基于COI和18SrRNA基因對蜚蠊物種進行分子鑒定*

陳壯志，楊志斌,3，李貴軻，劉　衡,3，陳　丹，高鵬飛,3，張成桂,3

(1 云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南　大理　671000；2 中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發利用協同創新中心，大理大學，云南　大理　671000；3 藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心，云南　大理　671000；4 四川好醫生藥業集團有限公司，四川　成都　615000)

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分析測試

基于COI和18SrRNA基因對蜚蠊物種進行分子鑒定*

陳壯志1,2，楊志斌1,2,3，李貴軻3,4，劉衡1,2,3，陳丹1,2，高鵬飛1,2,3，張成桂1,2,3

(1 云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理671000；2 中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發利用協同創新中心，大理大學，云南大理671000；3 藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心，云南大理671000；4 四川好醫生藥業集團有限公司，四川成都615000)

為從分子水平上明確藥用美洲大蠊在分類學上的地位，采用分子克隆和序列比對的方法，對云南大理產美洲大蠊的COI基因和18SrRNA基因片段進行擴增、克隆和序列測定，并同蜚蠊科相關物種進行系統發育分析。結果表明，通過鄰接法(Neighbor-joining method, NJ)和最小進化法(Minimum evolution method, ME)構建的系統樹基本一致，證實COI能對美洲大蠊及其近緣物種進行有效的物種分子鑒定，而18SrRNA不能進行有效的分子鑒定。

美洲大蠊；COI基因；18SrRNA基因；系統進化分析

美洲大蠊(Periplanetaamericana)為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱“蟑螂”，是我國重要的傳統藥材，其入藥始載于《神農本草經》，并把它列為中品，謂“味：咸、寒；治：血瘀癥堅寒熱、破積聚、喉咽閉、內寒無子”。美洲大蠊具有多種藥理作用，比如如抗腫瘤、改善微循環、強心升壓、抗菌及抗病毒作用和促進組織修復等[1]。傳統的藥用美洲大蠊分類研究主要以形態學為依據，但由于藥用美洲大蠊炮制品大多殘缺不全，容易混入偽品，給準確的藥材鑒定帶來許多困難。DNA條形碼方法由于不受樣品形態的限制，彌補了昆蟲藥材在形態鑒定上的缺陷，是形態學鑒定美洲大蠊以有力的補充，可更加準確有效地鑒定昆蟲藥材炮制品[2-4]。

本研究利用線粒體COI基因和細胞核18SrRNA基因，對藥用美洲大蠊及其近緣物種等6種蜚蠊的這兩個基因序列特征進行分析，并對它們分子分類的有效性進行比較和探討，為美洲大蠊藥材的準確分類提供依據。

1　實　驗

1.1樣品采集

本研究共收集云南省大理州大理大學昆蟲醫藥研究院作邑養殖基地產美洲大蠊實驗樣本5個。實驗樣本均根據《中國動物志》及《中國藥典》，經大理大學楊自忠教授進行鑒定。

1.2基因組DNA提取

取單個美洲大蠊約50 mg的胸部肌肉，采用SDS-蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法提取總DNA[5]提取的 DNA置于-20 ℃保存。

1.3PCR擴增

COI基因、18SrRNA基因的引物序列設計分別參照Vrijenhoek[6]和Tautz等[7]的研究。COI基因的引物序列為:LCO1490 5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’，HCO2198 5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’；18SrRNA基因的引物序列為：18S-ai 5’-CCT GAG AAA CGG CTA CCA CAT C-3’，18S-b0.5 5’-GTT TCA GCT TTG CAA CCA T-3’。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，PCR擴增在MyCycler Thermal Cycler 型PCR儀(美國Bio-Rad公司)上進行。反應體積為50 μL，包含2×Taq PCR MasterMix 25 μL(天根生化科技(北京)有限公司)，10 μmol/L引物LCO1490、HCO2198或18S-ai、18S-b0.5各1 μL，模板DNA約50 ng，滅菌ddH2O補足至終體積。PCR反應程序為：擴增條件依次為：94 ℃預變性3 min；35個循環的94 ℃變性45 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min；72 ℃延伸7 min；4 ℃保溫。同時以滅菌ddH2O代替模板DNA作陰性對照。取2 μL PCR產物上樣至1.2%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測，其余置-20 ℃冰箱保存備用。對于擴增無雜帶，目的條帶明亮的PCR產物送交上海生工生物有限公司測序。COI基因采用雙向測序、測序引物為LCO1490、HCO2198，18SrRNA基因則采用單向測序，測序引物為18S-ai、18S-b0.5。

1.4序列分析和數據處理

用DNASTAR軟件包中的SeqMan軟件對獲得的基因序列進行校對和編輯,并在美國生物信息中心(NCBI)網站的Genbank中搜尋最相關序列，選取蜚蠊科及用于做外群昆蟲的相應序列(表1)，借助在線Clustal W(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)[8]進行對位排列。運用MEGA 5.2軟件，根據Kimura 2-parameter模型分別構建NJ(Neighbor-joining)和ME(Minimum evolution)系統進化樹，采用Bootstrap(重復數=1000)檢驗分子系統樹各分支的置信度。

表1　6種蜚蠊目昆蟲Genbank序列號Table 1　GenBank Numbers of the CO I and 18S rRNAsequences of Blattaria

續表1

蜚蠊科Blattidae東方蜚蠊BlattaorientalisAM114926.1AY521830.1側緣雪蠊ShelfordellalateralisJQ267493.1DQ874114.1姬蠊科Blattellidae德國小蠊BlattellagermanicaJQ350728.1DQ874114.1

2　結果與討論

2.1COI和18SrRNA基因序列特征

通過美洲大蠊總DNA的PCR擴增、測序，分別得到5個美洲大蠊清晰單一的COI基因、18SrRNA基因片段擴增產物，5個美洲大蠊個體的COI基因和18SrRNA基因序列測定結果完全相同。與蜚蠊科其他5種昆蟲序列比對，分別選取COI和18SrRNA基因序列中沒有任何堿基插入、缺失的602 bp和751 bp(分別編碼和250個氨基酸)的序列片段進行分析。其中COI基因有140個變異位點、84個簡約信息位點、462個不變位點，分別占分析序列堿基的23.26%，19.95%，76.74%。18SrRNA基因有2個變異位點、0個簡約信息位點、748個不變位點，分別占分析序列堿基的0.27%，0，99.60%。可變位點、簡約信息位點的百分比COI均要高于18SrRNA基因。

蜚蠊科6種昆蟲COI和18SrRNA基因平均GC含量特征有很大不同，分別為34.87%和53.35%，COI基因中GC含量低于AT的平均百分含量(65.13%)，表現出線粒體蛋白編碼基因的明顯偏倚性。18SrRNA基因密碼子各位點的平均GC含量為第二位最高、第一位最低，但COI基因第一、二和三密碼子位點的平均GC含量均低于18SrRNA基因的相應位點。黑胸大蠊第3位GC含量(8.50%)在蜚蠊科6種昆蟲的2種基因中均是最低的(表2)。

表2　蜚蠊科6種昆蟲CO I、18S rRNA基因序列片段平均GC含量Table 2　The GC average contents of CO I and 18S rRNA gene sequences for 6 species in the order Blattidae 　(%)

續表2

東方蜚蠊Blattaorientalis34.3947.7644.2811.0053.4751.0056.0053.41側緣雪蠊Shelfordellalateralis36.2146.7744.7817.0053.3350.6056.0053.41平均值(Meanvalue)34.8747.4644.7312.3053.3550.6456.0053.41

所有個體COI和18SrRNA基因序列變異位點信息見表2。相同對百分比在COI和18SrRNA基因序列中均為90%以上，18SrRNA基因中更是高達99.87%，密碼子第3位的相同對百分比均最低，而第1、2位非常近似；對于COI基因轉換和顛換多出現在密碼子的第3位和第1位，其顛換100%來自第3位密碼子，而18SrRNA基因序列中沒有轉換位點和顛換位點(表3)。

表3　蜚蠊科6種昆蟲CO I和18S rRNA基因序列片段各密碼子位點堿基變異表Table 3　The sequence variation of the CO I and 18S rRNA genes for 6 species in the order Blattidae

注: “/”的前者為數值，后者為百分比。

2.2遺傳距離

種間和種內遺傳距離大小是物種判定的主要標準。基于COI基因序列的美洲大蠊與其余5種蜚蠊科昆蟲種間遺傳距離(表4)在0.102～0.164之間，美洲大蠊種內遺傳距離在0～0.020之間，前者均大于后者。基于18SrRNA基因序列的美洲大蠊與其余5種蜚蠊科昆蟲種間遺傳距離(表5)在0～0.003之間，美洲大蠊種內遺傳距離在為0，前者與后者有遺傳距離的重疊。COI種間遺傳距離均顯著高于Hebert等[9]設定的2%的遺傳差異。

基于COI和18SrRNA基因序列最大種間遺傳距離均發生在棕色大蠊與側緣雪蠊之間(0.164)以及東方蜚蠊和其他5種蜚蠊之間(0.003)。美洲大蠊基于COI基因序列種內平均遺傳距離(0.012)高于18SrRNA基因序列(0)。

表4　蜚蠊科6種昆蟲基于CO I基因序列遺傳距離Table 4　Genetic distances of 8 species in the order Blattidae based on CO I gene

表5　蜚蠊科6種昆蟲基于18S rRNA基因序列遺傳距離Table 5　Genetic distances of 8 species in the order Blattidae based on 18S rRNA gene

續表5

6澳洲大蠊Periplanetaaustralasiae0.0000.0000.0000.0000.0007黑胸大蠊Periplanetafuliginosa0.0000.0000.0000.0000.0000.0008棕色大蠊Periplanetabrunnea0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0009東方蜚蠊Blattaorientalis0.0030.0030.0030.0030.0030.0030.0030.00310側緣雪蠊Shelfordellalateralis0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.003

2.3分子系統進化分析

將獲得的美洲大蠊CO I基因和18S rRNA基因序列，以姬蠊科昆蟲德國小蠊為外群，分別用于對美洲大蠊及其近緣物種分別進行聚類分析，得到CO I基因和 18S rRNA 基因片段的NJ和ME系統進化樹(圖1、圖2)。

基于CO I基因構建的NJ和ME兩種系統樹的拓撲結構基本一致，只是兩樹的自舉置信水平稍有不同。在兩種系統樹中，美洲大蠊5個體首先相聚,再與同為大蠊屬的澳洲大蠊、黑胸大蠊和棕色大蠊聚合。基于18S rRNA基因序列構建的NJ和ME兩種系統樹的拓撲結構也基本一致，也是兩樹的自舉置信水平稍有不同。在兩種系統樹中，美洲大蠊5個體與澳洲大蠊、黑胸大蠊、棕色大蠊和側緣雪蠊聚合，自舉置信水平也較高(88)，說明利用18S rRNA基因序列不能對美洲大蠊及其近緣物種進行有效分類鑒定。

圖1　基于CO I基因序列構建蜚蠊目7種昆蟲Neighbor-Joining樹

圖2　基于18S rRNA基因序列構建蜚蠊目7種昆蟲Neighbor-Joining樹

3　結　論

對蜚蠊科6種昆蟲CO I和18S rRNA基因序列比較分析發現，由于CO I基因序列為線粒體基因，18S rRNA為核基因，所以兩種序列存在較多差異性，如:(1)CO I基因序列GC的百分含量較低，表現出明顯的反GC偏倚，而18S rRNA基因中則沒有這種偏倚(在CO I和18S rRNA中GC的百分含量分別為34.87%和53.35%)，CO I的堿基含量分布為典型的昆蟲線粒體基因特征[10]；(2)CO I基因的變異位點較多，而18S rRNA基因的基本無變異位點，簡約信息位點也是CO I較多，而在18S rRNA中未發現簡約信息位點，由此導致美洲大蠊與澳洲大蠊、黑胸大蠊、棕色大蠊和側緣雪蠊種內種間遺傳距離相近而無法區分。但CO I、18S rRNA基因也存在一些相似點：(1)相同對百分比在CO I和18S rRNA基因序列中均為90%以上；(2)在CO I和18S rRNA基因序列中，相同對在第1、2和3位密碼子中所占比例相似。通過以上分析可知變異位點、簡約信息位點百分含量在不同基因、不同類別間存在差異，在本研究中，CO I較18S rRNA基因的變異率更高些，而18S rRNA基因基本無變異。

CO I基因和18S rRNA基因在生物體內含量較大且在進化過程中較保守，是探討生物高級分類群系統演化的難得工具，近年來廣泛應用于昆蟲分類及系統進化研究[11-16]。本課題首先測定了美洲大蠊其CO I基因、18S rRNA基因序列，結果表明它們與GenBank上已發表的美洲大蠊相應基因的相似性達98%以上。CO I基因基因片段的保守性強，同屬內各種之間差異較大，種內基本無遺傳變異，適用于美洲大蠊和蜚蠊科其他5種昆蟲的分類鑒定和系統進化分析；18S rRNA基因片段的保守性更強，種內和同屬各種之間差異基本為0，種內種間基本無遺傳變異，故18S rRNA不能對美洲大蠊及其近緣物種進行分類鑒定和系統進化分析。

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The Molecular Species Identification of Blattaria Based on mtDNACOIand 18SrRNAGene Sequences*

CHEN Zhuang-zhi1,2, YANG Zhi-bin1,2,3, LI Gui-ke3,4, LIU Heng1,2,3, CHEN Dan1,2,GAOPeng-fei1,2,3,ZHANGCheng-gui1,2,3

(1 Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D, Yunnan Dali 671000;2 Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics, Dali University, Yunnan Dali 671000;3 The National-Local Joint Engineering Laboratory for Entomoceutics, Yunnan Dali 671000;4 Gooddoctor Pharmaceutical Group, Sichuan Chengdu 615000, China)

COIand 18SrRNAgenes ofPeriplanetaamericanacollected at Dali, Yunnan Province were cloned and sequenced. The phylogenetic relationships between thePeriplanetaamericanaand its closely related 5 species in the order Blattaria were analyzed. The results showed that the phylogenetic trees were almost identical with methods of NJ (Neighbor-joining) and ME (Minimum evolution). It showed thatCOIgene was a practical molecular marker for species identification ofPeriplanetaamericanaand its closely related species, while 18SrRNAgene failed to be used in species identification.

Periplanetaamericana;COIgene; 18SrRNAgene; phylogenetic analysis

國家自然科學基金(81360679)；云南省戰略性新興產業項目發展專項資金([2013]1527)；云南省高新技術產業發展重點項目([2012]1956)；云南省2011協同創新中心項目([2012]25)。

陳壯志(1987-)，男，在讀碩士研究生，研究方向為分子生物學和生物信息學。

張成桂，男，副教授、博士，主要研究方向為分子生物學和生物制藥研究。

TQ460

A

1001-9677(2016)013-0104-05