.0 to 40.0 μg·mL-1, with correlation coefficients more than 0.99. The limits of quantification were 0.09～0.36 μg·mL-1. The average recoveries at three spiked levels ranged from 89.1% to112.8% with RSDs of less than 9%. The method was simple, accurate and had a good separation efficiency, which can be used for the determination of sulfonamides added into cosmetics.

sulfonamides; high performance liquid chromatography(HPLC); cosmetics

錢葉飛(1987-)，男，中藥師，主要從事化妝品檢驗工作。

賈昌平(1984-)，男，博士，主管藥師，主要從事化妝品檢驗方法開發(fā)。

TQ658

A

1001-9677(2016)010-0150-03