呼吸道感染細菌聯合疫苗體內實驗研究

李樹義，鮑承賢，張　敬

(1.河北省唐山市第九醫(yī)院檢驗科，河北 唐山 063000；2.河北省承德市雙橋區(qū)疾病預防控制中心計免科，河北 承德 067000；3.河北省唐山市中心血站檢驗科，河北 唐山 063000)

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·論著·

呼吸道感染細菌聯合疫苗體內實驗研究

李樹義1，鮑承賢2，張敬3

(1.河北省唐山市第九醫(yī)院檢驗科，河北 唐山 063000；2.河北省承德市雙橋區(qū)疾病預防控制中心計免科，河北 承德 067000；3.河北省唐山市中心血站檢驗科，河北 唐山 063000)

目的通過小鼠體內實驗進行免疫學指標檢測，觀察其對機體免疫功能的影響，為研制我國呼吸道感染細菌聯合疫苗提供理論依據。方法①分離培養(yǎng)我國小兒呼吸道感染常見6種細菌，按洗滌、超聲波破碎、沉淀、透析、分光光度計測定等過程制備細菌蛋白，等量混合配成一定濃度作為實驗用聯合疫苗。②取無特定病原體級小鼠40只，隨機分成4組，每組10只。全部實驗小鼠飼喂基礎日糧，適應性喂養(yǎng)10 d后，實驗組分別用濃度為0.1、0.2、0.4 g/L聯合疫苗免疫，每天上午灌服0.2 mL。對照組每天灌服0.2 mL生理鹽水。免疫10 d。處死小鼠，分別測定聯合疫苗組小鼠巨噬細胞吞噬功能、細胞免疫功能、血清中溶血素含量以及胸腺指數和脾臟指數的影響。結果聯合疫苗組的巨噬細胞吞噬率和吞噬指數、左右后足質量差、溶血素吸光度值、脾臟指數和胸腺指數均顯著高于對照組(P<0.05),在實驗設計疫苗濃度范圍各組中，不同組間檢測值隨疫苗濃度的增加而加大，且各實驗組間也均存在明顯差異(P<0.05)。結論制備的聯合疫苗可提高機體免疫功能，不僅能提高細胞免疫功能，對體液免疫功能也具有明顯影響，在實驗濃度范圍內，疫苗濃度越高對機體免疫功能影響越明顯。

呼吸道感染；疫苗；免疫

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.06.020

細菌和病毒均可引起呼吸道感染，病毒感染后可繼發(fā)細菌感染，臨床治療多應用抗生素，因藥物品種的選擇和劑量問題，可導致細菌產生耐藥性或菌群失調。利用免疫制劑預防或治療呼吸道感染，增強機體免疫力，是需要深入研究的課題[1-2]。蘭菌凈、泛福舒、必思添等制劑是將引起呼吸道感染的常見細菌經過特殊處理，制成的聯合細菌混懸液。蘭菌凈由溶血性鏈球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌B型制成，具有很好的抗原性，但由于地域、種族和不同的生活習慣，且制備蘭菌凈的細菌均來自英國菌株中心，其可能更適合歐洲白人應用；另外，進口疫苗價格昂貴，國內需自費接種，影響了此類疫苗的普及。所以，研制和生產一種針對我國預防和治療呼吸道感染疾病的價格合理、效果更佳的疫苗勢在必行。本研究以此為理論基礎，制備呼吸道感染細菌聯合疫苗，并通過體內實驗，對聯合疫苗的免疫學效果進行檢測[3]。現報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康昆明種小鼠，無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級，體質量18～22 g，雌雄各半，購自北京軍事醫(yī)學科學院。實驗用公雞：由華北理工大學實驗動物中心提供。取SPF級小鼠40只隨機分成4組：正常對照組，聯合疫苗1組，聯合疫苗2組，聯合疫苗3組，每組各10只。全部實驗小鼠飼喂基礎日糧，適應性喂養(yǎng)10 d后，分別用濃度為0.1、0.2、0.4 g/L聯合疫苗免疫1組、2組、3組小鼠，每天上午灌服0.2 mL[4-5]；對照組小鼠每天灌服生理鹽水0.2 mL。免疫10 d。根據實驗要求處死小鼠，進行檢測。

1.2主要試劑蛋白胨溶液(湖北興銀河化工有限公司)，氯化鈉注射液(山東齊都藥業(yè)有限公司)，75%乙醇(滄州鑫安化工產品有限公司)。

1.3主要儀器設備HR60-ⅡA2生物安全柜(青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司)，超聲波破碎儀SONIFIER(北京星越天成科技有限公司)，高速臺式離心機TGL-16B(上海安亭科學儀器廠)，電子精密天平CPA124S(上海恒磁電子科技有限公司)，臺式離心機TDL-40B(上海安亭科學儀器廠)，全自動酶標儀SpectraPlus384(美國Molecular Devices公司)，分光光度計D-8PC(南京菲勒儀器有限公司)，光學顯微鏡CHC-212(日本奧林帕斯公司)。

1.4菌種來源由開灤總醫(yī)院收集細菌，在華北理工大學微生物實驗室分離培養(yǎng)。

1.5聯合疫苗的制備從臨床上分離培養(yǎng)呼吸道感染常見6種細菌(同蘭菌凈菌株)，等質量混合，然后裝入無菌的離心管中，分別用生理鹽水洗滌，用天平調平后，以3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，反復3次，取最后沉淀物用生理鹽水稀釋后，用超聲波破碎儀將細菌分別破碎，用移液管加飽和硫酸銨到破碎細菌混合液中，混勻，沉淀細菌蛋白，利用透析膜除去硫酸銨，分光光度計測定蛋白含量，用細菌蛋白作為抗原[6]。按比例將抗原混合用0.9%生理鹽水配置成實驗要求濃度即為實驗用聯合疫苗。

1.6雞紅細胞懸液的制備將雞翼下靜脈取血部位用75%酒精消毒后，用注射器抽取靜脈血，將雞血置于肝素抗凝管中。然后取抗凝血3 mL加入裝有12 mL生理鹽水的離心管中，混勻后2 000 r/min離心15 min。棄掉上清，再在離心管中加入12 mL生理鹽水，混勻后2 000 r/min離心15min。棄掉上清后，通過同樣方法再洗滌1次，其沉積物即為雞紅細胞。隨后立即取1 mL雞紅細胞加入9 mL生理鹽水中，充分混勻，此溶液即為體積比為10%雞紅細胞懸液。

1.7巨噬細胞吞噬功能測定進行體外實驗前每天9：00向小鼠腹腔內注入1%的蛋白胨溶液1次，共3次，末次注射24 h后，將1 mL 10%的雞紅細胞懸液注射入小鼠腹腔，30 min后，將小鼠頸椎脫臼處死，再向腹腔注入生理鹽水2 mL，輕輕按摩小鼠腹部1 min。打開小鼠腹腔，吸取1 mL腹腔液，均勻涂在潔凈載玻片上，37℃溫箱孵育30 min。漂洗掉未貼片細胞，晾干，甲醇固定，用瑞氏染液濃染2 min，加入等量緩沖液淡染3 min，沖洗干凈后晾干。顯微鏡下觀察巨噬細胞吞噬情況，并按下式計算。吞噬率=(吞噬雞紅細胞的細胞數÷計數的巨噬細胞數)×100%。吞噬指數=被吞噬的雞紅細胞總數÷計數的巨噬細胞數

1.8遲發(fā)型超敏反應測定適應性喂養(yǎng)各組小鼠2周后，將50 μL 10%(v/v)CRBC懸液注入每只小鼠的左后足掌，將等量生理鹽水注射入右后足掌。待24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，沿相同部位切下小鼠雙后足，用電子天平精確稱其質量，計算左右后足質量差。

1.9血清溶血素含量測定取SPF級小鼠40只，按照1.6中分組及免疫小鼠，處死小鼠后摘除眼球取血，分離血清，用生理鹽水稀釋500倍待測。取稀釋的血清1 mL，10%雞紅細胞0.5 mL，10%的補體1 mL，依次加入試管內，混勻。用混勻的稀釋血清作對照，置37℃恒溫水浴箱中反應30 min，然后移至冰浴中使反應終止，2 000 r/min離心10 min，取上清液于λ540 nm處比色測吸光度值。

1.10小鼠免疫器官指數測定電子天平分別稱取小鼠體質量；濾紙吸干取出的脾臟、胸腺表面血液，用精密電子天平分別稱其質量。免疫器官指數=脾臟(胸腺)質量(mg)/體質量(g)。

1.11統(tǒng)計學方法應用SPSS 13.0 軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　　果

在實驗設計疫苗濃度范圍各組中，聯合疫苗1、2、3組與對照組相比，聯合疫苗2、3組與聯合疫苗1組間相比，小鼠巨噬細胞吞噬率及吞噬指數、左右后足質量差、溶血素含量、脾臟指數和胸腺指數均顯著提高(P<0.05)，見表1。

表14組各項觀察指標比較

組別吞噬率(%)吞噬指數左右后足質量差(mg)溶血素D(λ)脾臟指數胸腺指數對照組 22.5±1.950.32±0.0216.50±2.120.205±0.0234.92±0.231.53±0.32聯合疫苗1組27.3±1.65*0.46±0.02*21.60±2.07*0.229±0.018*5.64±0.30*2.16±0.24*聯合疫苗2組30.24±2.10*#0.57±0.04*#23.36±2.65*0.236±0.022*5.93±0.28*#2.56±0.31*#聯合疫苗3組35.29±2.65*#△0.65±0.05*#△25.63±3.02*#0.258±0.015*#△6.30±0.32*#△2.96±0.46*#△F 6.7814.9735.6253.9365.3057.582P 0.0010.0010.0010.0030.0010.001

*P<0.05與對照組比較#P<0.05與聯合疫苗1組比較△P<0.05與聯合疫苗2組比較(SNK-q檢驗)

3　討　　論

免疫制劑能調節(jié)機體免疫功能，減少不良反應，能有效地預防和治療呼吸道感染。本研究利用引起小兒呼吸道反復感染的6種常見菌制備聯合疫苗，進行動物體內實驗，觀察聯合疫苗對機體免疫功能的影響。

巨噬細胞可識別和清除病原體等抗原性異物，參與和促進炎癥反應，對腫瘤和病毒感染等靶細胞具有殺傷作用，可加工提呈抗原，啟動適應性免疫應答，活化的巨噬細胞可通過分泌多種細胞因子，參與免疫調節(jié)[7]。細菌溶解產物能增強巨噬細胞的趨化作用，增加IL-2和IFN-γ的分泌量，提高T淋巴細胞和B淋巴細胞的活性，同時增強單個核細胞和多核細胞的吞噬功能[8-9]。實驗聯合疫苗的作用機制與蘭菌凈、泛福舒相似，可能是通過刺激巨噬細胞，增強淋巴因子釋放，激活T淋巴細胞和促使B細胞向漿細胞成熟轉化，T淋巴細胞產生淋巴因子、漿細胞使IgA和自然殺傷細胞活性增強，提高機體免疫力[10-11]；也可能是通過激活黏膜源性淋巴組織，使其分泌補體及細胞活素，刺激氣管黏膜分泌免疫球蛋白，肺、腸分泌的IgA 濃度增加，提高呼吸道分泌型IgA(SIgA)及肺的巨噬細胞活性，通過特異性、非特異性細胞和體液機制增強免疫系統(tǒng)反應的效應，并可獲得長期非特異性免疫保護作用，對反復呼吸道感染可起到預防和治療的目的[12-13]。巨噬細胞是體內執(zhí)行非特異性免疫作用的效應細胞，其吞噬指數是衡量機體非特異性免疫功能指標[14-15]。本研究結果顯示，在實驗濃度范圍各組中，聯合疫苗組與對照組相比，聯合疫苗高濃度組與低濃度組間相比，小鼠的巨噬細胞吞噬率和吞噬指數得到明顯提高。說明制備的聯合疫苗可以提高小鼠巨噬細胞吞噬功能，促進正常小鼠非特異性免疫功能，且隨濃度的升高免疫功能加強。

遲發(fā)型超敏反應也稱Ⅳ超敏反應，為變態(tài)反應的一種。本研究采用雞紅細胞誘導小鼠遲發(fā)型超敏反應，觀察小鼠左右后足質量差異(即足墊部腫脹程度)來衡量細胞免疫功能[16]。本研究結果顯示，聯合疫苗組小鼠左右后足質量差與對照組相比，實驗高濃度組與低濃度組相比，檢測數據均明顯增高。說明制備的聯合疫苗對小鼠細胞免疫功能具有促進作用，且隨濃度的增高免疫功能增強。

溶血素是B淋巴細胞受抗原刺激后，分化成漿細胞產生的抗體。抗體是機體殺滅病原菌和清除外來抗原的重要活性物質，主要存在于體液中，是體液免疫反應的標志。本研究采用雞紅細胞免疫小鼠，致使小鼠血清溶血素抗體生成，其生成量可代表抗體生成總量，從而觀察聯合疫苗對小鼠體液免疫功能的影響[17]。溶血素與雞紅細胞、補體在37 ℃發(fā)生反應，雞紅細胞溶解。紅細胞破裂釋放出的血紅蛋白使溶液變成紅色，顏色越深，血紅蛋白滲出量越多，且吸光度值與溶血素含量正相關，測定上清液的吸光度值，可間接反映血清中溶血素的含量，從而反映機體的體液免疫水平。本研究結果顯示，聯合疫苗組比對照組吸光度值顯著增高，實驗疫苗高濃度組與低濃度組相比吸光度值也明顯增高。表明此聯合疫苗可顯著提高小鼠體液免疫功能，且隨實驗濃度的增高體液免疫功能增強。

免疫器官是實現免疫功能的器官或組織，是免疫細胞進行生長發(fā)育以及產生免疫應答的主要場所，當免疫器官生理性體積增大，免疫細胞數量增多，機體的免疫功能與抵抗力也會相對增強。因此，促進免疫器官質量增加，必定對機體免疫力起到提高的作用[18]。從本研究結果可以看出，用聯合疫苗免疫后，小鼠的胸腺指數和脾臟指數均顯著提高，隨濃度的升高其檢測指數也明顯升高。說明聯合疫苗可以促進機體免疫細胞增殖，提高機體免疫功能，且隨濃度的升高而加強。

總之，通過一系列體內實驗，證明利用呼吸道常見感染細菌制備的聯合疫苗，對機體非特異性免疫、細胞免疫和體液免疫均有明顯提高，且在實驗濃度范圍內隨疫苗濃度的升高而增強免疫力。同時證明利用我國上呼吸道感染的常見細菌，能夠成功制備細菌聯合疫苗，這為我國聯合疫苗的研制提供了理論依據。

[1]張敬,朱麗華,張慶波.呼吸道感染細菌聯合疫苗體外實驗研究[J].實用預防醫(yī)學,2015,22(6):746-748.

[2]朱颋,陳穎張.匹多莫德佐治小兒反復呼吸道感染療效觀察[J].臨床合理用藥,2015,8(11A):81-82.

[3]袁婷,關曉菲,馬翠卿,等.A族鏈球菌M蛋白相關疫苗的研究進展[J].河北醫(yī)科大學學報,2015,36(1):103-107.

[4]徐宗凱,林青青,周夢瑩,等.三種李斯特菌菌體蛋白提取方法的比較[J].生命科學研究,2015,19(1):29-33.

[5]孫俠,韓長城,牛玉杰,等.溴氰菊酯對小鼠免疫系統(tǒng)的損傷作用[J].河北醫(yī)科大學學報,2005,26(1):1-4.

[6]蔡巖,趙曉青,李繼宏,等.乙型肝炎卡介苗聯合疫苗免疫豚鼠及小鼠的病理學研究[J].微生物學雜志,2012,32(6):82-86.

[7]Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al. Global cancer statistics,2012[J]. CA Cancer J Clin,2015,65( 2):87-108．

[8]Cazzola M,Anapurapu S,Page CP. Polyvalent mechanical bacterial lysate for the prevention of recurrent respiratory infections:a meta-analysis[J]. Pulm Pharmacol Ther,2012,25:62-68.

[9]洪建國.兒童反復呼吸道感染細菌提取物的臨床應用[J].中國實用兒科雜志,2013,28(3):165-168.

[10]Rossi ME,Legal L,Azzari C,et al. Effect of a polyvalent bacterial preparation on nature kill cell activity in children with recurrent respiratory infections[J]. Int J Imumunotherapy,1993,9(4):225-233.

[11]趙志強,賈麗霞,張慶波,等.黃酮對免疫功能影響的體內研究[J].臨床薈萃,2014,29(1):49-51.

[12]張偉.泛福舒輔助治療兒童支氣管哮喘的臨床觀察[J].中國醫(yī)藥指南,2015,13(13):70.

[13]吳永利,孔令茹,張潔,等.泛福舒治療小兒反復呼吸道感染療效觀察[J].臨床薈萃,2008,23(9):659-660.

[14]羅新舟,孫江橋.復方黃芪合劑對小鼠免疫功能影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2014,16(1):21-22.

[15]王秀青,孫慧敏,朱明,等.CecropinA-thanatin雜合肽對小鼠生長性能及免疫功能的影響[J].飼料研究,2015,8:65-70.

[16]劉印華,趙志強,李樹義,等.黃芪多糖對免疫功能影響的體內實驗研究[J].河北醫(yī)藥,2015,37(4):485-487.

[17]宋媛媛,周越,孫守兵,等.丁香苷對免疫功能低下小鼠的免疫調節(jié)作用[J].中藥藥理與臨床,2013,29(2):44-47.

[18]Hamada K,Sakaue M,Sarkar A,et al. Immune responses to repetitive adenovirus-mediated gene transfer and restoration of gene expression by cyclophosphamide or etoposide[J]. Gynecol Oncol,2005,99(3):177-186.

(本文編輯：劉斯靜)

In vivo experimental study of bacteria combined vaccine in respiratory tract infection

LI Shu-yi1, BAO Chen-xian2, ZHANG Jing3

(1.Department of Clinical Laboratory,the Ninth Hospital of Tangshan City,Tangshan 063000, China;2.Department of Planned Immunization, Prevention and Control Center of Shuangqiao, Chengde 067000, China; 3.Department of Clinical Laboratory, Blood Center of Tangshan City, Tangshan 063000, China)

ObjectiveThe immune function of the mice was detected through theinvivoexperiment in mice, which will provide theoretical basis for the development of the bacterial combined vaccine of respiratory tract infection in our country. Methods①Six common bacterias in children with respiratory tract infection in our country were isolated and cultured. Bacterial proteins were prepared by washing, ultrasonic crushing, precipitation, dialysis and spectrophotometer, and the equivalent amount of the mixture was used as the experimental combined vaccine. ②Forty specific pathogen free mice were randomly divided into four groups, with 10 rats in each group. All mice were fed with a basal diet.After adaptive feeding for 10 days, the experimental group were fed with concentrations of 0.1, 0.2, 0.4 g/L combined vaccine, with daily morning irrigation of 0.2 mL. The mice in normal control group were orally administered daily with physiological saline 0.2 mL. All groups were immuned for 10 days. Effects of combined vaccine on the phagocytic function of macrophage,the cellular immune function of mice, the changes of serum hemolysin content and the effect of thymus index and spleen index determinated. ResultsCompared with the normal control group, the macrophage phagocytic rate and phagocytic index,left and right foot weight, the absorbance value of serum hemolysin, the spleen index and thymus index of combined vaccine groups were significantly increased(P<0.05). In the experimental design of vaccine concentration range, the detection values in different groups were increased with the increasement of vaccine concentration, and there were significant differences among the test groups(P<0.05). ConclusionCombined vaccine can improve the immune function of organism. Combined vaccine can not only improve the cellular immune function, but also has obvious effect on humoral immune function. In the experimental concentration range, the higher the vaccine concentration, the more obvious effect on the immune function of the body.

respiratory tract infections； vaccines； immunity

2015-11-02；

2015-12-11

李樹義(1974-)，男，滿族，河北青龍人，河北省唐山市第九醫(yī)院副主任檢驗師，醫(yī)學碩士，從事臨床檢驗學研究。

R517.6

A

1007-3205(2016)06-0693-04