林地蘑菇ITS鑒定及生物學特性初步研究*

馮連榮　張　妍　梁德軍　宋立志　矯麗曼　王勝東

（遼寧楊樹研究所，蓋州　115213）

林地蘑菇ITS鑒定及生物學特性初步研究*

馮連榮張妍梁德軍宋立志矯麗曼王勝東**

（遼寧楊樹研究所，蓋州115213）

對采集的野生林地蘑菇子實體進行菌種分離后的研究結果表明，林地蘑菇分離株rDNA ITS片段長度為705bp，測序結果登錄NCBI與GenBank中已知菌種進行BLAST比對，序列相似性在99%～91%之間，下載相似高的ITS序列，用Clustal W進行序列比對，MEGA 2.0軟件構建系統樹，結合形態特征，鑒定分離菌種為林地蘑菇純菌種。生物學特性研究結果表明：適宜菌絲生長的碳源為可溶性淀粉，適宜的氮源為硫酸銨，適宜的無機鹽為硫酸鈣和磷酸二氫鉀，菌絲最適溫度為25～30℃。

林地蘑菇；ITS鑒定；生物學特性

林地蘑菇（Agaricus silvaticus）屬傘菌目、蘑菇科、蘑菇屬（Agaricus），在黑龍江、吉林、遼寧、江蘇、浙江等地均有分布，夏秋季于針闊葉林中單生至群生。蘑菇屬真菌在我國有著廣泛分布，是選育栽培品種的重要對象，其中雙孢蘑菇（A.bisporus）、雙環蘑菇（A.bitorquis）、姬松茸（A.blazei）等更是世界范圍的栽培種，在世界食用菌產業中占有非常重要的地位［1］。林地蘑菇作為一種可食用的野生食用菌，相對于上述廣泛栽培的品種而言，相關研究還比較少。為了解林地蘑菇的特性，本研究采用組織分離法對采集的野生林地蘑菇子實體進行菌種分離，結合形態特征及分子生物學手段對菌種進行了鑒定，并對林地蘑菇菌絲生長所需的碳源、氮源、無機鹽及培養溫度等進行了初步研究，以期為林地蘑菇的開發利用奠定基礎。

1　試驗材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1子實體

林地蘑菇子實體于2012年采自原遼寧省楊樹研究所小園內。

1.1.2培養基

PDA/PSA培養基：馬鈴薯200 g/L+葡萄糖/蔗糖20 g/L+瓊脂18 g/L，pH值自然。

基礎培養基：葡萄糖20 g/L+蛋白胨2 g/L+ MgSO4·7H2O 1 g/L+瓊脂18 g/L，pH6.5。

1.1.3主要試劑及引物

TIANGEN DNA secure新型植物基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR擴增試劑購自 Thermo；ITS分析所用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3'）/ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2試驗方法

1.2.1林地蘑菇形態鑒定及菌種分離

對采集的子實體進行形態鑒定，觀察新鮮子實體的顏色、形狀、著生方式及附屬物等，測定菌蓋和菌柄的大小，用顯微鏡對孢子形態特征進行觀察。

采用組織分離法對林地蘑菇進行菌種分離。首先用70%酒精棉擦洗菌蓋及菌柄部位進行表面消毒，在酒精燈火焰附近，用手將子實體從菌柄基部向菌蓋處撕開，用燃燒后的手術刀片將菌蓋與菌柄之間的菌肉切成小方塊，然后用滅過菌的鑷子夾取一小塊菌肉組織，放入事先準備好的裝有無菌培養基的PDA平板培養基中，置于25℃培養箱中黑暗培養。菌絲直徑達到2 cm后，進行純化培養，記為LD，培養好的菌種置于4℃冰箱中存放。

采用玻片培養法進行菌絲形態觀察。用打孔器打取菌絲圓片，接種在培養皿中心位置，將處理好的蓋玻片斜插到平板中，每皿插入兩片，待菌絲長到蓋玻片中央時，用鑷子輕輕將蓋玻片抽出，蓋玻片中有菌絲的一面朝上，用顯微鏡觀察。

1.2.2林地蘑菇的ITS鑒定

分離得到的菌種接種到PDA平板培養基中，25℃下靜置暗光培養，待菌絲長滿平板后，刮取菌落邊緣的新鮮菌絲，使用 TIANGEN公司的DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒進行基因組DNA提取，具體操作方法按照說明書進行。提取的DNA溶于25 μL TE（pH8.0）中，-20℃保存備用。

以基因組DNA為模板，應用真菌通用引物對ITS1和ITS4進行PCR擴增，參照張妍等［2］的反應體系及反應程序進行。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至寶生物工程（大連）有限公司進行測序。

1.2.3ITS序列分析與進化樹構建

測序結果登錄GenBank進行BLAST比對，找出與之最大相似性的序列，下載相似性序列的ITS區域，用Clustalw進行多序列比對，并輔以人工修正，分析時所有參數均為軟件默認值。用MEGA 2.0軟件采用NJ法構建系統發育樹，進行系統發育分析。

1.2.4林地蘑菇生物學特性初步研究

1.2.4.1同步菌絲的制備

在超凈工作臺中，從分離的LD母種中挑取黃豆粒大小的菌絲塊，接種到綜合PDA平板培養基中央（培養皿直徑為90 mm），置于25℃培養箱中避光培養，待菌絲快長滿平皿時，用直徑6 mm的打孔器在平板上靠近菌絲邊緣相同直徑的圓圈上打取菌絲塊，保證試驗所用菌絲塊均為相同菌齡。

1.2.4.2菌絲生物學特性研究

碳源試驗：分別用果糖、麥芽糖、可溶性淀粉代替PSA培養基中的蔗糖，制成含有不同碳源的培養基配方，觀測不同碳源對菌絲生長的影響。

氮源試驗：分別用酵母膏、尿素、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨代替基礎培養基中的蛋白胨，制成含有不同氮源的培養基，觀測不同氮源對菌絲生長的影響。

無機鹽試驗：分別用磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鈣代替基礎培養基中的硫酸鎂，制成含有不同無機鹽的培養基，觀測不同無機鹽種類對菌絲生長的影響。

溫度試驗：以PDA為培養基，溫度設置20、25、30、35℃，觀測不同溫度對菌絲生長的影響。

1.2.4.3測定方法

各試驗處理菌種接種到平板培養基中央，每種處理重復5次，當其中一個處理菌絲長滿培養皿時結束試驗，每天測量菌絲餅直徑，計算菌絲生長速度，同時觀察菌絲長勢、濃密度等生長指標。

2　結果分析

2.1林地蘑菇形態特征

子實體（圖1-A）菌蓋直徑7.8 cm，扁半球形，近白色，覆有淺褐色鱗片。菌肉白色。菌褶初白色，漸變粉紅色，后栗褐色至黑褐色，離生，稠密，不等長。菌柄長8.5 cm，粗0.8 cm，白色，基部略膨大。菌環白色，膜質，單層，生菌柄上部。孢子印黑褐色，孢子褐色（圖1-B），光滑，橢圓形，基本符合《中國大型真菌》［3］對林地蘑菇的描述。子實體經組織分離后獲得純種菌絲，菌絲在PDA培養基上呈白色（圖1-C）。顯微鏡下觀察菌絲有隔，有索狀聯合（圖1-D）。

圖1　林地蘑菇形態特征

2.2菌絲DNA提取及ITS-PCR擴增

提取的DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2-A），DNA條帶清晰、較明亮，可以作為PCR反應的模板。以 DNA為模板，ITS1、ITS4為引物對rDNA ITS區段PCR擴增結果顯示，片段大小約為700 bp左右（圖2-B）。

2.3序列相似性搜索及進化樹構建

rDNA ITS區段序列測定結果顯示，PCR擴增產物長度為705bp。測序結果登錄GenBank核酸序列數據庫進行Blastn搜索，與登錄號JF797178.1 （A.silvaticus）的菌種覆蓋度最高達100%，相似性達99%。得到的序列相似性在99%～91%之間，全部為蘑菇屬的不同種。下載相似高的ITS序列，用Clustal W進行序列比對，并輔以人工修正后，基于分離株以及來自GenBank的最相似蘑菇屬16個種的ITS序列，用MEGA 2.0軟件采用NJ法構建系統樹（采用默認值，圖3）。從系統樹可看出，LD中的菌種與蘑菇屬中的林地蘑菇聚為一支，結合形態特征，鑒定分離菌種為林地蘑菇純菌種。

圖2　林地蘑菇DNA瓊脂糖凝膠及PCR擴增電泳圖

圖3　林地蘑菇及來自GenBank的組相似物種的ITS序列構建的NJ系統發育樹

2.4菌絲的生物學特性

2.4.1不同碳源對菌絲生長的影響

4種碳源均可以被林地蘑菇菌絲所利用（表1），其中以可溶性淀粉作為碳源時菌絲長勢最強，菌絲健壯而濃密，與其他碳源相比差異顯著。其次是蔗糖、麥芽糖和果糖，三者對菌絲生長速度的影響差異不顯著，但果糖菌絲致密程度不如麥芽糖和蔗糖。

表1　不同碳源對林地蘑菇菌絲生長及生長勢的影響

2.4.2不同氮源對菌絲生長的影響

菌絲在硫酸銨為氮源的培養基上生長快而健壯，菌絲濃密，與其他氮源培養基上的菌絲生長速度差異顯著；其次是以蛋白胨作為氮源的培養基菌絲生長較好；而以尿素為氮源時，菌絲不能生長（表2）。可見，進行林地蘑菇菌絲培養時宜選擇硫酸銨作為氮源，尿素不宜選用。

表2　不同氮源對林地蘑菇菌絲生長及生長勢的影響

2.4.3不同無機鹽對菌絲生長的影響

不同的無機鹽對林地蘑菇菌絲生長具有一定的影響，在添加硫酸鈣和磷酸二氫鉀的培養基中，菌絲生長速度快，菌絲健壯而濃密；添加硫酸鎂的培養基中菌絲生長速度與硫酸鈣和磷酸二氫鉀相比差異顯著，菌絲生長較健壯但菌絲較稀；添加氯化鈉后菌絲長勢一般（表3）。

表3　不同無機鹽對林地蘑菇菌絲生長及生長勢的影響

2.4.4不同溫度對菌絲生長的影響

林地蘑菇菌絲在20～30℃范圍內可以生長，隨著溫度上升，菌絲生長速度逐漸加快；當溫度超過35℃以后菌絲不能生長。試驗表明，林地蘑菇菌絲生長的適宜溫度為25～30℃（表4）。

表4　不同溫度對林地蘑菇菌絲生長及生長勢的影響

3　結論與討論

3.1ITS是核糖體rDNA中介于18S與5.8S之間、5.8S與28S之間的內部轉錄間隔區，其保守性表現為種內相對一致，種間高度特異［4］。ITS序列通過與GenBank數據庫進行BLAST檢索比對，序列相似性≥99%，可以鑒別為相同種；序列相似性為95%～99%，可以鑒別為相同屬［5］。該方法在大型真菌屬內種間及種群分類研究中應用日益廣泛［6-7］。本研究對采集的野生林地蘑菇進行了菌種分離，并結合子實體、菌絲、孢子等形態特征，輔以rDNA ITS序列的比較分析及NJ法系統發育樹的構建，鑒定了所分離的菌種為林地蘑菇純種菌絲。

3.2本研究利用單因素試驗確定了林地蘑菇培養階段適宜的碳源為可溶性淀粉，這與胡潤芳的研究結果一致；適宜的氮源為硫酸銨，不宜選用的氮源為尿素；適宜的無機鹽為硫酸鈣和磷酸二氫鉀；適宜培養溫度為25～30℃，與雙孢蘑菇［8］、大肥菇［9］等蘑菇屬真菌相似。本研究只是進行了林地蘑菇生物學特性的初步研究，對于各因素之間有無交互作用，如何組合還需要進一步研究。

［1］李榮春.蘑菇屬不同種類、不同品種在不同培養基上的菌絲生長觀察［J］.中國食用菌，2000，19（增刊）:136-138.

［2］張妍，馮連榮，王克翰，等.卷邊樁菇組織分離與ITS序列分子鑒定［J］.林業科技通訊，2016（5）:8-11.

［3］卯曉嵐.中國大型真菌［M］.鄭州:河南科學技術出版社，2000.

［4］高磊.新疆南疆野生雙胞蘑菇的鑒定、生物學特性及其馴化栽培的研究［D］.塔里木:塔里木大學，2012.

［5］Renske L，Paula L，Thom W K，et al.Molecular Identification of Ectomycorrhizal Mycelium in Soil Horizons［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69（1）:327-333.

［6］高山，胡平，邊銀丙，等.基于ITS序列對3個側耳菌種的分子鑒定［J］.湖北農業科學，2008，47（12）:1390-1393.

［7］張微思，羅孝坤，張麗英，等.松茸菌絲體的純培養及其鑒定［J］.中國食用菌，2010，29（3）:34-36.

［8］侯志江，李榮春.蘑菇屬主栽種栽培特性比較及馴化展望［J］.云南農業大學學報，2009，24（3）:474-478.

［9］丁湖光.大肥菇生物特性及高產栽培［J］.特種經濟動植物，2006，9（8）:36.

第1作者簡介：馮連榮（1983-），女，博士研究生，工程師，主要從事食用菌栽培及楊樹轉基因育種研究。

（責任編輯：王岳）

Preliminary Study on ITS Sequence and Biological Characteristics of Agaricus silvaticus

FENGLianrong
（Liaoning Institue of Poplar，Gaizhou115213）

The species were identified by morphological characteristics and molecular biological methods. The results showed amplified by PCR of tissue isolates ITS rDNA fragment of Agaricus silvaticus.the length of the amplified product was 705bp，compared with the known species of GenBank and Blastn in NCBI，sequence similarity is between 99%～91%，download ITS sequences of strains with high similarity，sequence alignment by Clustal W，construct phylogenetic tree by MEGA2.0，By tree graph analysis，Identification of isolates is Agaricus silvaticus pure strains.The results showed that the suitable carbon source for mycelium growth was soluble starch.The nitrogen source suitable was ammonium sulfate，the suitable inorganic salt was calcium sulfate and potassium dihydrogen phosphate，the suitable temperature was 25～30℃.

Agaricus silvaticus；ITS sequence；Biological characteristics

S664.4

C

1001-9499（2016）04-0020-04

*遼寧省農業攻關及成果產業化項目（201420701）資助

王勝東（1966-），教授級高級工程師。

2016-06-30