酸解增敏同步熒光測動物食品中頭孢拉定殘留

李月秋，徐璐璐，吳錦濤，韓媛媛，邸科前，李軍（.河北大學綜合實驗中心醫學綜合實驗中心，河北保定07000；.河北大學預防醫學與衛生事業管理系，河北保定07000）

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酸解增敏同步熒光測動物食品中頭孢拉定殘留

李月秋1，徐璐璐2，吳錦濤2，韓媛媛1，邸科前1，李軍1
（1.河北大學綜合實驗中心醫學綜合實驗中心，河北保定071000；2.河北大學預防醫學與衛生事業管理系，河北保定071000）

基于頭孢拉定酸性降解產物熒光強度更強，吐溫-20能提高降解產物熒光強度，建立測定動物性食品中頭孢拉定殘留量的同步熒光分光光度法。對降解介質及波長差進行了選擇，討論加熱時長、硫酸體積、pH值、表面活性劑種類及用量對降解產物熒光強度的影響。結果：選擇1.5 mL 2.0 mol/L硫酸溶液，加熱120 min，用Na2CO3-NaHCO3緩沖液調pH值到10.6，加入1 mL 5%吐溫-20溶液，在1 cm熒光比色皿中，于發射波長λem420 nm～550 nm內，△λ為90 nm條件下掃描測定，468 nm處讀出熒光強度。應用加入乙腈沉淀蛋白的方法對動物性食品進行前處理。在0.02 μg/mL～2.00 μg/mL范圍內，頭孢拉定濃度與降解產物熒光強度呈良好線性關系，相關系數為0.999 2，檢出限為2.17 ng/mL。加標水平在0.4μg/mL～0.6μg/mL范圍內，回收率為93.91%～96.90%，RSD為0.50%～0.90%（n=3）。建立的新方法可用于動物性食品中頭孢拉定殘留量檢測。

頭孢拉定；酸性降解；吐溫-20增敏；動物性食品；同步熒光分光光度法

我國政府已將食品安全問題上升到了與社會穩定相關的高度，我國應加大力度解決動物性食品中獸用抗菌藥殘留超標，生鮮乳違禁物質濫用，蔬菜、水果、茶葉中禁限用高毒農藥殘留超標等突出問題，并應針對這些問題著手建立食品安全保障體系。此體系中，對動物性食品中獸藥殘留進行快速、準確檢測無疑是一個關鍵環節。

頭孢拉定是第一代頭孢烯類β-內酰胺抗生素。臨床主要用于呼吸道、泌尿道、皮膚和軟組織等感染。因其具有良好抗菌作用，被廣泛應用于畜禽疾病治療預防中。由于其具有腎毒性和容易引起胃腸功能紊亂，在動物性食品中殘留會影響人類身體健康。

目前，我國對頭孢拉定測定方法很多：中國藥典測定頭孢拉定［1］含量的方法為高效液相色譜法（HPLC），同時該法也是現階段最為常見的檢測方法之一，主要用于膠囊［2］、藥物［3］、血液［4］、尿液［5］、牛奶［5］等樣品檢測。該方法檢測靈敏度高、自動化程度高、結果重現性好；但需使用大量有機溶劑，檢測成本高，且易造成環境污染；前處理過程復雜，不利于快速檢測；對檢測人員要求較高，不易推廣。

其他方法還有電化學分析法［6］，流動注射化學發光法［7-8］，紫外分光光度法［9-10］，毛細管電泳法［11-12］，質譜聯用［13-14］，熒光分光光度法［15-17］等。電化學分析法應用不是十分普遍，流動注射化學發光法存在著選擇性差的問題，紫外法檢測靈敏度低，毛細管電泳應用于痕量分析時需要通過一定的技術手段進行富集以提高靈敏度。質譜聯用雖然靈敏度高，選擇性好，但是不便普及。

熒光法具有便于普及，選擇性好，靈敏度高，新技術多等優點。目前主要用于藥物中頭孢拉定含量測定。何文亮［17］等研究了頭孢拉定堿性降解反應，建立了表面活性劑增敏熒光分光光度法測定牛奶中頭孢拉定含量。同步熒光光譜法是熒光光譜分析新技術之一，應用最多的是最早提出的恒波長同步熒光法，具有譜帶窄化，光譜重疊少，散射光影響小等優點，有利于進一步提高檢測靈敏度，減少共存組分干擾。

目前，國內外鮮見頭孢拉定酸性降解后，表面活性劑增敏同步熒光法檢測動物性食品中頭孢拉定殘留量的報道。本研究將以探討頭孢拉定酸性降解反應為開端，過程中應用表面活性劑對其進行增敏，最后采用同步熒光法對動物性食品中頭孢拉定殘留量進行測定，以達到進一步提高檢測靈敏度，建立一種便于日常跟蹤監測的方法的目的。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

RF-5301PC型熒光分光光度計、AUW120D電子天平：日本島津；FE20型酸度計：瑞士梅特勒；Milli-Q Advantage A10超純化水機：法國密理博；TGL-20B高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；SK-1型快速混勻器：常州國華電器有限公司。

1.0mg/mL頭孢拉定標準溶液：稱取頭孢拉定標準對照品（中國藥品生物制品檢定所）0.1 g溶于水中，定容至100 mL棕色容量瓶中，并置于冰箱中避光冷藏保存。

硫酸，氫氧化鈉，醋酸，醋酸鈉，十二烷基硫酸鈉（SDS），十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），十六烷基三甲基氯化銨（CTAC），吐溫-20，吐溫-80，三羥甲基氨基甲烷（Tris），鹽酸，磷酸氫鈉，氫氧化鈉，碳酸鈉，碳酸氫鈉等試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2方法

1.2.1樣品預處理

1.2.1.1牛奶樣品前處理

取5 mL牛奶樣品于10 mL離心管中，加入3 mL乙腈快速渦旋混勻10 min，在5 000 r/min條件下離心30 min，吸取上清液作為待測樣品。

1.2.1.2豬肉樣品前處理

將市售豬肉切碎勻漿，取5 g置于10 mL的離心管中，加入3 mL乙腈快速渦旋混勻10 min，于8 000 r/min條件下離心60 min，取出上清液作為待測樣品。

1.2.1.3蝦樣品前處理

市售蝦處理方法同市售豬肉。

1.2.2樣品測定

3種樣品分別取1.0 mL置于編號1、2、3的3只具塞比色管中，在各管中依次加入1.5 mL 2.0 mol/L的硫酸溶液，加水定容至5 mL，沸水浴中加熱120 min后取出，用冰水迅速冷卻至室溫，然后加入2.0 mol/L NaOH溶液調節pH值至中性，然后加入Na2CO3-NaHCO3緩沖液調pH值到10.6，加入1 mL 5%的吐溫-20溶液，加水定容至10 mL，渦旋混勻1 min，避光放置2 min，將樣品溶液分別置于1 cm熒光比色皿中，在發射波長λem420 nm～550 nm范圍內，發射波長和激發波長的波長差為90 nm（△λ=90 nm）條件下分別掃描樣品，在468 nm處讀出熒光強度。

1.2.3標準曲線和檢出限

配置一系列不同濃度的頭孢拉定標準溶液，按照1.2.2的實驗條件測定，以頭孢拉定的濃度為橫坐標，降解產物的熒光強度為縱坐標，作圖得到標準曲線。標準曲線回歸方程為Y=450.83X+14.19（r=0.999 2）。結果表明：在0.02 μg/mL～2 μg/mL范圍內，頭孢拉定濃度與降解產物熒光強度呈良好線性關系。

根據IUPAC（3δ）［18］的規定，由公式：D=3×δ/k（D為檢出限，k為工作曲線斜率，δ為11份空白溶液熒光強度標準差），求得檢測限為2.17 ng/mL。

1.2.4精密度和回收率

取市售牛奶9份，每份5 mL，按其濃度的80%，100%，120%，分別加入頭孢拉定對照品各3份，按照1.2.1.1的樣品前處理方法并按照1.2.2的樣品測定方法，測定平均回收率和精密度。

1.2.5穩定性

將按照1.2.2方法處理好的標準品溶液在避光條件下，分別在0、0.5、1、2、4、8、12、24 h內進行測定，樣品熒光強度的RSD為0.7%。結果表明，頭孢拉定酸解產物在24 h內穩定性良好。

2　結果與討論

2.1同步熒光分光光度法條件選擇

2.1.1降解介質選擇

研究了頭孢拉定在不同降解介質中的熒光強度。結果見表1。

表1　不同介質降解產物的熒光強度Table 1　Fluorescence intensities of cephradine’s degradation product in different degradation medium

試驗證明：頭孢拉定在水介質中只有少量的熒光物質產生，在酸性和堿性介質中熒光強度都明顯增強，酸性介質中降解產物的熒光強度明顯高于堿性介質中降解產物的熒光強度。

2.1.2波長差（△λ）選擇

按照試驗方法，在波長差△λ分別為40、50、60、70、80、90、100、110、120 nm的條件下測定頭孢拉定酸解產物的熒光強度。熒光掃描和同步熒光掃描光譜圖見圖1，同步掃描峰形變窄，有利于減少干擾，且靈敏度有所提高。

由測定結果可知，隨著波長差的△λ的增加，頭孢拉定酸解產物的熒光強度呈先增長后降低的趨勢，當△λ=90 nm時，熒光強度達到最大值。所以選用△λ= 90 nm進行后續研究。

圖1　熒光與同步熒光光譜圖Fig.1　Fluorescence and synchronous fluorescence spectrum

2.1.3加熱時長對熒光強度影響

取頭孢拉定標準溶液置于具塞比色管中，依照已建立的實驗方法，考察不同加熱時間（30、45、60、90、120、135、150 min）下降解產物的熒光強度。結果表明：反應時間越長，降解產物的熒光強度越大；當反應時間大于120 min時，頭孢拉定的酸解產物的熒光強度趨于穩定，可認為頭孢拉定已酸解完全。所以綜合考慮，沸水浴加熱時間選擇120 min。

2.1.4硫酸體積對熒光強度影響

取頭孢拉定標準溶液置于具塞比色管中，依照已建立的實驗方法，考察2 mol/L硫酸體積（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL）對降解產物熒光強度的影響。結果表明：隨硫酸溶液用量增加，體系的熒光強度不斷增強，當硫酸溶液的加入量超過1.5 mL時體系的熒光強度增加趨于平緩，所以實驗選擇加入1.5 mL 2.0 mol/L的硫酸溶液。

2.1.5pH對熒光強度影響

按照已建立的方法，考察了醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.0）、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉（pH5.8、7.0、8.0），Tris-鹽酸緩沖液（pH 7.10、8.00、8.90），碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（pH10.14、10.53）對降解產物熒光強度的影響見圖2。

圖2　pH值對頭孢拉定酸解產物熒光強度影響Fig.2　Effect of pH on fluorescence intensities of cephradine’s degradation product in acid medium

結果如圖2所示，隨著所用緩沖液pH值增大熒光強度有增大的趨勢，當pH值為10.60時熒光強度最大；當pH值超過10.60時，熒光強度隨pH值增大而減小。因此，試驗選擇加入碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液將pH值調到10.60。

2.1.6表面活性劑對熒光強度影響

應用表面活性劑可將被測分子包裹于膠束內，使其避免因碰撞而發生無輻射去激，從而可提高熒光物質的熒光強度，因此，向反應產物中加入表面活性劑以提高其靈敏度。試驗中考察了不同表面活性劑（SDS、CTAB、CTAC、吐溫-80、吐溫-20）對頭孢拉定降解產物熒光強度（F）的影響，見圖3～圖4。

圖3　未增敏及吐溫-20增敏的頭孢拉定酸解產物同步熒光光譜圖Fig.3　Synchronous fluorescence Spectrum of cephradine’s degradation product in acid medium added Twain-20 and not

圖4　表面活性劑對頭孢拉定酸解產物熒光強度影響Fig.4　Effect of surfactant on fluorescence intensities of cephradine’s degradation product in acid medium

結果表明：向反應體系中加入表面活性劑可使熒光強度明顯增大；試驗中發現吐溫-20對頭孢拉定降解產物的熒光強度的提高最為明顯。故選擇吐溫-20作為體系的增敏劑。

2.1.7吐溫-20體積分數對熒光強度影響

表面活性劑對熒光強度的增強作用與表面活性劑的濃度有關。因此，考察了體積分數分別為0.5%、2.5%、5%、7.5%、10%時吐溫-20對頭孢拉定降解產物的增敏效果。結果顯示：當吐溫-20體積分數為5%時，頭孢拉定酸解體系的熒光強度達到最大值。所以試驗選用吐溫-20溶液的濃度為5%。

2.2樣品測定

2.2.1樣品前處理條件選擇

取牛奶樣品適量，分別向其中加入乙腈，分別在3 000、5 000、6 000、7000 r/min的轉速下離心各15、30、45、60 min。結果表明：轉速5 000 r/min時離心30 min，牛奶中含有的蛋白等雜質已基本沉淀完全，不會干擾測定。

對豬肉及蝦樣分別進行了如上討論，結果表明：在轉速8 000 r/min時離心60 min，豬肉及蝦蛋白等雜質已基本沉淀完全，不會干擾測定。

2.2.2精密度和回收率

按照1.2.4節中精密度和回收率的測定方法，平均回收率及精密度的結果見表2。

表2　平均回收率及相對標準偏差（n=3）Table 2　Determination results of average recovery and RDS（n=3）

2.2.3測定結果

按照1.2.1節中的樣品前處理方法對樣品進行前處理，按照1.2.2實驗條件對樣品進行測定，結果如表3。

表3　樣品測定結果Table 3　Determination results of samples

3　結論

本研究探索建立了酸解吐溫-20增敏動物性食品中頭孢拉定殘留量的同步熒光檢測方法。應用硫酸酸解，加入吐溫增敏，在△λ為90 nm條件下同步掃描測定條件下，頭孢拉定在0.02 μg/mL～2.00 μg/mL范圍內，其濃度與降解產物熒光強度呈良好線性關系，相關系數為0.999 2，檢出限為2.17 ng/mL。加標水平在0.4 μg/mL～0.6 μg/mL范圍內，回收率為93.91%～96.90%。本文建立的方法選擇性好、精密度高、穩定性好、儀器設備簡單；與已報道的研究相比［17］，靈敏度有了明顯提高。該方法可為動物性食品中頭孢拉定藥物殘留檢測提供新方法，也能為食品中藥物殘留檢測研究提供新思路。

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Synchronous Fluorimetric Determination of Residue Cephradine by Acidly Degraded and Sensitized in Animal Food

LI Yue-qiu1，XU Lu-lu2，WU Jin-tao2，HAN Yuan-yuan1，DI Ke-qian1，LI Jun1
（1.Center of Medical Comprehensive Experimental，Center of Comprehensive Experimental，Hebei University，Baoding 071000，Hebei，China；2.Preventive Medicine and Health Management，Hebei
University，Baoding 071000，Hebei，China）

A new synchronous fluorescence spectrophotometry method was developed for the determination of trace cephradine in animal food.The method was based on the condition that Cephradine was degradated in acidic condition and fluorescence intensity of its degradation product was increased by Twain-20.The degradation condition and wavelength difference（△λ）were selected.The effects of heating time，the volume of sulfuric acid，pH，the effect of type and amount of surface active agent on the fluorescence intensity of degradation product were discussed.The results showed：1.5 mL 2.0 mol/L sulfuric acid was selected，heating time was 120 min，the buffer of Na2CO3-NaHCO3was used to increasing pH to 10.6，1 mL 5%Twain-20 solution was added.The standard and sample solution were putted into 1cm fluorescence cuvette，Synchronous fluorescence spectrums were scaned from 420 nm to 550 nm，△λ was 90，the fluorescence intensities were readed at 468 nm. The protein in food sample were precipitaded by acetonitrile.In the range of 0.02 μg/mL-2.00 μg/mL，the concentration of cephradine and the fluorescence intensity of its degradation product had good linearity，the correlation coefficients was 0.999 2，the detection limit was 2.71 ng/mL.At spiked levels of 0.40 μg/mL to 0.60 μg/mL，the recoveries were 93.91%to 96.90%，the relative standard deviation was 0.50%to 0.90%（n=3）.The new method could be used for residue cephradine in animal food.

cephradine；acid degradation；Twain-20 sensitization；animal food；synchronous fluorescence spectrophotometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.029

河北省省級科技計劃自籌經費項目（15275511）

李月秋（1977—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品有害污染物殘留分析。

2015-06-17