六味補血顆粒中芍藥苷和阿魏酸含量的測定

魯赤姣，王文淵

(1 湖南永州市產商品檢驗所，湖南　永州　425100；2 湖南永州職業技術學院，湖南　永州　425100)

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六味補血顆粒中芍藥苷和阿魏酸含量的測定

魯赤姣1，王文淵2

(1 湖南永州市產商品檢驗所，湖南永州425100；2 湖南永州職業技術學院，湖南永州425100)

建立了HPLC梯度洗脫法測定六味補血顆粒中芍藥苷和阿魏酸的含量。方法 采用Platisil ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相；流速1.0 mL/min；檢測波長284 nm；柱溫：25 ℃。結果表明：芍藥苷在8.512～212.8 μg·mL-1的范圍內峰面積積分值與濃度呈良好的線性關系(r=0.9998)，平均回收率為99.71%，RSD=1.08%(n=6)；阿魏酸在0.908～22.7 μg·mL-1的范圍內峰面積積分值與濃度呈良好的線性關系(r=0.9999)，平均回收率為99.02%，RSD=1.57% (n=6)。該法準確、簡便，重現性好，可作為六味補血顆粒制劑質量控制的有效方法。

六味補血顆粒；芍藥苷；阿魏酸；含量測定

具有養氣補血功效的六味補血顆粒，臨床用于治療氣血兩虛、神疲乏力、頭昏眼花等癥狀。六味補血顆粒是以當歸、白芍、川芎、黃芪、熟地黃、紫草六味中藥為原料提取制成的復方制劑，其中白芍、當歸、川芎為方中主藥。白芍中的主要活性成分芍藥苷具補血助氣、調經、平肝止痛之功效[1-2]，當歸、川芎中的主要活性成份阿魏酸具有活血行氣、祛風止痛、改善血液微循環、抑制血小板聚集、抗氧化和清除自由基作用[3-4]。現行使用的質量標準僅以測定芍藥苷的含量來控制制劑的質量[5-6]，本試驗采用反相高效液相色譜梯度洗脫法同時測定芍藥苷和阿魏酸兩種主要活性成分的含量，以便控制產品中白芍、當歸、川芎3味主藥材的質量，進一步提高與完善該制劑的質量控制方法。

1　實　驗

1.1儀器

Waters 2489高效液相色譜儀(廣州逸?？萍加邢薰?；Empower Waters工作站；Waters 2489 UV檢測器；Platisil ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；FA-2004電子天平，常州科源電子有限公司；PL-J40D超聲波清洗器，東莞康士潔超聲波科技有限公司。

1.2試藥

芍藥苷對照品(批號110736-201427)，中國食品藥品檢定研究院；阿魏酸對照品(批號07773-201415)，中國食品藥品檢定研究院；六味補血顆粒樣品(批號20150706，20150707，20150709，20150710)與陰性樣品均由湖南敬和堂藥業有限公司提供；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2　結果與討論

2.1色譜條件

Platisil ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長284 nm；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液，洗脫方式：梯度洗脫，程序見表1。

表1　梯度洗脫程序表

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備

用電子天平準確稱量21.28 mg干燥的芍藥苷對照品，以60%甲醇為溶劑溶解并定容于50 mL容量瓶中，得濃度為425.6 μg·mL-1的芍藥苷對照品溶液。準確稱量9.08 mg阿魏酸對照品，加入1 mL鹽酸，以60%甲醇為溶劑溶解并定容于200 mL棕色容量瓶中，得濃度為45.4 μg·mL-1的阿魏酸對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備

避光操作，取本品研細(過四號篩)，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取50 mL60%甲醇加入，密塞，稱定重量，超聲40 min，放冷，再稱定重量，補足溶劑揮發減失的重量，濾過，棄去初濾液，準確移取續濾液25 mL，水浴蒸干，用甲醇-0.1%磷酸溶液(40:60)溶解并定容于10 mL棕色容量瓶中，用0.45 μm濾膜濾過，制得供試品溶液。

2.2.3陰性對照溶液的制備

取陰性供試制劑(缺白芍、當歸、川芎藥材的陰性制劑)，照供試品溶液項下的方法制備陰性對照溶液。

圖1　高效液相色譜圖

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，供試品色譜圖中，在與對照品色譜峰相應的位置上有相同的色譜峰，主峰與其它色譜峰達到基線分離，陰性對照無此峰且無干擾，見圖1。

2.3方法學考察

2.3.1線性關系考察

避光操作，精密吸取芍藥苷對照品溶液(425.6 μg·mL-1)和阿魏酸對照品溶液(45.4 μg·mL-1)各0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇-0.1%磷酸溶液(40:60)稀釋至刻度，混勻。分別吸取20 μL，依次注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定。以芍藥苷、阿魏酸濃度(μg·mL-1)為橫坐標，相對應的峰面積值為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程分別為：

芍藥苷: Y=2584.047X+184.283，r=0.9998

阿魏酸: Y=5937.543X-381.574，r=0.9999

結果表明，芍藥苷在8.512～212.8 μg·mL-1、阿魏酸在0.908～22.7 μg·mL-1范圍內具有良好的線性關系。

2.3.2精密度試驗

分別吸取同一對照品溶液20 μL，重復進樣6次，測定芍藥苷、阿魏酸峰面積積分值，并計算各自的RSD，見表2，結果表明該方法精密度良好。

表2　精密度試驗

2.3.3穩定性試驗

避光操作，分別精密吸取供試品(批號20150709)溶液20 μL，于0、3、6、9、12、15 h按上述色譜條件進樣測定，計算芍藥苷與阿魏酸峰面積的RSD，見表3，結果表明在15 h內穩定性較好。

表3　穩定性試驗(n=7)

2.3.4重復性試驗

取同一樣品(批號20150709)粉末6份，每份約1.0 g，精密稱定，按供試品溶液制備項下操作，各精密吸取20 μL進樣，測定芍藥苷和阿魏酸的含量，并計算芍藥苷和阿魏酸含量測定值的RSD，見表4，結果表明重復性良好。

表4　重復性試驗(n=6)

續表4

61.490.040平均值1.470.035RSD/%0.921.13

2.3.5回收率實驗

取已知含量(每克含芍藥苷1.47 mg、阿魏酸0.035 mg)的本品(批號20150709)細粉6份，每份約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分成三組，每組分別精密加入芍藥苷對照品溶液1.5、2.0、2.5 mL，阿魏酸對照品溶液0.5、1.0、1.5 mL，按供試品溶液制備項下操作，各精密吸取20 μL進樣，測定芍藥苷和阿魏酸的含量，計算回收率，結果見表5。

表5　加樣回收試驗結果(n=6)

2.3.6樣品測定

取5批六味補血顆粒，按供試品溶液制備法依法制備樣品溶液。分別精密量取樣品溶液和芍藥苷與阿魏酸的混合對照品標準溶液各20 μL進樣，按上述色譜條件測定，外標法計算含量，測定結果見表6。

表6　樣品含量測定結果(n=3)

3　討　論

(1) 超聲時間的考察 用該法對六味補血顆粒中芍藥苷和阿魏酸的含量進行測定的過程中，比較了超聲提取時間對芍藥苷和阿魏酸含量測定的影響，試驗中發現，超聲提取40 min后，芍藥苷和阿魏酸的含量基本不變，可認為提取完全。故將超聲提取時間確定為40 min。

(2)保護措施的確定 阿魏酸是丙烯酸衍生物，性質不穩定，見光極易分解，但在酸性溶液中穩定性增強，故在對照品和樣品溶液的制備過程中，采用酸化及避光操作等保護性措施。

(3) 檢測波長的選擇 采用紫外分光光度計對芍藥苷與阿魏酸對照品溶液進行吸收掃描，發現芍藥苷與阿魏酸的最大吸收分別在232 nm、320 nm，但二者在284 nm波長處均有較大吸收，因此，選擇284 nm作為檢測波長。

使用梯度洗脫法同時測量六味補血顆粒中芍藥苷和阿魏酸的含量，可監控產品中3味主藥材的質量。同時，該方法的準確度高，重現性好，操作簡單，適用于六味補血顆粒的質量控制。

[1]利創華,林艷菲,丘思蘭,等. 歸芍調經口服液質量標準研究[J].湖北中醫藥大學學報，2013,15(3):43-46.

[2]張傳平,呂紫璇,李洪斌. 反相高效液相色譜法測定冠心生脈丸中芍藥苷含量[J].中國藥業，2015,24(2):50-51.

[3]趙東平,楊文鈺,陳興福. 阿魏酸的研究進展[J]. 時珍國醫國藥, 2008,19(8):1839-1841.

[4]胡益勇,徐曉玉. 阿魏酸的化學和藥理研究進展[J].中成藥,2006,28(2):253-255.

[5]周祖坤,孫代華,凌颯. 高效液相色譜法測定當歸芍藥顆粒劑中芍藥苷的含量[J].藥物分析雜志,2006,26(7):1001-1003.

[6]王文淵,龍紅萍,卜生高. HPLC同時測定六昧補血顆粒中芍藥苷和阿魏酸的含量[J].湖南師范大學學報(醫學版),2008,5(1):58-60.

Determination of Paeoniflorin and Ferulic Acid in Liuweibuxue Granules

LUChi-jiao1，WANGWen-yuan2

(1 Hunan Yongzhou Products Inspection Institute，Hunan Yongzhou 425100;2 Hunan Yongzhou Vocational Technical college，Hunan Yongzhou 425100, China)

An HPLC method for determination of Paeoniflorin and ferulic acid in Liuweibuxue granules was established. The analytical column was Platisil ODS (150 mm×4.6 mm) filled with at 5 μm stationary phase, using methanol-0.1%phosphoric acid gradient elution as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min-1, the detection wavelength was 284 nm，and the column temperature was 25 ℃. Results showed that the linear range for Paeoniflorin and ferulic acid were 8.512～212.8 μg·mL-1(r=0.9998) and 0.908～22.7 μg·mL-1(r=0.9999), the average recovery was 99.71% (RSD=1.08%) for Paeoniflorin and 99.02% (RSD=1.57%) for ferulic acid. The method is simple, accurate and reproducible, and suitable to be used in quality control of liuweibuxue granules.

Lliuweibuxue granules; ferulic acid; Paeoniflorin; determination

魯赤姣(1972-)，女，工程師，從事產品質量分析檢測。

R917

A

1001-9677(2016)010-0156-03