基于LC-TOF/MS的大鼠尿液中大黃硝石湯原形成分鑒別

謝　瑞，馮　芳,2

(1 中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇　南京　210009；2 藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國藥科大學(xué))，江蘇　南京　210009)

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基于LC-TOF/MS的大鼠尿液中大黃硝石湯原形成分鑒別

謝瑞1，馮芳1,2

(1 中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210009；2 藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國藥科大學(xué))，江蘇南京210009)

采用高效液相-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(LC-TOF/MS)技術(shù)，對大鼠給藥大黃硝石湯后尿樣中的原形成分進(jìn)行鑒別。采集正負(fù)離子模式下的總離子流圖，利用提取離子流技術(shù)、結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律及相關(guān)文獻(xiàn)，初步推斷出尿樣中的大黃硝石湯原形成分22種，為進(jìn)一步研究大黃硝石湯的體內(nèi)代謝提供基礎(chǔ)。

大黃硝石湯；原形成分；高效液相-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用

大黃硝石湯首次記載于東漢張仲景所著的《金匱要略》，“黃疸腹?jié)M，小便不利而赤，自汗出，此為表和里實(shí)，當(dāng)下之，宜大黃硝石湯”[1]，是濕熱黃疸的代表方。其由大黃、芒硝、黃柏、梔子四味藥組成，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃硝石湯能夠降低濕熱黃疸大鼠模型血清酶活性、血清總膽紅素水平，降低肝脾指數(shù)比等，使異常的生理生化指標(biāo)趨于正常，具有較好的保肝利膽退黃作用[2]。

目前關(guān)于大黃硝石湯的研究報道主要集中于其酸堿藥對對合煎的影響以及特征成分的含量測定[3-4]，而方劑其他方面的研究目前尚未有更多報道。為了更好的研究大黃硝石湯在體內(nèi)的作用過程，我們進(jìn)行了大鼠灌胃大黃硝石湯(18g/kg)后尿液中原形藥成分的鑒別，運(yùn)用LC-ESI-TOF/MS技術(shù)，依據(jù)保留時間、精密質(zhì)量和碎片離子等信息，并結(jié)合文獻(xiàn)對尿樣中原形藥成分進(jìn)行歸屬，為方劑的體內(nèi)作用過程研究提供更多依據(jù)。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1主要儀器與裝置

Agilent液質(zhì)聯(lián)用儀(包括Agilent-1260LC高效液相色譜儀，Agilent-6230飛行時間質(zhì)譜儀和MassHunterB.04.00軟件)，安捷倫公司；AnkeTGL-16B高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；水浴鍋，江蘇省醫(yī)療器械廠；AB135-S分析天平，美國梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮升生化儀器廠；高速多功能粉碎機(jī)，上海冰都電器有限公司；XW-80A渦旋混合器，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠。

1.2主要材料和試劑

生梔子(產(chǎn)地江西，批號：150627)；大黃(產(chǎn)地甘肅，批號：150410)；黃柏(產(chǎn)地東北，批號：15048)；芒硝(山西，批號：15051)均采購于南京先聲藥店。大黃為蓼科植物藥用大黃RheumofficinaleBaill. (Polygonaceae)的干燥根和根莖；梔子為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis(Rubiaceae)的干燥果實(shí)；黃柏為蕓香科植物黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid.(Rutaceae)的干燥樹皮；硝石為天然硫酸鈉經(jīng)加工精制而成的結(jié)晶體。

甲醇(特級純)，江蘇漢邦科技有限公司；純凈水，杭州哇哈哈集團(tuán)有限公司；冰乙酸(分析純)，南京化學(xué)試劑有限公司；甲酸(分析純)，南京化學(xué)試劑有限公司；乙腈(分析純)，南京化學(xué)試劑有限公司。

1.3動物實(shí)驗(yàn)

6只(220±20)gSD大鼠：由南京青龍山動物養(yǎng)殖中心動物飼養(yǎng)。在代謝籠中，水和食物可以自由獲得。每只大鼠灌胃給藥大黃硝石湯(18g/kg)，收集給藥后尿樣(0～24h)，4000r/m離心10min后在-20 ℃下保存。

1.4實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1色譜條件

LichrospherC18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，柱溫35 ℃。以甲醇為A相，0.1%甲酸為B相，按如下程序洗脫：0min，5%A；12min，10%A；18min，16%A；27min，20%A；38min，23%A；42min，27%A，保持4min；52min。29%A；66min，40%A；77min，45%A；92min，65%A；99min，80%A；113min，95%A，保持7min；125min，5%A，保持5min。進(jìn)樣量10μL，進(jìn)樣溫度4 ℃，DAD波長掃描范圍210～600nm，紫外檢測波長258nm。

1.4.2質(zhì)譜條件

干燥氣流速10.0L/min；干燥氣溫度350 ℃；霧化氣壓力35psig；裂解電壓175V、225V；毛細(xì)管電壓4000V/-3500V；質(zhì)譜掃描范圍：100～1100Da。

質(zhì)量校正：參比溶液通過參比Nebulizer與樣本同時導(dǎo)入離子源進(jìn)行實(shí)時參比，正離子模式下選擇離子121.988109和922.009798，負(fù)離子模式下選擇離子112.985587和1033.988109進(jìn)行質(zhì)量校正。

1.5樣品制備

1.5.1大黃硝石湯凍干粉的制備

各味藥材臨用前粉碎，取大黃12g，黃柏12g，梔子9g，加全方10倍量(450mL)的水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，四層紗布過濾；向?yàn)V渣中加入450mL水，武火煮沸，文火煎煮30min，四層紗布過濾；向?yàn)V渣中加入450mL水，武火煮沸，文火煎煮30min，并在最后加入芒硝12g，溶解后四層紗布過濾；合并三次濾液，放置至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮(45 ℃，-0.10MPa)，將濃縮后的大黃硝石湯凍干制成凍干粉。

1.5.2尿樣前處理

取給藥尿樣1mL，加入兩倍體積(2mL)的4 ℃乙腈。渦旋3min后，12000r/min離心10min，取上清液，35 ℃水浴吹干，用1mL5%甲醇復(fù)溶，渦旋3min后，12000r/min離心5min，取適量上清液至進(jìn)樣小瓶中自動進(jìn)樣分析。

2　結(jié)果與討論

2.1尿樣前處理方法考察

本實(shí)驗(yàn)檢測對象為生物樣本，生物樣品的預(yù)處理是體內(nèi)藥物分析的一個重要步驟，樣品中含有大量的內(nèi)源性物質(zhì)，不僅能與藥物及其代謝物結(jié)合，且常干擾測定。因此，生物樣中的藥物必須經(jīng)過分離、純化、富集，考慮到鼠尿中主要內(nèi)源性物質(zhì)以尿素、尿酸、肌酐等非蛋白含氮有機(jī)物為主，同時大黃硝石湯作為復(fù)雜體系所含化學(xué)成分極性跨度較大，故選用可最大程度保證待測成分完整性的有機(jī)溶劑沉淀作為對尿液樣本純化的方法。在比較了甲醇和乙腈作為沉淀劑對于尿樣的純化效果后，最終選定以2倍體積的4 ℃乙腈作為沉淀劑。

2.2質(zhì)譜結(jié)果

圖1為大黃硝石湯尿樣正負(fù)離子兩個模式下的總離子流圖。由圖1可以看出，在所建立的梯度洗脫條件下，大黃硝石湯尿樣色譜圖中各峰分離良好。

圖1　大黃硝石湯尿樣總離子流圖

2.3尿樣中大黃硝石湯原形藥成分鑒定

表1列出了大黃硝石湯尿樣中檢出的原形藥成分22個，利用提取離子流并結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律，同時結(jié)合文獻(xiàn)可對原形藥成分進(jìn)行歸屬。在初步確定的成分中可分為：鞣質(zhì)類，蒽醌類，環(huán)烯醚萜類，藏紅花苷類，黃酮類及生物堿類，各類結(jié)構(gòu)鑒定分析如表1所示。

表1　大黃硝石湯尿樣中原形藥成分鑒定Table 1　Identification of xenobiotics of Dahuangxiaoshi Decoction in rat urine

續(xù)表1

1041.354549,573,585550.1898225,207Genipin-gentiobioside1143.423356356.1862311Menisperine1247.069411,387388.1369225,207,101Geniposide1349.877356355.1784192Tetrahydropalmatine1465.636338338.1392308Jatrorrhizine1568.636336336.1236321,306,278Berberine1669.703352352.1549336,321Palmatine1777.192609,633610.1534301303Rutin18100.388285286.0477257,241Citreorosein19101.083269,271270.0528239241Aloe-emodin20103.401253254.2579225Chrysophanol21104.818283,285284.0321239,211,183Rhein22108.859269270.0528241,225emodin

2.3.1鞣質(zhì)類成分

峰1、峰2均產(chǎn)生m/z169碎片離子，同時產(chǎn)生了m/z125的碎片離子，由此推斷其結(jié)構(gòu)中有沒食子酸結(jié)構(gòu)。其準(zhǔn)分子離子[M-H]-分別為m/z331和m/z169，峰1丟失1分子葡萄糖基團(tuán)(162Da)出現(xiàn)m/z169的碎片離子，參考文獻(xiàn)[5]推斷峰1為galloyl-glucopyranose。峰2的準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z169，失去一分子CO2得到m/z125的碎片離子，可推斷峰2對應(yīng)的物質(zhì)為gallicacid。

2.3.2蒽醌類成分

由于蒽醌類化合物用ESI電離容易脫氫而帶負(fù)電荷，其在負(fù)離子掃描模式下會有更好的質(zhì)譜響應(yīng)。在負(fù)離子模式下，峰19、峰22的準(zhǔn)分子離[M-H]-均為m/z269，分子式為C15H10O5，為一對同分異構(gòu)體。毛細(xì)管出口電壓為175V時，峰19、峰22的準(zhǔn)分子離子[M-H]-分別為m/z269和m/z269，通過增加毛細(xì)管出口處的電壓至225V時，可發(fā)現(xiàn)峰19首先脫掉CHO生成m/z240離子，而峰22首先脫CO生存m/z241離子，后進(jìn)一步脫O生成m/z225離子。由此可推斷峰19、22分別為aloe-emodin和emodin。峰20的準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z253，可脫去1分子CO碎片生成m/z225離子，結(jié)合文獻(xiàn)[6]，可初步推斷峰20為chrysophanol。峰18的裂解則是先脫去1分子CHO生成m/z257離子，再脫O生存m/z241離子，結(jié)合其分子離子[M-H]-m/z285，可推斷為6-羥基大黃素。峰21有rhein的特征性283→239裂解，其后進(jìn)一步脫去1分子和2分子CO生存m/z211和m/z183，可推斷峰21為rhein。

2.3.3環(huán)烯醚萜類

環(huán)烯醚萜類化合物是梔子中的主要藥效成分，其質(zhì)譜裂解以糖苷鍵斷裂為主[7]。峰12對應(yīng)物質(zhì)在正離子圖譜中出現(xiàn)m/z411[M+Na]+加和離子峰，在負(fù)離子圖譜中出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z387[M-H]-，并脫去一分子葡萄糖基(162Da)生成離子m/z225。毛細(xì)管出口處電壓提高至225V時，進(jìn)一步碎裂產(chǎn)生m/z207和m/z101碎片，綜合文獻(xiàn)[8-9]，可推斷峰12對應(yīng)為geniposide。峰10在其提取離子流譜中出現(xiàn)m/z549[M-H]-，以及m/z573[M+Na]+和585[M+Cl]-的加和離子峰，而其m/z549→m/z225→m/z207的裂解途徑與文獻(xiàn)報道基本一致，可推斷該化合物為genipin-gentioliosde。

峰3的準(zhǔn)分子離子峰為m/z391[M-H]-，其進(jìn)一步碎裂產(chǎn)生m/z229和m/z185，其中m/z229可推斷為m/z391脫去一分子葡萄糖結(jié)構(gòu)，m/z185則是進(jìn)一步脫去一分子CO2后的碎片，可推斷峰3為shanzhiside。峰4的分子離子峰為373[M-H]-，其進(jìn)一步裂解產(chǎn)生m/z211，可推斷為丟失一分子葡萄糖基結(jié)構(gòu)的碎片，同時存在m/z747[2M-H]-離子，可推斷該峰對應(yīng)化合物為geniposidicacid。峰5的準(zhǔn)分子離子峰m/z403[M-H]-及m/z449[M+HCOO]-加和峰，以及脫去一分子葡萄糖結(jié)構(gòu)生存的m/z241碎片，可推斷其對應(yīng)的化合物為Gardenoside。

2.3.4藏紅花苷類化合物

由峰6的一級掃描質(zhì)譜圖可知其準(zhǔn)分子離子峰為m/z345[M-H]-，同時其存在加和峰m/z381[M+Cl]-和m/z369 [M+Na]+，其進(jìn)一步裂解產(chǎn)生m/z165[M-H-Glc-H2O]，可推斷為Picrocrocinicacid。

2.3.5黃酮類化合物

峰17的分子離子峰為m/z609[M-H]-，同時有加和離子m/z633[M+Na]+。其正離子模式下脫去一分子鼠李糖結(jié)構(gòu)和一分子葡萄糖結(jié)構(gòu)得到離子m/z303，負(fù)離子模式下則按相同裂解方式得到m/z301，結(jié)合文獻(xiàn)[10]可推斷該峰對應(yīng)化合物為rutin。

2.3.6生物堿類

(1)原小檗堿型生物堿峰14、15、16對應(yīng)物質(zhì)均為原小檗堿型生物堿，檢測到的母離子峰為[M]+峰，裂解途徑主要以取代基的碎裂為主。峰14的分子離子[M]+為m/z338，脫去兩分子甲基生成離子m/z308，結(jié)合文獻(xiàn)[11-12]可推斷為jatrorrhizine。峰15、16的分子離子[M]+為m/z336和m/z352，峰23的碎片離子有m/z321[M-CH3]+、m/z306[M-2CH3]+及m/z278[M-2CH3-CO]+，峰24的碎片離子有m/z336[M-CH3-H]+、m/z321[M-2CH3-H]+等。比較文獻(xiàn)可初步推斷峰15、16為berberine和palmatin。

(2)四氫原小檗堿型生物堿峰13準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+峰為m/z356，其進(jìn)一步裂解可得到碎片離子m/z192，這是明顯發(fā)生了RDA裂解后生成的含氮碎片離子，可推斷峰13為tetrahydropalmatine。峰7分子離子[M]+為m/z342，同時也存在m/z192這一RDA裂解的特征離子，以及進(jìn)一步脫去一分子CH3的m/z177和CHO的m/z148，可推斷為phellodendrine。

(3)阿樸啡型生物堿峰8、9、11在m/z160～220間沒有RDA裂解形成的高豐度碎片離子，碎片離子主要集中在m/z290～350的高端質(zhì)譜區(qū)。峰8分子離子[M]+為m/z342，脫去一分子CH2O生成m/z312，進(jìn)一步碎裂得到m/z282[M-(CH3)2NH-CH3]+和m/z265[M-(CH3)2NH-CH3OH]+，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)推斷峰8為magnoflorine。峰9分子離子為m/z314，同時得到碎片離子m/z269[M-(CH3)2NH]+，可推斷峰9為oblongine。峰11的分子離子[M]+為m/z356，同時得到碎片離子m/z311[M-(CH3)2NH]+，可推斷為menisperi。

3　結(jié)　論

本實(shí)驗(yàn)以現(xiàn)代分析技術(shù)LC-MS為依托，對大鼠灌胃大黃硝石湯后尿樣中的原形成分進(jìn)行了鑒別，最終推斷出包含蒽醌類、生物堿類、環(huán)烯醚萜類為主的共22種原形成分，均為單味藥中的主要活性成分之一。此次實(shí)驗(yàn)為大黃硝石湯復(fù)方的體內(nèi)代謝研究提供了更多的物質(zhì)基礎(chǔ)，可通過對尿樣中代謝物的鑒別對其進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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Identification of Xenobiotics of Dahuangxiaoshi DecoctioninRatUrinebyLC-TOF/MS

XIE Rui1, FENG Fang1,2

(1 School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Jiangsu Nanjing 210009;2 Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance (China Pharmaceutical University),Ministry of Education, Jiangsu Nanjing 210009, China)

Thehighperformanceliquidchromatography-TOF/MS(LC-TOF/MS)wasusedtoidentifythexenobioticsofDahuangxiaoshidecoctioninraturine.ObtainedtheTICinpositive/negativemode, 22xenobioticsweretentativelyidentifiedordeducedaccordingtoreferencesandtheirdatainconnectionwithextractedionschromatographictechnique,whichcouldbeafoundationforfurtherstudyonthemetabolismofDahuangxiaoshiDecoction.

Dauhuangxiaoshidecoction;xenobiotics;highperformanceliquidchromatography-TOF/MS(LC-TOF/MS)

謝瑞(1991-)，男，中國藥科大學(xué)碩士，藥物分析方向。

馮芳，中國藥科大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，方向藥物質(zhì)量研究與評價。

R927.1

A

1001-9677(2016)013-0118-04