急性腦梗死患者血清中miR-21-5p與炎性因子的相關性分析

虞莉娜，席剛明，劉進香，趙忠新

(1.上海市徐匯區中心醫院神經內科，上海 200031；2.第二軍醫大學附屬長征醫院神經內科，上海 200003)

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·論著·

急性腦梗死患者血清中miR-21-5p與炎性因子的相關性分析

虞莉娜1，席剛明1，劉進香1，趙忠新2*

(1.上海市徐匯區中心醫院神經內科，上海 200031；2.第二軍醫大學附屬長征醫院神經內科，上海 200003)

目的探討急性腦梗死患者外周血miR-21-5p與炎性因子白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、IL-8、C反應蛋白(C-reactionprotein，CRP)的相關性。方法收集首次發病的急性腦梗死患者64例，病程24～48 h，同期選擇健康體檢者60例為對照組。實時熒光定量PCR方法檢測2組血清中miR-21-5p的表達量，ELISA檢測血清IL-6、IL-8及CRP的水平，并與miR-21-5p進行相關性分析。分別在入院時及出院后檢測急性腦梗死患者的美國國立衛生研究院卒中量表(NIH Stroke Scale，NIHSS)評分和日常生活活動能力(Activities of Daily Living,ADL)評分。結果腦梗死組血清miR-21-5p、IL-6、IL-8、CRP水平均高于對照組，且miR-21-5p與IL-6、IL-8、CRP表達水平均呈正相關。出院后miR-21-5p相對低表達組NIHSS評分低于miR-21-5p相對高表達組，ADL評分高于miR-21-5p相對高表達組。結論急性腦梗死患者血清中miR-21-5p表達上調與血清炎性因子IL-6、IL-8以及CRP的水平呈正相關。miR-21-5p有可能作為預測急性腦梗死預后的一種潛在的生物學標志。

腦梗死；微RNAs；白細胞介素類;C反應蛋白質

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.06.004

腦梗死是我國發病率、致殘率、病死率都很高的疾病。因此，深入研究能反映急性腦梗死病理生理改變的血液生物標記物，對于早期診斷疾病，指導臨床治療具有重要意義。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一類21～23 nt的內源性非編碼單鏈RNA，參與生物體多種生物學過程[1]。外周血miRNA具有不易降解、檢測方法敏感、準確等特點，成為臨床潛在的診斷、鑒別疾病的新型標志物[2]。多種miRNA參與了腦缺血相關的病理生理過程: miR-30可以調節腦梗死小鼠缺血誘導的細胞凋亡[3]；miR-207/352可以調節腦梗死患者的溶酶體相關的膜蛋白和酶的表達[4]。以往關于miRNA與腦缺血梗死的研究主要集中于動物實驗和細胞學研究，臨床上腦缺血梗死患者血清miRNA表達水平與炎癥因子的相關性及預后的關系未見詳細報道。本研究旨在探討急性腦梗死患者血清中miR-21-5p和相關炎性因子的表達，并分析其相關性，現將結果報告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2013年4月—2014年5月上海市徐匯區中心醫院神經內科收治的首次發病的急性腦梗死患者(腦梗死組)64例，男性36例，女性28例，年齡45～72歲，平均(56.2±7.8)歲，病程24～48 h。按腦梗死面積[5]分為：①大梗死25例，超過一個腦葉，梗死灶最大徑>5 cm；②中等梗死26例，小于一個腦葉，梗死灶最大徑>3～5 cm;③小梗死3例，梗死灶最大徑>1.5～3 cm；④腔隙性梗死10例，梗死灶最大徑≤1.5 cm。均經頭顱CT或MRI證實。選擇同期在門診進行體檢的非腦梗死體檢者60例為對照組，男性34例，女性26例，年齡44～71歲，平均(54.8±6.7)歲。2組性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

所有研究對象均取得知情同意。

1.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)使用miRVana miRNA Isolation Kit試劑盒(Ambion/Life technologies, Grand Island, NY, USA) 按照操作要求提取總RNA。qRT-PCR實驗時，先用逆轉錄酶M-MLV和核酸酶抑制劑RiboLock(Applied Biosystems, Foster City, Calif)將RNA逆轉錄為互補脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)，使用SYBR(GenePharma,Shanghai, China) 在IQ-5(Bio-Rad，美國)上進行qRT-PCR。程序為：95 ℃預熱10 min；94 ℃變性15 s；55 ℃退火30 s, 70 ℃延伸30 s，50個循環。利用逆轉錄酶M-MLV將RNA反轉錄生成 cDNA，實時定量 PCR擴增，結果以U6的相對量校正，采用 2-△△Ct法計算并統計。PCR引物由上海生工公司合成。

1.3血清炎性因子檢測血清白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、IL-8、C反應蛋白(C-reactionprotein，CRP)水平均采用酶聯免疫吸附測定法進行檢測，試劑盒購自上海生物科技有限公司。所有檢測項目均取多次檢測數據的平均值為準，且均由資深檢驗人員進行檢查統計。

1.4觀察項目急性腦梗死患者于入院時和出院3個月時檢測美國國立衛生研究院卒中量表(NIH Stroke Scale，NIHSS NIHSS)和日常生活活動能力(Activities of Daily Living, ADL)評分(Barthel指數)，以評定神經功能缺損程度和患者日常生活能力。

2　結　　果

2.12組血清miR-21-5p和相關炎性因子水平比較腦梗死組miR-21-5p、IL-6、IL-8、CRP表達水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05) 。見表1。

2.2腦梗死組血清miR-21-5p與炎性因子的相關性腦梗死患者血清miR-21-5p與炎性因子IL-6、IL-8、CRP表達水平均呈正相關(r=0.181、0.241、0.136，P<0.05)。

表12組血清miR-21-5p和相關炎性因子水平比較

組別例數miR-21-5pIL-6(ng/L)IL-8(ng/L)CRP(ng/L)對照組 601.75±1.1242.12±10.4327.93±13.615.21±2.77腦梗死組643.06±2.8450.02±16.2835.76±11.088.01±6.12t3.3373.1943.5233.245P0.0010.0020.0010.002

2.3不同梗死面積急性腦梗死患者血清miR-21-5p表達水平比較中等+大梗死組急性腦梗死患者血清miR-21-5p的水平高于小梗死+腔隙梗死組(3.20±0.83vs2.69±0.27)，差異有統計學意義(t=2.175，P<0.05)。

2.4不同miR-21-5p表達水平急性腦梗死患者NIHSS評分和ADL評分比較將急性腦梗死組64例患者按miR-21-5p表達水平從低到高排序，前32例作為miR-21-5p相對低表達組，后32例作為miR-21-5p相對高表達組。2組入院時NIHSS評分和ADL評分差異均無統計學意義(P>0.05)；出院3個月時NIHSS評分均低于入院時，miR-21-5p相對低表達組低于miR-21-5p相對高表達組， ADL評分均高于入院時，miR-21-5p相對低表達組高于miR-21-5p相對高表達組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　不同miR-21-5p表達水平患者NIHSS評分和ADL評分比較

3　討　　論

急性腦梗死是由于供應腦部血液的動脈出現粥樣硬化和血栓形成，使管腔狹窄甚至閉塞，最終導致局灶性急性腦供血不足而發病。研究發現在腫瘤、糖尿病、心肌梗死等多種疾病中存在特異表達變化的外周血miRNA[6-11]。最近研究發現血清miRNA也可能是各種原因引起的腦梗死患者的一個新的敏感性生物學標志物。Li等[12]發現在腦缺血性休克患者血清中有115個miRNA存在差異性表達， miR-32-3p和miR-532-5p 與腦梗死相關。Su等[13]研究發現miR-132 和miR-324表達水平在急性動脈瘤性蛛網膜下腔出血患者與正常對照組相比顯著增高，但是在遲發型腦梗死與非遲發型腦梗塞患者間表達無顯著差異。Tsai等[14]研究還發現miR-21在缺血性腦血管疾病患者血清中顯著升高，miR-221顯著降低，可能是一個潛在的預測腦血管疾病的標志物。血清中的miRNA存在形式是外泌體方式，主要是通過細胞壞死的被動釋放或細胞主動分泌的方式[15]。Chen等[16]的研究發現急性腦缺血性休克患者血清中外泌體miR-126水平顯著增高，主要由血管內皮細胞主動分泌。本研究結果顯示miR-21-5p在急性腦梗死患者血清中高表達。與Tsai等[14]的研究結果類似，可能是通過腦細胞壞死后主動分泌的方式產生。

炎性反應是急性腦梗死的關鍵因素之一[17]。其中炎癥因子如IL-1、腫瘤壞死因子、細胞間黏附分子1、CRP等均參與了急性腦梗死的發生發展。血清炎性因子是細胞內誘導生成的一系列對炎癥反應有促進作用的細胞因子，一定程度上反映了機體的應激狀態及炎性反應狀況。腦梗死患者因多項炎癥因子的影響，促進炎性反應及血管硬化斑塊的形成，其水平高低可以反映機體的疾病嚴重程度[17]。本研究結果顯示，腦梗死組血清中IL-6、IL-8以及CRP水平高于對照組，并與血清中miR-21-5p表達水平呈正相關。

本研究對不同miR-21-5p表達水平的患者進行NIHSS評分和ADL評分檢測，結果表明出院3個月miR-21-5p相對低表達組NIHSS評分明顯低于miR-21-5p相對高表達組，ADL評分明顯高于相對高表達組。表明高表達miR-21-5p患者神經功能缺損嚴重，日常生活能力差，進一步證實了miR-21-5p在腦梗死患者中高表達，并且促進梗死發展。

綜上所述，miR-21-5p有可能作為急性腦梗死的一種潛在的生物學標志，將為臨床上急性腦梗死的預防和治療提供新的理論支持。

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(本文編輯：趙麗潔)

The correlation analysis of serum miR-21-5p and inflammatory factor in acute cerebral infarction patients

YU Li-na1， XI Gang-ming1, LIU Jin-xiang1, ZHAO Zhong-xin2*

(1.Department of Internal Neurology, the Central Hospital of Xuhui District, Shanghai 200031, China;2.Department of Internal Neurology, Changzheng Hospital affiliated to the Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)

ObjectiveTo investigate the correlation between serum miR-21-5p and inflammatory cytokines interleukin-6(IL-6), IL-8 and C-reactionprotein(CRP) in patients with acute cerebral infarction(ACI). MethodsBlood samples were collected from 64 inpatients with acute cerebral infarction(duration 24-48h) and from 60 healthy physical examinees with matching age and gender as control group. Real-time quantitative PCR was performed to examine the expression profiles of serum miR-21-5p in ischemic stroke patients and in control subjects. The ELISA method was used to detect the level of serum IL-6, IL-8 and CRP from two groups. Correlation analysis was made between miR-21-5p and inflammatory factors. NIH Stroke Scale(NIHSS) scores and Activities of Daily Living(ADL) scores analysis were used to analyze the clinical prognosis of cerebral infarction patients within and after admission. ResultsThe levels of serum miR-21-5p, IL-6, IL-8, CRP in the cerebral infarction group were higher than those in the control group. And miR-21-5p were positively correlated with the expression levels of IL-6, IL-8 and CRP in ACI patient. After discharge, the NIHSS score of miR-21-5p in relatively low expression group was lower than that in relatively high expression group, while the ADL score of miR-21-5p in relatively low expression group was higher than that of miR-21-5p in relatively high expression group. ConclusionThe up-regulated miR-21-5p expression in serum of patients with acute cerebral infarction was positively correlated with the level of serum inflammatory factors IL-8, IL-6 and CRP. MiR-21-5p may serve as a potential biomarker for predicting the prognosis of patients with acute cerebral infarction.

brain infarction； micrornas; interleukins; C-reactive protein

2016-04-01；

2016-06-16

虞莉娜(1981-)，女，浙江鎮海人，上海市徐匯區中心醫院主治醫師，醫學碩士，從事腦血管疾病診治研究。

R743.33

A

1007-3205(2016)06-0632-04