汕頭地區4例散發創傷弧菌感染的實驗室診斷

陳樂川，朱紅軍，周澤妍，柯永堅，陳釧文（汕頭市中心醫院，廣東汕頭5503；汕頭潮南民生醫院，廣東汕頭 5544）

汕頭地區4例散發創傷弧菌感染的實驗室診斷

陳樂川1，朱紅軍1，周澤妍2，柯永堅1，陳釧文1
（1汕頭市中心醫院，廣東汕頭515031；2汕頭潮南民生醫院，廣東汕頭 515144）

目的 了解汕頭市某院創傷弧菌（VV）感染患者的病原微生物學特征及藥物敏感性。方法 回顧性分析汕頭市某院2013年6月—2014年6月收治的4例VV感染患者，采集患者血標本進行培養，采集患者皰液或棉拭子采集傷口分泌物接種于血平板、麥康凱平板及TCBS平板，對分離的菌株進行鑒定和藥敏試驗。結果 4例VV感染患者，其中死亡3例，治愈1例；分別因進食腌蟹、蒸扇貝或外傷后接觸海產品，而引起原發性敗血癥及下肢感染。患者A、B皰液，患者C傷口分泌物，患者D血培養均分離出氧化酶陽性、TCBS平板上生長呈綠色的革蘭陰性菌，均鑒定為VV。VV對頭孢唑林耐藥或中介，對頭孢替坦均為中介，1株VV對頭孢吡肟耐藥。結論 4例VV感染患者病死率高（3/4），皰液或傷口分泌物培養陽性率較血培養高；及時就診、盡早開始抗菌藥物治療及積極清創有助于治療該病。

創傷弧菌；藥敏試驗；抗藥性，微生物；耐藥性；食源性感染；傷口感染

［Chin J Infect Control，2016，15（4）：272—276］

創傷弧菌（Vibrio vulnificus，VV）為嗜溫、嗜堿、低度嗜鹽、嗜鐵的革蘭陰性（G—）菌，廣泛存在于近海環境及多種海產品中，可引起人原發性敗血癥（病死率超過50%）和嚴重傷口感染（病死率約25%）［1］。感染者多為免疫功能低下或原有基礎疾病者，通過進食未經煮熟的甲殼類海產品（尤其是生牡蠣），以及開放性傷口、破損皮膚暴露于帶菌海水而感染。自1976年首次被美國疾病控制與預防中心（CDC）鑒定并命名以來，世界多地及國內沿海地區如浙江、臺灣等地均有散在病例報道，潮汕地區罕見。本院于2013年6月—2014年6月共診治VV感染患者4例，現將其臨床特點及微生物實驗室鑒定過程予以報告。

1　對象與方法

1.1研究對象 2013年6月—2014年6月診治的4例VV感染患者，其中死亡3例，治愈1例。4例患者起病均表現為發熱、畏寒，繼發下肢腫脹、疼痛，并出現散在水泡及瘀斑似燙傷樣皮膚改變。病情進展迅速，3例雙下肢感染者（患者A、B、D）出現感染性休克，2～11 d因多器官功能衰竭而死亡；1例（患者C）左下肢受累，經清創換藥1月余并行創面清創植皮術后治愈。見表1。

表1　VV感染患者臨床基本資料Table 1 Basic clinical characteristics of patients infected with V.vulnificus

1.2儀器與試劑 法國生物梅里埃公司VITEK2 Compact全自動鑒定及藥敏分析儀、血培養儀BACT/ALERT3D。血瓊脂平板、麥康凱平板購自江門凱林貿易有限公司；TCBS平板由本實驗室新鮮配制（TCBS瓊脂購自北京陸橋技術股份有限責任公司），微量生化反應管購自杭州天和微生物試劑有限公司，血培養瓶為法國生物梅里埃公司產品。

1.3 方法

1.3.1標本采集 標本均由臨床醫生采集，用無菌注射器采集A、B、D患者水/血皰穿刺液密封送檢，用無菌棉簽采集C患者下肢感染傷口的膿性分泌物，置無菌管保濕送檢；同時，用需氧、厭氧瓶采集患者血標本進行培養。

1.3.2標本染色鏡檢及細菌分離 采用無菌注射器采集皰液標本轉至無菌管中，2 500 r/min離心15 min，以及采用棉拭子采集感染傷口膿性分泌物直接接種于血平板、麥康凱平板、TCBS平板，置37℃CO2培養箱中培養24 h，觀察結果，同時涂片行革蘭染色。血培養瓶置血培養儀培養，陽性者行涂片革蘭染色并轉種于上述培養基。

1.3.3菌株鑒定及藥敏試驗 于平板上挑取菌落制成0.5麥氏單位濁度懸液，采用法國生物梅里埃公司VITEK2 Compact全自動鑒定及藥敏分析儀，按儀器操作說明進行，結果判斷采用美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）2013年標準。

2　結果

2.1染色及培養結果 直接染色鏡檢：皰液及傷口分泌物標本均檢出少量G—桿菌，部分呈逗點狀（白細胞++～+++，上皮細胞未見）。見圖1。皰液、傷口分泌物標本37℃，CO2培養箱中培養24 h后，血平板上長出灰黃色、扁平、濕潤、不透明菌落；麥康凱平板上無細菌生長或生長不良；TCBS平板上長出綠色濕潤菌落。見圖2。挑取菌落涂片染色鏡檢，為G—桿菌，氧化酶陽性。與血培養陽性標本轉種培養基上的菌落生長情況基本相同。

2.2細菌學鑒定結果 所分離菌株經VITEK2Compact全自動鑒定及藥敏分析儀鑒定為創傷弧菌。見表2。

2.3藥敏試驗結果 VV對頭孢唑林耐藥或中介，對頭孢替坦均為中介，1株VV對頭孢吡肟耐藥，而對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢他啶、頭孢曲松、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、環丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、呋喃妥因、復方磺胺甲口惡唑等均敏感。見表3。

圖1　皰液及傷口分泌物細菌革蘭染色鏡下形態（×1 000）Figure 1 Microscopic morphology of gram staining bacteria from blister fluid and wound secretion（×1 000）

圖2　患者皰液標本在各營養培養平板上菌落生長情況Figure 2 Colonial growth of bacteria isolated from blister fluid on all kinds of culture media

表2　不同患者標本培養鑒定結果Table 2 Identification results of bacteria from different patients'specimens

3　討論

VV或稱海洋弧菌，隸屬弧菌屬第五群，G—菌、兼性厭氧、單極端單鞭毛，無芽孢、無異染顆粒、有莢膜，按生化反應特征可分為生物1、2和3型，引起人類感染的主要為生物1型。自然環境中該菌只能在鹽度為0.7%～1.6%、溫度＞20℃的水中生長［2］；抵抗力不強，冷凍或煮沸可被殺滅。通常環境分離株常無致病性，臨床分離株有致病性。感染病例多分布于熱帶和亞熱帶沿海地區，3～11月好發，夏季（海面水溫23～29℃）是發病高峰期［3］。其致病機制尚不明確，目前認為莢膜多糖（CPS）、運動鞭毛、Rtx毒素、鐵獲取能力等是必須的致病因子，脂多糖（LPS）、IV型菌毛、溶細胞素、金屬蛋白酶等亦可能發揮重要作用［1］。

本組4例VV感染患者，其中食源性感染2例（1例治愈），傷口感染2例。發病時間均為夏季，均表現為急起發熱伴畏寒，繼發下肢特征性大皰性皮損，并肝、腎、心、呼吸、循環功能不全，結合患者均有長期吸煙史、長期飲酒史（除患者B外），存在基礎疾病，并有海產品或海水接觸史等可作初步診斷，患者血、皰液、傷口分泌物等培養分離出VV而確診。抗菌藥物治療前及時采集的D患者血培養，分離出VV，而于其余3例患者（抗菌藥物治療后）采集的血標本均培養陰性。A、B患者皰液，以及C患者的傷口分泌物均分離出VV，陽性率高，適用于已應用抗菌藥物治療、血培養陰性者。實驗亦證實，經傷口感染VV的小鼠，其血培養（12 h）陽性率僅為20%，而傷口分泌物培養陽性率為100%，感染6 h后即可在小鼠傷口分離出VV，并持續12～72 h［4］。標本保溫送檢并及時接種，棉拭子保濕送檢，培養基置室溫復溫均影響細菌存活和培養陽性率。注射器抽取的皰液標本宜離心取沉淀物接種，以提高陽性率，或注入血培養瓶送檢。送檢同時告知必要的臨床資料，以及標本直接涂片的染色鏡檢，有助于實驗室選擇合適的培養基并采取有針對性的鑒定程序，縮短報告時間。鏡檢發現G—桿菌且氧化酶陽性、TCBS平板上生長呈綠色菌落，判斷分離到致病性弧菌，應作為危急值及時通知臨床。

本組VV對多種抗菌藥物敏感性較好，而對頭孢唑林耐藥或中介，對頭孢替坦均為中介，僅1例對頭孢吡肟耐藥，與韋俊超等［5］報道的（分離自膿性分泌物）相近，與潘軍航等［6］報道（分離自糞便樣本）結果存在差異，后者對氨基糖苷類抗生素（如阿米卡星、慶大霉素）耐藥；王志剛等［7］報道的臨床分離株對慶大霉素、妥布霉素、氨曲南和頭孢唑林耐藥。VV表型復雜，不同來源分離株的耐藥表型差異，抗菌藥物治療應結合藥敏試驗結果進行選擇。同時，環境分離株的耐藥現狀不容樂觀，海域分離株、患病魚的分離株、部分海/水產品分離株等對多種抗菌藥物，如青霉素類、磺胺類、頭孢菌素類、氨基糖苷類抗生素耐藥［4，8～9］。

及時就診并盡早使用抗菌藥物治療是影響患者預后的關鍵。本組患者所應用抗菌藥物，如亞胺培南/西司他丁、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦等均為敏感藥物，因就診時機不同而治療效果出現差異。出現感染性休克者抗菌藥物療效不佳，患者A、B、D分別于2、11 d后死亡；患者C起病2 d后就診，予頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦等治療有效。盧中秋等［10］認為，早期使用各類抗菌藥物治療均有效，但感染中晚期或嚴重感染時療效較差。

由于患者一般情況差，血小板降低及凝血功能障礙等不利于截肢手術，控制局部感染灶，并清創去除壞死組織尤為重要。患者C起病后自行使用消毒劑（具體不詳）頻繁清洗患處，入院后經積極清創換藥，局部敷聚維酮碘，病情逐漸穩定，于第47天行清創植皮術后痊愈。文獻［5，11］報道，VV感染患者單純行創口換藥1個多月后好轉，或經頭孢曲松靜脈滴注、呋喃西林局部濕敷治療20 d后痊愈。一周后患者B下肢傷口分泌物、痰分別多次分離出鮑曼不動桿菌和白假絲酵母菌，提示應預防合并其他細菌及真菌感染。

鐵是VV生長的必須營養，環丙沙星聯合鐵螯合劑和鐵調素激動劑體外實驗［12—13］提示，通過降低血清鐵水平，可抑制VV生長，利于改善感染預后。輸注壓積紅細胞的患者亦應及時去鐵。

臨床微生物實驗室應熟練掌握VV培養特性、鑒定要點及流行特點，同時應提高送檢意識，規范標本采集和送檢程序。汕頭地區素有食生腌貝甲類海鮮的習慣，應加強VV感染的科普宣教，規范海產品餐飲加工處理過程。對相關易感因素應采取有效防護措施，謹慎處理暴露于海水或接觸海產品的患者傷口，并及時就診。臨床及水產養殖中應避免抗菌藥物濫用，并加強VV耐藥性監測。

表3　4例感染患者分離的VV藥敏試驗結果（μg/mL）Table 3 Antimicrobial susceptibility testing results of V. vulnificus isolated from4 infected patients（μg/ mL）

［1］ Jones MK，Oliver JD.Vibrio vulnificus：disease and patho-genesis［J］.Infect Immun，2009，77（5）：1723—1733.

［2］ Nakafusa J，Misago N，Miura Y，et al.The importance of ser-um creatine phosphokinase level in the early diagnosis，and as aprognostic factor，of Vibrio vulnificus infection［J］.Br J Dermatol，2001，145（2）：280—284.

［3］ Klontz KC，Lieb S，Schreiber M，et al.Syndromes of Vibrio vulnificus infections.Clinical and epidemiologic features in Florida cases，1981—1987［J］.Ann Intern Med，1988，109 （4）：318—323.

［4］ 馬驄，郭建巍，郝秀紅，等.中國海域分離的創傷弧菌的致病性及其對抗生素的敏感性研究［J］.第四軍醫大學學報，2009，30（6）：493—496.

［5］ 韋俊超，潘軍航，李月華.一株新MLST型創傷弧菌的分離鑒定［J］.中國衛生檢驗雜志，2014，24（8）：1109—1115.

［6］ 潘軍航，葉菊蓮，朱敏，等.腹瀉樣本中創傷弧菌的檢測分析［J］.疾病監測，2012，27（1）：59—61.

［7］ 王志剛，邵平揚，吳曉燕，等.創傷弧菌的培養鑒定及其對抗菌藥物的敏感性［J］.中華臨床感染病雜志，2009，2（5）：293—296.

［8］ 趙典惠，孫際芳，王海芳，等.創傷弧菌的藥物敏感性［J］.中國人獸共患病學報，2007，27（12）：1207—1211.

［9］ 虞艷，潘軍航，石亞素，等.多株創傷弧菌的基因分型和藥敏試驗［J］.疾病監測，2013，28（2）：136—139.

［10］盧中秋，洪廣亮.創傷弧菌膿毒癥診治進展［J］.臨床外科雜志，2011，19（3）：159—163.

［11］繆心軍，蔡平平，陳玉熹，等.原發性創傷弧菌膿毒血癥救治成功三例［J］.天津醫藥，2006，34（2）：136—137.

［12］Neupane GP，Kim DM.In vitro time-kill activities of cipro-floxacin alone and in combination with the ironchelator defera-sirox against Vibrio vulnificus［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2010，29（4）：407—410.

［13］Arezes J，Jung G，Gabayan V，et al.Hepcidin-induced hypoferre-mia is a critical host defense mechanism against the siderophilic bacteriumVibrio vulnificus［J］.Cell Host Microbe，2015，17 （1）：47—57.

（本文編輯：李春輝）

Laboratory analysis on 4cases of sporadic Vibrio vulnificus infection in Shantou City

CHEN Le-chuan1，ZHU Hong—jun1，ZHOU Ze-yan2，KE Yong—jian1，CHEN Chuan-wen1（1 Shantou Central Hospital，Shantou515031，China；2 Shantou Chaonan Minsheng Hospital，Shantou515144，China）

Objective To analyze characteristics of pathogenic microbiology and antimicrobial susceptibility of Vib-rio vulnificus（V.vulnificus）causing infection in patients at a hospital in Shantou City.Methods Four patients with V.vulnificus infection admitted to a hospital between June 2013 and June 2014 were analyzed retrospectively，blood specimens of patients were collected for culture，blister fluid and wound secretion were taken and inoculated on blood agar plates，MacConkey agar plates，and thiosulfate citrate bile salts sucrose（TCBS）plates，isolated strains were identified and performed antimicrobial susceptibility testing.Results Among 4 patients with V. vulnificus infection，3 died，1 was cured；patients developed primary septicemia and lower extremity infection be-cause of eating pickled crab，steamed scallop，or contacting with seafood products after trauma.Blister fluid from patients A and B，wound secretion from patient C，and blood from patient D were all isolated oxidase-positive gram-negative bacteria which produced green colonies on TCBS plate，these strains were identified as V.vulnificus，which were resistant or intermediate to cefazolin，intermediate to cefotetan，and 1 strain was resistant to cefepime. Conclusion Four patients infected with V.vulnificus have high mortality rate（3/4），positive rates of blister fluid and wound secretion are higher than blood；timely medical consultation，early antimicrobial therapy，and active de-bridement will help to cure the disease.

Vibrio vulnificus；antimicrobial susceptibility testing；drug resistance，microbial；drug resistance；foodborne infection；wound infection

R378

A

1671—9638（2016）04—0272—05

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.04.014

2015—03—18

陳樂川（1983—），男（漢族），廣東省汕頭市人，主管技師，主要從事臨床微生物研究。

朱紅軍 Email：zhugdst@163.com