決明子中大黃酚的提取與測(cè)定方法的研究

魏 菊

(四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 四川 瀘州 646000)

決明子中大黃酚的提取與測(cè)定方法的研究

魏 菊

(四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 四川 瀘州 646000)

本次實(shí)驗(yàn)采用超聲-微波協(xié)同萃取方法對(duì)決明子中的大黃酚進(jìn)行提取，以決明子中大黃酚的提取率為大黃酚的提取工藝考察指標(biāo)，采用四因素三水平的正交設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，得出影響大黃酚提取率的順序?yàn)椤?duì)高效液相色譜法快速測(cè)定決明子中大黃酚含量的方法進(jìn)行研究。

超聲-微波協(xié)同萃取法；正交實(shí)驗(yàn)；高效液相色譜；提取率

1 緒論

1.1 超聲-微波協(xié)同萃取法

超聲-微波協(xié)同萃取法將超聲波和微波能有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，充分利用超聲波的空化作用和微波的高能作用，將超聲波振動(dòng)能和通過(guò)波導(dǎo)管引出的微波能直接作用或定向聚焦于樣品或物料，建立和發(fā)展在常溫常壓條件下進(jìn)行的聚焦微波--超聲波協(xié)同萃取新技術(shù)和新方法；劉春娟等[1]對(duì)超聲、微波及其協(xié)同萃取技術(shù)性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)研究，與傳統(tǒng)索氏抽提方法相比，此法具有快速、高效、安全、環(huán)保特點(diǎn)；與高壓密閉微波萃取法相比，該方法的樣品容量更大，且更為安全可靠。

1.2 高效液相色譜法

液相色譜法專屬性強(qiáng)，分離效果好，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，被廣泛地應(yīng)用于藥材的含量測(cè)定。中國(guó)藥典采用HPLC法測(cè)定決明子中大黃酚含量。劉松青[2]等將決明子藥材經(jīng)氯仿脫脂后再用甲醇提取，甲醇提取液經(jīng)稀釋后用HPLC法測(cè)定了樣品中決明子苷A、 B含量，并采用光譜法和色譜法對(duì)A、B峰的色譜純度進(jìn)行了鑒定。唐力英[3]等采用甲醇回流提取決明子藥材，提取液過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定了其中的紅鐮霉素龍膽二糖苷的含量。胡軼娟[4]等采用甲醇回流提取決明子藥材，建立了決明子藥材中橙黃決明素的HPLC含量測(cè)定方法，并對(duì)不同產(chǎn)地決明子進(jìn)行了含量測(cè)定。于超[5]等用HPLC法測(cè)定了決明子藥材中的大黃酚、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、蘆薈大黃素含量。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)儀器見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器

表1(續(xù))

2.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑

實(shí)驗(yàn)藥品見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)藥品

2.2.1 大黃酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用電子天平準(zhǔn)確稱取大黃酚的對(duì)照品4.95mg，倒入100mL的容量瓶中，加氯仿-甲醇(色譜純)(體積比1:1)至容量瓶體積的2/3，振蕩搖勻，有少量的大黃酚對(duì)照品不溶解，容量瓶放到超聲波清洗器中超聲溶解10min,使大黃酚完全溶解，氯仿-甲醇(色譜純)(體積比1:1)定容至刻度線，配制成49.5μg/mL的大黃酚標(biāo)準(zhǔn)溶液液備用。

2.2.2 0.1%磷酸溶液的配制

用量筒量取499.5mL的純凈水于礦泉水瓶中，用移液管移取0.5mL的磷酸加入到礦泉水瓶中，配制成500mL0.1%磷酸溶液備用。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 提取方法

超聲-微波協(xié)同提取工藝流程見圖1。

(1) 超聲-微波協(xié)同提取：用電子天平準(zhǔn)確稱取3.0000g決明子粉末于錐形瓶中，加入15mL無(wú)水乙醇溶液，超聲-微波協(xié)同萃取30min；

(2) 離心分離：將提取液用離心機(jī)進(jìn)行分離15min，得到棕黃色透明濾液；

(3) 水浴蒸發(fā)：將濾液于水浴鍋中濃縮至無(wú)乙醇，控制溫度為90℃；

(4) 溶解：水浴蒸發(fā)后加入25mL色譜純的甲醇，在水浴鍋中加熱使其完全溶解在甲醇中；

(5) 過(guò)濾：趁熱將上述溶液過(guò)濾，得到澄清棕黃色濾液；

(6) 定容：加入甲醇溶解并移入100mL容量瓶定容。

圖1 超聲-微波協(xié)同提取工藝流程

2.3.2 液相色譜測(cè)定條件

(1) 色譜柱：安捷倫C18(美國(guó)Agilent公司)；

(2) 流速：1.00mL/min；

(3) 流動(dòng)相: 甲醇：0.1%磷酸= 85:15；

(4) 時(shí)間：20.00min；

(5) 柱溫：30.0℃；

(6) 進(jìn)樣量: 20μL；

(7) 紫外檢測(cè)波長(zhǎng): 254nm。

2.4 定性分析方法

用大黃酚的對(duì)照品配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用高效液相色譜得到大黃酚對(duì)照品的色譜圖，從中得到大黃酚的保留時(shí)間為8.7min，在相同的液相條件下再測(cè)定樣品溶液的色譜圖，看色譜圖中保留時(shí)間在8.7 min的附近有無(wú)色譜峰出現(xiàn)，有峰出現(xiàn)則說(shuō)明樣品溶液中含有大黃酚，則能對(duì)大黃酚進(jìn)行定性分析。

2.5 定量分析方法

色譜定量分析的依據(jù)是在一定的操作條件下，檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)(色譜圖上的峰面積或峰高)與進(jìn)入檢測(cè)器的組分的重量或濃度成正比。目前常用的定量方法主要有內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法。外標(biāo)法又稱為已知樣校正法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法，是在與被測(cè)樣品相同的色譜條件下單獨(dú)測(cè)定，把得到的色譜峰面積與被測(cè)組分的色譜峰面積進(jìn)行比較求得被測(cè)組分的含量。其方法是先用純物質(zhì)配成一定濃度的標(biāo)樣，然后在一定的操作條件下，分別取不同量的標(biāo)樣，注入色譜儀，得到色譜圖，測(cè)出峰面積(峰高)，做出峰面積(峰高)對(duì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后再在上述條件下測(cè)定樣品，以樣品的峰面積(峰高)從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出所對(duì)應(yīng)的產(chǎn)品濃度。

采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法(外標(biāo)法)定量,按照以下公式計(jì)算大黃酚的含量。

X=(m×5000)/(M×1000)×100%

式中： X——樣品中被測(cè)組分的百分含量，%；

m——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的被測(cè)組分質(zhì)量，g；

M——樣品的質(zhì)量，g。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)查閱文獻(xiàn)和對(duì)決明子中提取大黃酚的單因素條件影響的實(shí)驗(yàn)，知道影響大黃酚提取率的主要因素有：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取功率、料液比。對(duì)四個(gè)因數(shù)分別設(shè)置了三個(gè)水平，如表4，設(shè)計(jì)表頭如表3。

表3 表頭

表4 實(shí)驗(yàn)因素水平表

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測(cè)條件的選取

本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)做的實(shí)驗(yàn)掃描的色譜圖中看出，當(dāng)用甲醇-0.1%磷酸溶液做流動(dòng)相時(shí)，大黃酚的色譜峰能達(dá)到基線穩(wěn)定，并且出峰時(shí)間短，沒有拖尾情況；故本論文將選用甲醇-0.1%磷酸溶液作為測(cè)定大黃酚的流動(dòng)相。

優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)：

選擇測(cè)定溫度為30℃；

甲醇-0.1%磷酸溶液的流速為1.0mL/min;

甲醇-0.1%磷酸溶液的比例為85:15；

進(jìn)樣量為20 μL；

檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；

從實(shí)驗(yàn)得到的色譜圖中，得出大黃酚的保留時(shí)間為8.7min，出峰時(shí)間明顯較上次測(cè)定時(shí)減少，測(cè)定優(yōu)化單因素樣品時(shí)，大黃酚峰前后依然沒有其他峰的干擾，出峰效果良好，說(shuō)明溫度在在30℃,甲醇-0.1%磷酸溶液的流速為1.0mL/min時(shí)，更有利于大黃酚的測(cè)定。

綜上所述：用高效液相色譜法測(cè)定決明子中大黃酚的含量時(shí)，最佳測(cè)定條件為：選擇測(cè)定溫度為30℃，甲醇-0.1%磷酸溶液的流速為1.0mL/min，甲醇-0.1%磷酸溶液的比例為85:15，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm的液相條件。

3.2 定性分析

分別配制一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，在相同的色譜條件下，用高效液相色譜分別得到色譜圖，得到的大黃酚標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖和大黃酚樣品色譜分別為圖2、圖3。

圖2 大黃酚標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

圖3 大黃酚樣品液相色譜圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在滿足靈敏度的條件下，實(shí)驗(yàn)選定甲醇:0.1%磷酸溶液(85：15)作為本方法的流動(dòng)相能使決明子樣品取得較好的分離，并得到與大黃酚對(duì)照品的出峰時(shí)間相同(保留時(shí)間在8.7min附近)。

3.3 大黃酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

移取大黃酚(49.5μg·L-1)標(biāo)液 0.4,0.8,1.6,3,4,6mL于10mL的容量瓶中，然后用甲醇(色譜純)定容至刻度線，配制成濃度分別為1.98,3.96,7.92,14.85,19.80,29.70μg/mL的大黃酚標(biāo)液。分別吸取上述的10mL容量瓶中的標(biāo)液各20μL進(jìn)樣，高效液相色譜測(cè)得以上各組的色譜峰，繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖4。

圖4 大黃酚的工作曲線

方法線性范圍0～0.297ug(r=0.9995)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程：

Y=59.586X+3.225

(1)

其中： X——大黃酚的濃度，單位:μg/mL；

Y——峰面積，單位： mAU*S。

3.4 各工藝因素對(duì)大黃酚提取率的影響

3.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

在料液比1:5，提取時(shí)間30min，提取功率80w時(shí)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大黃酚提取的影響，結(jié)果如圖3.4所示。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大黃酚提取的影響

由圖5可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%之前，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，決明子中大黃酚的提取質(zhì)量呈上升趨勢(shì)；乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%之后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，決明子中大黃酚的提取質(zhì)量呈下降趨勢(shì)。所以乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%左右的情況下提取決明子中的大黃酚比較有利。

3.4.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

在料液比1:5，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取功率80W 時(shí)，考察提取時(shí)間對(duì)大黃酚提取的影響，結(jié)果如圖3.5所示。

圖6 提取時(shí)間對(duì)大黃酚提取的影響

由圖6可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，大黃酚的峰面積呈上升趨勢(shì)，從而得出大黃酚的提取質(zhì)量呈上升趨勢(shì)。由于有效成分濃度差是超聲提取的主要推動(dòng)力，在提取初期，有效成分濃度差大，因此提取速率快，提取率增加明顯，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，溶劑中有效成分濃度逐漸增大，和固相中的濃度差逐漸變小，也就是推動(dòng)力變小，所以提取速率減慢，提取率增加不明顯，直至推動(dòng)力為零，有效成分不再溶解。故在40min以內(nèi)提取大黃酚的效果較好。

3.4.3 提取功率對(duì)提取率的影響

在料液比1:5，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時(shí)間40min時(shí)，考察提取功率對(duì)大黃酚提取的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 提取功率對(duì)大黃酚提取的影響

由圖7可以看出，隨著實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)提取功率的增大，大黃酚的峰面積呈上升趨勢(shì)，從而得出大黃酚的提取質(zhì)量也呈上升趨勢(shì)。由圖可以看出，功率對(duì)大黃酚的提取影響不是特別大，尤其是當(dāng)功率在70W左右時(shí)大黃酚的提取質(zhì)量變化很小。故提取功率設(shè)置在70W左右，提取大黃酚的效果較好。

3.4.4 料液比對(duì)提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時(shí)間30min，提取功率70W時(shí)，考察料液比對(duì)大黃酚提取的影響，結(jié)果如圖8所示。

圖8 料液比與提取率的關(guān)系圖

由圖8可以看出，隨著實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)溶劑用量的增加，決明子中大黃酚的測(cè)定峰面積呈上升趨勢(shì)，從而得出大黃酚的提取質(zhì)量也呈上升趨勢(shì)。這是由于溶劑量大，溶劑中的有效成分濃度低，與物料及溶劑邊界層的有效成分濃度差大，擴(kuò)散推動(dòng)力較大，所以提取率高；相反，溶劑中有效成分濃度高，擴(kuò)散推動(dòng)力小，不利于擴(kuò)散，有效成分提取率低。所以本次實(shí)驗(yàn)中選擇的合適料液比為1:5。

3.5 正交實(shí)驗(yàn)提取條件選取

通過(guò)因數(shù)水平表查閱正交表，選用L9(34),根據(jù)正交表，方案如表5。用電子天平準(zhǔn)確稱取決明子粉末3.0000g，按正交表方案提取，得到的色譜圖見附錄附圖3。

表5 大黃酚正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及其結(jié)果

表5(續(xù))

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)表中的得到的R值，可以得出對(duì)提取影響大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>提取功率> 料液比。通過(guò)表5的k值可以看出，決明子中提取大黃酚的最佳條件是A2B3C1D3。即為60%的乙醇，提取時(shí)間40min，提取功率60w，料液比為1:5，在最佳條件下，大黃酚的提取率為0.1221%。

3.6 實(shí)驗(yàn)總結(jié)

本次做單因素實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，大黃酚的總體含量較低，造成此結(jié)果的原因主要有液相色譜的使用非常緊張，以至于每次提取完后不能及時(shí)的進(jìn)行測(cè)定，二十組三單因素全做完后，由于容量瓶的緊缺，并沒有及時(shí)的將其定容等待測(cè)定，所以測(cè)定時(shí)，杯壁殘留了許多物質(zhì)。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于一次性的烘烤決明子較多，到后來(lái)可能因?yàn)闀r(shí)間過(guò)久導(dǎo)致游離態(tài)的蒽醌類化合物減少，使后來(lái)的實(shí)驗(yàn)與前面的實(shí)驗(yàn)有一定的誤差。

實(shí)驗(yàn)中使用的溶劑均具有揮發(fā)性，而決明子需要浸泡幾個(gè)小時(shí)之后才能開始萃取，這就可能導(dǎo)致在每次實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)致溶劑減少；在進(jìn)行藥品轉(zhuǎn)移時(shí)也不可能使藥品的轉(zhuǎn)移率達(dá)到百分之百；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在進(jìn)行產(chǎn)品回收時(shí)也不能使產(chǎn)品的回收率達(dá)到百分之百，這都會(huì)使樣品減少。在所得的樣品進(jìn)行揮發(fā)過(guò)濾的過(guò)程中，有些使大黃酚成漿糊狀而無(wú)法溶解在色譜純的甲醇，這一點(diǎn)，可能是造成大黃酚的量與文獻(xiàn)中的出入很大。

4 結(jié)論

本文采用了正交試驗(yàn)用乙醇作溶劑對(duì)決明子中大黃酚的有效提取，并用HPLC對(duì)其進(jìn)行了定性定量的分析。實(shí)現(xiàn)了中藥決明子有效成分的快速分析和提取方法的選擇。通過(guò)色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)大黃酚定性分析，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)找到了最優(yōu)的提取方法。然后通過(guò)液相色譜進(jìn)行定量分析，測(cè)出了大黃酚的含量。結(jié)果顯示，使用乙醇作溶劑等提取條件來(lái)提取決明子中大黃酚，本實(shí)驗(yàn)采取超聲微波協(xié)同萃取方法提取時(shí)間快，提取效果好的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果令人比較滿意。

[1] 劉春娟. 超聲、微波及其協(xié)同萃取技術(shù)性能評(píng)價(jià)研究[J]. 食品工藝科技，2002,12(2):11-16.

[2] 劉松青，高振同，楊大堅(jiān)，等．HPLC測(cè)定決明子中決明子苷A、B含量[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，1999，34(4)：267-269.

[3] 唐力英，王祝舉，鄔秋萍，等．HPLC測(cè)定決明子中紅鐮霉素龍膽二糖苷的含量[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33(4)：366-367.

[4] 胡軼娟，萬(wàn) 麗，張加雄．高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地決明子中橙黃決明素含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17(7)：1138-1139．

[5] 于 超，蘭紅梅，王 宇．HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地決明子中五種蒽醌類化合物[J.基層中藥雜志．2002，16(2)：8-10.

(本文文獻(xiàn)格式：魏 菊.決明子中大黃酚的提取與測(cè)定方法的研究[J].山東化工，2016，45(12)：74-80.)

The Research Method of Determination of Chrysophanol in Semen Cassiae by HPLC

Wei Ju

(Sichuan Chemical Vocation Technology College, Luzhou 646005,China)

This experiment using ultrasonic microwave synergistic extraction method in Semen Cassiae chrysophanol was extracted, to the extraction of Chrysophanol in Semen Cassiae rate for extraction technology of chrysophanol indexes and the extraction process was optimized by the orthogonal design of four factors and three levels. Through orthogonal experiment, the order of affecting the extraction rate of. The research method of rapid determination of Chrysophanol in Semen Cassiae by HPLC.

ultrasonic microwave synergistic extraction; orthogonal test; high performance liquid chromatography; extraction rate

2016-04-26

魏 菊(1988—)，女，四川達(dá)州人，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事化工工藝和有機(jī)合成的研究。

TQ914.1

A

1008-021X(2016)12-0074-07