響應曲面法優化赤芝多糖提取工藝的研究*

葉　芳，李偉建，徐永群，李鶴祥，吳澤霞

(韶關學院化學與環境工程學院，廣東　韶關　512000)

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響應曲面法優化赤芝多糖提取工藝的研究*

葉芳，李偉建，徐永群，李鶴祥，吳澤霞

(韶關學院化學與環境工程學院，廣東韶關512000)

在單因素試驗基礎上，根據 Box-Behnken的中心組合實驗設計原理采用三因素三水平的響應面分析法，以水料比、提取時間和提取溫度為自變量，多糖提取率為響應值，研究各自變量及其交互作用對多糖提取率的影響。結果表明赤芝多糖浸提的最佳條件為：水料比為50:1，提取時間為2.5 h，提取溫度為75 ℃，在此條件下多糖提取率達到0.199%，與預測的理論值0.204%相差不大，說明采用響應面分析法優化工藝所得到的提取條件參數可靠，此法具有一定的應用價值。

赤靈芝；多糖；響應面；響應值

靈芝中含有的靈芝多糖因其具有抗腫瘤、提高機體免疫、耐缺氧能力、消除體內自由基、抗輻射、提高肝臟解毒功能、降血糖、降血脂等作用，而被認為是靈芝藥用的主要有效成分[1-4]。而影響靈芝多糖提取率的因素很多，如提取溶劑的選擇、提取溫度、提取時間及水料比等，提取的最佳工藝必須經過大量試驗進行探索才能得到。目前大多數赤靈芝中多糖的提取工藝的優化采用的是正交試驗方案，實驗次數較多，然而本實驗中的響應曲面法采用了數學統計和模型結合的方法，能夠以最經濟的方式、用很少的試驗數量和時間對實驗行全面研究，最終優化出赤芝中多糖的浸提工藝。

1　實　驗

1.1材料與儀器

赤靈芝(市場購買)；無水葡萄糖、濃硫酸、蒽酮與無水乙醇均為分析純。

超級恒溫水浴(HK-2A型)，南大萬和科技有限公司；旋轉蒸發儀(R501型)，上海雅榮生化儀器設備有限公司；紫外-可見光分光光度計(UV-759)，上海精密科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1標準曲線的繪制[5-6]

準確稱量0.1 g蒽酮，溶解于100 mL 80%的硫酸中，搖勻，保存于棕色瓶中，當日配制使用，即得1 g·L-1的硫酸蒽酮溶液。

準確稱取干燥至恒重的葡萄糖10.00 mg，加少量水溶解轉移到100 mL的容量瓶中并稀釋至刻度線，搖勻，即得0.1 mg·mL-1的葡萄糖標準溶液。精確移取葡萄糖標準溶液0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL，分別置于25 mL比色管中，分別加入蒸餾水補至2.0 mL，然后再加入6.00 mL硫酸蒽酮溶液，搖勻后放入80 ℃水浴加熱15 min后取出，置于冷水中冷卻至室溫，同時用2.00 mL蒸餾水與6.00 mL 硫酸蒽酮混合溶液作為空白，用紫外-可見分光光度計在波長為625 nm處測量吸光度A，得標準曲線方程A=41.49c，相關系數R2=0.9992。

1.2.2多糖提取方法[7]

取1 g粉碎后的靈芝粉末，根據一定的水料比加入蒸餾水，在設定的溫度和時間條件下加熱。加熱完成后抽濾得多糖提取液，將多糖提取液減壓蒸發，定容至25 mL，搖勻。準確量取5.00 mL溶液至25 mL的比色管中，加入無水乙醇至刻度線，搖勻，4 ℃下放置15 h，取出，離心，棄去上層清液，沉淀加水溶解，并轉移至25 mL的比色管，加水稀釋至刻度，搖勻即得樣品溶液。

1.2.3多糖含量的測定方法[8-9]

準確量取2.00 mL樣品溶液，加入1 g·L-1硫酸蒽酮溶液6.00 mL，搖勻后放入80 ℃水浴加熱15 min，置于冷水中冷卻至室溫，用紫外-可見分光光度計于625 nm波長處測其吸光度A，根據標準曲線查出多糖的濃度c，根據下式即可計算出樣品中靈芝多糖的提取率。

式中：c——多糖濃度，mg·mL-1

ms——樣品質量

2　結果與討論

2.1水浸提靈芝多糖過程中的單因素影響

2.1.1水料比的影響

靈芝浸提多糖過程中的加水量是限制多糖提取率的重要因素，圖1是水料比對靈芝多糖提取率影響的關系圖。從圖1可知，在溫度為80 ℃，加熱時間為2 h的條件下，隨著水料比(mL·g-1)的增加，多糖提取率開始增加，直到水料比(mL·g-1)超過50:1以后，再繼續增加水料比發現靈芝多糖的提取率反而減少，所以選擇50:1附近作為適宜的水料比。

圖1　水料比對多糖提取率的影響

2.1.2提取時間的影響

在溫度為80 ℃，水料比為50:1，提取時間分別為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h的條件下考察提取時間對多糖提取率的影響(圖2所示)。由圖2可知，隨著提取時間的增加，多糖提取率明顯增加，當提取時間超過2 h以后，靈芝多糖的提取率反而減小。這表明，多糖的浸出過程與時間密切相關，時間過短則多糖溶解不充分，但時間過長則可能會引起產物結構的變化進而使多糖提取率降低，所以選擇2 h附近作為適宜的提取時間。

圖2　提取時間對靈芝多糖提取率的影響

2.1.3提取溫度的影響

圖3是在水料比為50:1，提取時間為2 h，提取溫度分別為45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃、85 ℃、95 ℃的條件下，考察提取溫度對靈芝多糖提取率的影響。從圖3可知，隨著溫度增加，靈芝多糖的提取率逐漸增加，但是當超過溫度75 ℃以后，多糖的提取率的增加趨于平緩，考慮到高溫可能對多糖的結構與活性有一定影響，溫度過高多糖易產生降解，而且溫度過高，水分容易揮發，給操作帶來不便，所以選擇在75 ℃附近作為提取的適宜溫度。

圖3　提取溫度對多糖提取率的影響

2.2響應曲面法對靈芝多糖提取工藝的優化

2.2.1響應面因素水平設計

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，綜合單因素實驗結果，選取水料比(A)，提取時間(B)和提取溫度(C)三因素為自變量，多糖的提取率為響應值Y，并以1，0，-1代表自變量的高、中、低水平，設計三因素三水平試驗，見表1。

表1　響應面試驗因素水平表Table 1　Factors and levels of responsive surface analysis test

2.2.2響應面法分析方案及結果

根據Box-Behnken中心組合試驗方案進行3因素3水平試驗，以多糖提取率為指標，研究各因素間相互作用下的靈芝多糖提取率，實驗結果見表2。

表2　響應面試驗方案及試驗結果Table 2　Program and results of responsive surface analysis test

采用Design-Expert8.0統計分析軟件對表 2 中的試驗數據進行回歸擬合，得到水料比(A)，提取時間(B)和提取溫度(C)三個自變量與多糖提取率(Y)之間的二次多元回歸方程為:

Y=-5.49216+0.12895A-2.01607B+0.14479C+0.092283AB-3.40261AC-1.70650BC-1.40255A2-0.028329B2-4.02482C2

從表3中對上述二次多元方程的方差分析，可以看出，該試驗回歸模型達到極顯著水平(P=0.0003<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)，因此，可以應用此回歸模型充分表明各因素之間的關系。

同時，從表3結果可知一次項中，水料比(A)，提取時間(B)和提取溫度(C)對多糖提取率均具有顯著性影響，各因素對多糖提取率影響顯著性排序為：提取時間(B)>水料比(A)>提取溫度(C)。

表3　回歸方程方差分析Table 3　Results of extraction regression analysis

續表3

C214.2634.26358.550.0006殘差57.2813.641失擬值11.4301.4302.590.1829凈誤差45.5262.210校正值163.527

根據二次回歸方程繪制各影響因素之間的響應面圖，見圖4～圖6，從各響應面的最高點可以看出，在所選的范圍內存在極值，響應曲面上存在最高點。各影響因素之間，提取時間與與提取溫度的交互作用較顯著，其中水料比與與提取溫度之間的交互作用更顯著，表現為曲線更為陡峭陡峭，而水料比與提取時間之間的交互作用不具有顯著性(P>0.05)，表現為曲線比較平滑，響應值變化較小。根據所建立的數學模型進行工藝參數最優化分析，得到多糖提取的最佳工藝條件: 水料比為50:1，提取時間為2.5 h，提取溫度為75 ℃，多糖提取模型的預測值為0.2040%。

圖4　水料比和提取時間對多糖提取率影響的響應曲面

圖5　水料比和提取溫度對多糖提取率影響的響應曲面

圖6　提取時間和提取溫度對多糖提取率影響的響應曲面

根據上述試驗結果進行證性試驗，在水料比為50:1，提取時間為2.5 h，提取溫度為75 ℃進行了3次平行實驗，實際測得赤靈芝多糖平均提取率為0.2012%，相對誤差為1.37%，說明試驗模型設計所得的最佳工藝參數具有可靠性。

3　結　論

運用響應面分析法優化了赤靈芝多糖的提取工藝，從而求得赤靈芝多糖水浸提的最佳工藝條件為: 水料比為50:1，提取時間為2.5 h，提取溫度為75 ℃，此時赤靈芝多糖的提取率達到0.2012%。

[1]方一葦.具有藥理活性多糖的研究現況[J].分析化學,1994,22(9):955-960.

[2]李明春,梁東升,許自明,等.靈芝多糖對小鼠巨噬細CAM P 含量的影響[J].中國中藥雜志, 2000,25(1):41-43.

[3]金春華,姜秀蓮,王英軍,等.靈芝多糖活血化瘀作用實驗研究[J].中草藥,1998,29(7):470-472.

[4]李容芷.從靈芝扶正固本有效成分靈芝多糖的發現討論中藥活性研究的方法途徑[J].北京醫科大學學報,1987,119(6):431.

[5]陳勇,徐永群,彭翠紅,等.熒光光譜法測定靈芝多糖的含量[J].分析科學學報,2012,28(3): 411-413.

[6]劉敏,高嵐.紫外分光光度法測定靈芝孢子粉膠囊中靈芝多糖含量[J].現代中醫研究與實踐, 2005,19(4):34-35.

[7]王瑩,王華,丁寧,等.響應曲面法優化水溶性銀杏葉多糖提取工藝[J].江蘇農業科學,2015, 43(5):268-270.

[8]董艷紅,李姝婧,鄭惠華,等.響應曲面優化超聲波提取靈芝多糖工藝研究[J].食品科學,2009, 30(16):98-101.

[9]劉軍海,黃寶旭,蔣德超.響應面分析法優化艾葉多糖提取工藝研究[J].食品科學,2009, 30(2):114-118.

Study on Optimization of Extraction Technology of Polysaccharide from Ganoderma Lucidum by Response Surface Methodology*

YE Fang, LI Wei-jian, XU Yong-qun, LI He-xiang, WU Ze-xia

(College of Chemical and Environment Engineering, Shaoguan University, Guangdong Shaoguan 512005, China)

Based on single factor tests, the optimum extraction conditions of polysaccharides from ganoderma lucidum were obtained through Box-Benhnken central combination design with three factors and three levels response surface methodology(RSM). Taking the ratio of water to material, extraction time and extraction temperature as independent variables, and the extraction rate of polysaccharide as the response value, the effects of their respective variables and their interaction on the extraction rate of polysaccharides were studied. The results showed that the optimum conditions for extracting ganoderma lucidum polysaccharide were the ratio of water to material of 50:1, the extracting time of 2.5 h, extraction temperature of 75 ℃, under the condition, the yield of polysaccharide was up to 0.199%, which was very closely to 0.204% of prediction. The method of response surface analysis was used to optimize the extraction condition parameters, which had a certain application value.

ganoderma lucidum; polysaccharide; response surface; response value

2015年韶關學院大學生創新項目(NO: sycxcy2015-128)。

葉芳(1983-)，女，主要從事電化學方面的研究。

O658.9

A

1001-9677(2016)013-0078-04