督脈電針對不同時間段脊髓損傷大鼠運動功能及p75神經營養素受體表達的影響①

呂威，莫雨平，李冰，姚海江，景泉凱，宋良玉，王鑫，毛穎秋，李志剛，時素華

·專題·

督脈電針對不同時間段脊髓損傷大鼠運動功能及p75神經營養素受體表達的影響①

呂威1a，莫雨平2，李冰1b，姚海江3，4，景泉凱1a，宋良玉1a，王鑫1a，毛穎秋1c，李志剛1a，時素華5

目的觀察督脈電針對脊髓損傷大鼠不同時間段運動功能及p75神經營養素受體（p75NTR）表達的影響。方法雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠180只，隨機分為術后1 d、3 d、7 d組，每個時間段組再隨機分為空白組、空白電針組、假手術組、模型組和督脈電針組，每組12只。采用改良Allen打擊法復制脊髓損傷模型?？瞻纂娽樈M、督脈電針組選取大椎、命門進行電針干預。采用BBB評分法評估大鼠后肢運動神經功能的變化；采用Western blotting法檢測p75NTR的表達情況。結果BBB評分結果顯示，模型組、督脈電針組評分均低于其他三組；術后7 d，督脈電針組評分顯著高于模型組（t=-4.510，P＜0.001）。督脈電針組各時間點p75NTR表達明顯低于模型組（P＜0.01）。結論脊髓損傷后受損脊髓組織中p75NTR蛋白表達升高；督脈電針可以提高脊髓損傷大鼠的運動功能，下調受損脊髓組織中p75NTR的表達。

脊髓損傷；督脈；電針；p75神經營養素受體；凋亡；大鼠

［本文著錄格式］呂威，莫雨平，李冰，等.督脈電針對不同時間段脊髓損傷大鼠運動功能及p75神經營養素受體表達的影響［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（8）：876-883.

CITED AS：Lü W，Mo YP，Li B，et al.Effects of Governor Vessel electroacupuncture in different time points on motor functions and p75 neurotrophin receptor after spinal cord injury［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（8）：876-883.

脊髓損傷（spinal cord injury）是由于多種因素導致脊髓的結構改變，出現脊髓休克、運動功能喪失、感覺障礙等一系列功能障礙，嚴重影響患者身心健康的一種中樞神經系統疾病。臨床研究發現，電針療法能明顯減輕和延緩脊髓損傷后的早期病理損害［1-3］；改善局部脊髓組織的微循環，減輕組織間、神經纖維間的水腫；防止繼發性損傷；促進脊髓損傷的恢復，對于脊髓損傷的療效確切［4-11］。p75神經營養素受體（p75 neurotrophin receptor，p75NTR）是神經生長因子受體/腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族中的一員，是介導細胞凋亡過程中重要的遞質［12］，p75NTR與其配體結合后，激活Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinases，JNK）信號級聯反應，具有誘導神經細胞凋亡的作用，這個過程在很大程度上阻礙了脊髓損傷的恢復。相關實驗研究發現，針灸對于機體能發揮多系統、多層次、多水平、多途徑、多靶點的調節作用，電針可以通過抑制脊髓損傷處神經細胞凋亡［13-17］，激活受損神經細胞，使上、下運動神經的功能恢復，使殘存生理功能的脊髓神經發揮修復潛力，促使機體重建部分功能，為脊髓損傷功能的修復奠定一定基礎。

本研究觀察督脈電針對于脊髓損傷后不同時間窗修復過程中行為學、病理形態學以及p75NTR蛋白表達的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物

清潔級Sprague-Dawley大鼠180只，雄性，體質量（220±20）g，由斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司提供，合格證號SCXK（京）2011-0004。中國中醫科學院中藥研究所清潔級動物房飼養，溫度為（25±3）℃，濕度（45±10）%，自由飲水進食，12 h晝夜規律調整。適應性飼養3 d后進入實驗。

1.2主要試劑和儀器

水合氯醛（分析純）、蘇木素：國藥集團化學試劑有限公司。碘伏消毒劑：北京聯昌衛生消毒用品有限公司。75%消毒酒精：邯鄲市捷利康商貿有限公司。Biotech多聚甲醛：GENE-BIO。二甲苯（分析純）、無水乙醇（分析純）：北京化學試劑公司。Solarbio尼氏染色試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。p75NTR抗體、P-C-Jun抗體：美國ABCAM公司。蛋白質分子量Marker：美國THERMO。Haopoly-HRP鼠兔通用二抗試劑盒：上海杰浩生物技術有限公司。感光膠片：美國柯達。

Allen打擊裝置：北京協和醫學院微循環研究所。CP-8000科德士寵物用電推剪：深圳市科德士電器有限公司。中研太和一次性使用無菌針灸針（直徑0.30 mm，長25 mm）：無錫佳健醫療器械有限公司。HANS-LH202型韓氏穴位神經刺激儀：北京華衛產業開發公司。RM2235組織切片機：德國LEICA公司。BX53自動化智能型正置研究級顯微鏡：日本OLYMPUS公司。微量加樣器：德國EPPENDORF。電子天平：德國SARTOURIS。4℃低溫高速離心機：美國THERMO。半干轉電轉印儀、穩壓穩流電泳儀、垂直電泳槽：美國BIO-RAD。紫外分光光度計：德國BIOPHOTOMETER。

1.3方法

1.3.1動物分組

將大鼠編號，按隨機數字表法分為術后1 d組、術后3 d組和術后7 d組。每個時間段組再隨機分為5個亞組：空白組、空白電針組、假手術組、模型組、督脈電針組，每個亞組12只。

1.3.2模型制備

大鼠術前禁食禁水8 h，紫外燈消毒動物手術室30 min，手術器械消毒30 min，手術室溫度不低于20℃。10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，固定于自制的弓形手術臺上，備皮脫毛，碘伏消毒后，先定位T8，然后向下依次定位T9-11。取后正中切口，用手術刀片分離背部肌肉，暴露棘突及胸椎旁的肌肉，謹慎剝離椎旁的肌肉，暴露T9-11段的棘突及椎板，以微型咬骨鉗咬除，將脊髓暴露，硬脊膜不能損傷，如大出血可用利多卡因止血，生理鹽水沖洗保持視野干凈清晰。采用改良式Allen打擊裝置，致傷量為5 g×8 cm，造成T9-11節段脊髓損傷?？焖倏p合傷口，碘伏消毒。等待大鼠蘇醒。術后單籠飼養，保持墊料干燥，定時膀胱擠壓幫助排尿。假手術組除不進行脊髓打擊，其他操作同模型組。模型成功評價標準：①身體痙攣性顫動；②尾巴痙攣性擺動；③硬脊膜內充血或血腫，麻醉醒后雙下肢表現為不完全癱瘓。

1.3.3干預方法

參照全國針灸學會實驗針灸研究會制定的《實驗動物針灸穴位圖譜》選取大椎（第7頸椎棘突下，向下斜刺）、命門（第2腰椎棘突下，向上斜刺）兩個督脈上的穴位，在固定時間給予治療，每次20 min，每天1次，具體操作方法如下。

空白組：不用造模，相同飼養條件下不做任何干預，但在督脈電針組治療時抓取進行束縛，每次20 min。

空白電針組：不用造模。選取大椎、命門，進針約0.5～0.7 cm。使用HANS-LH202型韓氏穴位神經刺激儀，上接陰極，下接陽極，持續脈沖電流，頻率2 Hz，強度1 mA，治療時間20 min，輸出強度在剛開始時以背部肌肉出現輕微抽動為度，待其適應后則以雙下肢癱瘓肌肉出現有節律的收縮為度。術后1 d組于造模清醒后2 h治療1次，其余時間段每天固定時間治療1次。

假手術組：去除T9-11段的棘突及椎板，不進行脊髓打擊，術后不做任何處理，但在督脈電針組治療時抓取進行束縛，每次20 min。

模型組：造模，術后不做任何處理，但在督脈電針組治療時抓取進行束縛，每次20 min。

督脈電針組：造模，其他同空白電針組。

1.4評價方法

1.4.1BBB（Basso，Beattie，Bresnahan）評分

采用BBB評分對各組大鼠進行行為學評分。將大鼠后肢運動分為22個等級，后肢全癱為0分，完全正常為21分，綜合評定大鼠的運動功能。

1.4.2HE染色、尼氏染色

不同時間段組經處理后取每亞組大鼠6只，10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，待大鼠深度麻醉后固定于弓形板上行心臟灌注固定。打開胸腔，充分暴露心臟，用灌注針從左心室心尖部插入直至主動脈，剪開右心耳，灌注生理鹽水約250 ml，待肝臟顏色呈灰白色且從心臟流出的液體由紅色變成透明清亮的液體時，灌注4%多聚甲醛溶液約300 ml，時間30 min，待大鼠出現四肢抽搐及全身僵硬、肝臟變硬可停止灌注。卸下弓形板，以打擊點為中心，剝離肌肉、脊椎，取出損傷脊髓節段（T9-11），約長1 cm，浸入4%多聚甲醛溶液中固定，將固定好的組織常規脫水，石蠟包埋，切片，厚4～5 μm，行HE染色和尼氏染色。

1.4.3Western blotting

取剩余每亞組大鼠6只，以10%水合氯醛3.5 ml/ kg腹腔注射麻醉后，剪下大鼠損傷脊髓節段，剔除肌肉與骨頭，于無菌工作臺冰盤上分離出脊髓組織進行研磨、提取組織蛋白，采用Bradford法測定蛋白含量，經電泳、電轉、封閉，加入p75NTR一抗（1∶1000），封口，4℃孵育過夜，漂洗，加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，漂洗，將PVDF膜放置ECL混合液中震蕩溫育5 min，于暗室壓上X光片，感光數分鐘，顯影、掃描后，利用IPP軟件對掃描圖像的目的條帶進行灰度分析。

1.5統計學分析

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，實驗結果用（±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較時，數據呈正態分布并且方差齊時運用單因素方差分析，兩組間比較用LSD檢驗。顯著性水平α=0.05。

2　結果

2.1BBB評分

空白組與空白電針組術后各時間BBB評分均為21分。與空白組比較，假手術組經處理后BBB評分有所減少，術后7 d基本恢復到正常運動功能，評分為21分。

模型組與督脈電針組經造模后BBB分值明顯減少。術后1 d兩組BBB評分無顯著性差異（P＞0.05），術后3 d督脈電針組BBB評分有上升趨勢，但與模型組比較仍無顯著性差異（P＞0.05），術后7 d督脈電針組BBB評分顯著高于模型組（P＜0.001）。見表1。

2.2 HE染色

光鏡下可見空白組、空白電針組和假手術組脊髓組織結構致密，灰質與白質之間界限清晰，灰質呈蝴蝶狀，白質排列整齊，運動神經元形態規則，細胞核大且圓，核仁清晰。

術后1 d，模型組與督脈電針組均出現明顯的損傷改變。模型組脊髓組織結構被破壞，灰質與白質分界不清，灰質內斑片狀出血，大量紅細胞聚集，灰質區域的運動神經元腫脹，細胞間質水腫，細胞核固縮，白質神經纖維腫脹增粗，排列紊亂；督脈電針組較模型組病理形態改變不明顯，仍有出血、水腫。

術后3 d，模型組白質區域神經纖維繼續腫脹增粗，組織結構排列紊亂稀疏，甚至有空洞形成，并且有小膠質細胞浸潤，灰質部分大范圍的運動神經元腫脹，甚至出現溶解，壞死，有白細胞浸潤，中央管結構紊亂；督脈電針組較模型組出血現象相對減少，病理形態開始改善。

術后7 d，模型組出血減少，白質與灰質的邊界仍然模糊不清，灰質部位神經元數量極少，大量小膠質細胞增生，白質神經纖維結構腫脹明顯；督脈電針組較模型組出血少、小膠質細胞增生的數量少，神經元開始出現清晰的邊緣。見圖1。

2.3尼氏染色

光鏡下可見空白組、空白電針組和假手術組脊髓組織灰質區域中的運動神經元胞漿中有呈藍紫色的斑塊狀或條索狀顆粒的尼氏體。術后1 d，模型組神經元數量減少，殘存的神經元出現不同程度的腫脹，尼氏體染色細胞減少，甚至消失，染色變淡，在中央細胞核部位最為明顯；督脈電針組較模型組病理形態改善不明顯，神經元有減少、腫脹，尼氏染色較淡。術后3 d，光鏡下可見模型組灰質區域中的神經元出現明顯的萎縮，部分溶解，尼氏體數量顯著減少，甚至消失；督脈電針組神經元萎縮、減少現象仍存在，但較模型組神經元減少數量少，且尼氏體隱約可見。術后7 d，光鏡下可見模型組有少量神經元尼氏體重現；督脈電針組的尼氏體重現，較模型組明顯。見圖2。

2.4p75NTR的表達

術后各時間點，與空白組、空白電針組和假手術組比較，模型組大鼠脊髓組織中p75NTR表達顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，督脈電針組p75NTR表達明顯降低（P＜0.01）。

術后1 d，與空白組、空白電針組和假手術組比較，督脈電針組p75NTR表達升高，但無顯著性差異（P＞0.05）。術后3 d，與空白組、空白電針組和假手術組比較，督脈電針組p75NTR表達顯著升高（P＜0.001）。術后7 d；與空白組、空白電針組比較，督脈電針組大鼠脊髓組織中p75NTR表達明顯升高（P＜0.01）；與假手術組比較，p75NTR表達有升高趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05）。見表2、圖3。

表1　各組大鼠術后不同時間段BBB評分

表2　各組大鼠術后不同時間段p75NTR的表達

圖1　各組大鼠不同時間點受損脊髓（HE染色，bar=50 μm）

圖3　各組大鼠受損脊髓組織p75NTR蛋白的表達情況

3　討論

《靈樞·寒熱病》記載，“身有所傷血出多，及中風寒，若有所墮墜，四支懈惰不收，名曰體惰”。其所描述的病因和癥狀與脊髓損傷相同。所以，脊髓損傷應歸屬中醫的“體惰”范疇。其病機可歸納為督脈受損、腎陽不足、氣血不暢、筋脈失養。故治療當疏通督脈、溫腎壯陽、活血化瘀。在此原則指導下，即以督脈上的大椎、命門二穴作為針刺部位。

脊髓損傷后，損傷區域由于血管受損、閉塞甚至痙攣，使得脊髓自身的調節機制被創傷性的低血壓所破壞，失去低碳酸反應，不能將自身的血流量維持在正常的水平［18］，因而會造成微循環障礙甚至血栓形成；而這些病理改變會進一步使微循環障礙及組織缺血程度加重［18］；同時炎性細胞及神經膠質細胞的浸潤導致局部的組織水腫，血管阻力進一步增加，造成灌注紊亂；而受損脊髓的局部組織缺血以及延遲性低灌流會造成受損脊髓的神經細胞發生壞死，神經功能逐漸喪失，所支配的運動功能發生障礙。

本實驗通過光鏡觀察脊髓損傷大鼠受損脊髓組織，發現切片中呈現出明顯的出血、水腫以及神經元的變性壞死等現象，其損傷的主要病理變化以神經元的潰變為主，結果與國內外學者的研究［19-21］相一致。督脈電針治療后7 d，能夠明顯阻止脊髓損傷大鼠受損脊髓發生繼發性損傷，并促進損傷神經元的修復。這些結果可能與其能夠擴張血管，使血液流變性，使微循環得到改善，使血小板的聚集現象受到抑制，使血栓得到溶解以及使受損的神經組織細胞缺氧狀況得到改善等分不開。

神經元損傷后，除一些酶活性的變化可以反映脊髓損傷后神經元的損傷情況之外，神經元的尼氏體數量和含尼氏體神經元的多少也可以用來作為判斷神經損傷程度的指標［22-23］。尼氏體正常情況下數量較多、顆粒較大，分布于神經元的核周部。在本實驗中模型組含有尼氏體的神經元顯著少于空白組、空白電針組和假手術組，而且形態不規則，甚至有較多的失去完整形態，位于神經元胞漿內的尼氏體染色較淺。經過1 d、3 d和7 d的電針治療后，微環境的情況得到一定程度改善，部分神經元被激發出較強的修復再生能力，加速神經元修復，細胞核及尼氏體等細胞器重新出現，進而使神經元內的蛋白質合成功能逐漸恢復，具有一定的保護神經元、促進神經元再生修復及穩定神經元結構的作用。

細胞凋亡是一種自然的生理過程，在神經系統的發育過程中對神經元的生長、發育、分化及維持細胞的數目與質量、穩定突觸的聯系及神經內環境有著重要的作用［12］。脊髓損傷導致的神經功能永久或長期喪失與脊髓組織的水腫、變性、壞死，以及神經元與少突膠質細胞的凋亡有關［12，24］。

Rabizadeh等首次證實p75NTR介導細胞凋亡［25］。在中樞神經系統損傷中，p75NTR在非損傷脊髓中沒有發現表達，在損傷的脊髓中發現表達［12］。本實驗各時間窗結果顯示，模型組大鼠受損脊髓組織p75NTR表達較空白組、空白電針組及假手術組增多；而督脈電針組較模型組p75NTR表達相對減少。從實驗結果還可以看出，模型組大鼠p75NTR在3 d時表達達到最高峰，7 d時已回落，督脈電針組在7 d也下調p75NTR水平至相對正常水平，與假手術組比較無顯著性差異。隨著損傷時間的延長，模型組p75NTR水平也相應回落，但仍較未受損大鼠p75NTR表達高。說明督脈電針可以下調受損脊髓組織中p75NTR的表達水平。結合行為學、病理形態學結果，我們推測脊髓損傷后大鼠受損局部p75NTR蛋白高水平表達，而通過督脈電針的干預治療可以下調受損脊髓局部p75NTR蛋白的表達，從而為神經元的修復提供合適的環境。

綜上所述，本實驗的造模會造成大鼠受損局部脊髓一定程度的損害，假手術組也會因為手術操作而造成大鼠運動功能短期內的下降。督脈電針干預可以減輕脊髓損傷程度。脊髓損傷后受損局部p75NTR蛋白呈升高趨勢；督脈電針干預可顯著下調各時間點p75NTR蛋白的表達。抑制p75NTR蛋白的表達可能是督脈電針發揮保護受損脊髓神經作用的機制之一。

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Effects of Governor Vessel Electroacupuncture in Different Time Points on Motor Functions and p75 Neurotrophin Receptor after Spinal Cord Injury

Lü Wei1a，MO Yu-ping2，LI Bing1b，YAO Hai-jiang3，4，JING Quan-kai1a，SONG Liang-yu1a，WANG Xin1a，MAO Ying-qiu1c，LI Zhi-gang1a，SHI Su-hua5
1.a.Department of Acupuncture and Massage，b.Department of Basic Medicine，c.Scientific Research and Test Center，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2.The Rehabilitation Department of the Third People's Hospital of Shenzhen City，Shenzhen，Guangdong 518112，China；3.Treatment Center of Traditional Chinese Medicine，Beijing Bo'ai Hospital，China Rehabilitation Research Center，Beijing 100068，China；4.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine，Beijing 100068，China；5.Department of Rehabilitation，The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

Correspondence to LI Zhi-gang，SHI Su-hua.E-mail：lizhigang620@126.com（LI Zhi-gang）；molly-flower@163. com（SHI Su-hua）

Objective To explore the effect of Governor Vessel electroacupuncture in different time points on motor function and p75 neurotrophin receptor（p75NTR）after spinal cord injury.Methods A total of 180 adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups（one day，three days and seven days after modeling），and each group was divided into normal control group，normal electroacupuncture group，sham operation group，model group and Governor Vessel electroacupuncture group with 12 cases in each group.The spinal cord injury model was established with the modified Allen's method.The normal electroacupuncture group and the Governor Vessel electroacupuncture group received electroacupuncture on Dazhui（DU14）and Mingmeng（DU04）acupoints.Basso-Beattic-Bresnahan（BBB）Scale was performed to assess the motor function of rats.The expression of p75NTRwas detected with Western blotting.Results The BBB score of the model group and the Governor Vessel electroacupuncture group were significantly lower than that of the other three groups.TheBBB score was significantly higher in the Governor Vessel electroacupuncture group than in the model group seven days after intervention （t=-4.510，P＜0.001）.The expression of p75NTRwas siginificantly lower in the Governor Vessel electroacupuncture group than in the model group（P＜0.01）.Conclusion The expression of p75NTRincreased after spinal cord injury.Governor Vessel electroacupuncture could improve the motor function，and inhibit the p75NTRexpression of damaged spinal cord tissues.

spinal cord injury；Governor Vessel；electroacupuncture；p75 neurotrophin receptor；apoptosis；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.08.002

國家自然科學基金項目（No.81373728）。

1.北京中醫藥大學，a.針灸推拿學院，b.基礎醫學院，c.科研實驗中心，北京市100029；2.深圳市第三人民醫院康復科，廣東深圳市518112；3.中國康復研究中心北京博愛醫院中醫治療中心，北京市100068；4.首都醫科大學康復醫學院，北京市100068；5.北京中醫藥大學第三附屬醫院康復科，北京市100029。作者簡介：呂威（1988-），男，回族，河南駐馬店市人，碩士研究生，主要研究方向：針刺干預中樞神經系統損傷的機理研究。通訊作者：時素華（1981-），女，主治醫師，國家自然科學基金主持人，主要研究方向：針刺干預中樞神經系統損傷的機理研究。李志剛（1965-），男，教授，主任醫師，博士研究生導師，博士后合作導師，主要研究方向：針刺手法及針刺干預中樞神經系統損傷的機理研究。E-mail：molly-flower@163.com（時素華）；lizhigang620@126.com（李志剛）。

R651.2

A

1006-9771（2016）08-0876-08

（2016-04-11

2016-06-14）