周圍神經(jīng)電刺激對脊髓損傷大鼠軸突再生的影響①

王永杰，洪毅，陳學明，張亞奎

·專題·

周圍神經(jīng)電刺激對脊髓損傷大鼠軸突再生的影響①

王永杰1，洪毅2，陳學明1，張亞奎1

目的探討周圍神經(jīng)電刺激對大鼠脊髓損傷后損傷節(jié)段軸突再生的影響。方法92只健康成年Sprague-Dawley大鼠隨機分為空白對照組（n=12）、對照組（n=40）和實驗組（n=40）。采用NYU打擊器制作T8脊髓損傷模型?？瞻讓φ战M不植入電刺激器。對照組只植入刺激器而不干預。實驗組植入電刺激器，并施加電刺激干預。三組分別于脊髓損傷后1 d，1、2、4、8周行BBB評分；1、2、4、8周行運動誘發(fā)電位檢測（MEP）評價大鼠后肢神經(jīng)功能變化。三組分別于術后1、2、4、8周取材，采用HE染色觀察損傷節(jié)段脊髓的大體病理變化；采用免疫組化法測定損傷節(jié)段脊髓組織內(nèi)神經(jīng)絲蛋白200（NF-200）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）水平。結果術后1 d，1、2、4周，三組BBB評分無顯著性差異（P＞0.05）；8周時實驗組評分高于空白對照組和對照組（P＜0.05）。術后1周，三組MEP潛伏期和波幅無顯著性差異（P＞0.05），術后2、4、8周，實驗組較空白對照組和對照組MEP潛伏期縮短，波幅增加（P＜0.05）。術后1、2、4、8周，三組脊髓損傷節(jié)段HE染色病理表現(xiàn)相似。術后1周，三組間NF-200軸突計數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）；術后2、4、8周，實驗組NF-200軸突計數(shù)多于空白對照組和對照組（P＜0.05）。術后1、2、4、8周，三組間GFAP表達無顯著性差異（P＞0.05）。結論植入式周圍神經(jīng)電刺激能夠促進脊髓損傷大鼠傳導功能及運動功能的恢復，對損傷節(jié)段軸突的再生可能有促進作用。

脊髓損傷；電刺激；軸突再生；大鼠

［本文著錄格式］王永杰，洪毅，陳學明，等.周圍神經(jīng)電刺激對脊髓損傷大鼠軸突再生的影響［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（8）：884-891.

CITED AS：Wang YJ，Hong Y，Chen XM，et al.Effect of peripheral nerve electrical stimulation on axon regeneration after spinal cord injury in rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（8）：884-891.

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

健康成年清潔級雌性Sprague-Dawley大鼠92只，體質量（260±20）g，由中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。大鼠編號1～92，通過隨機數(shù)字表抽取92個數(shù)，按大小排序，依次分為空白對照組（n=12）、對照組（n=40）和實驗組（n=40），均采用NYU打擊法制作T8脊髓損傷模型?？瞻讓φ战M不植入電刺激器。對照組只植入刺激器而不給予干預。實驗組植入電刺激器，并施加電刺激干預。三組按照觀察時間的不同又隨機分為脊髓損傷后1周、2周、4周、8周四個亞組。空白對照組每個亞組各3只，對照組、實驗組每個亞組各10只。實驗過程中死亡或不列入統(tǒng)計學分析的大鼠，按相等的數(shù)量和相同的實驗方法予以補充。

1.2主要實驗試劑

兔抗大鼠膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體（SIGMA-Boster分裝）；鼠抗神經(jīng)絲蛋白（neurofilament，NF）-200單克隆抗體（SIGMA-Boster分裝）；山羊抗小鼠IgG（SIGMA-Boster分裝）；山羊抗兔IgG（SIGMA-Boster分裝）；DAB顯色試劑盒（SIGMA-Boster分裝）。10%水合氯醛、青霉素（16萬U/支）、4%多聚甲醛、PBS緩沖液（pH 7.2～7.4）。

1.3模型制備

大鼠術前禁食12 h，稱重，10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。以T8節(jié)段脊髓為中心行背部正中縱行切口，顯露出T7～T9椎板，小心咬除T8椎板，暴露T8節(jié)段的脊髓，顯露直徑約3.0 mm圓形區(qū)作為脊髓損傷打擊區(qū)，將大鼠移入NUY脊髓損傷打擊器載物臺［6］。選用10 g×2.5 cm致傷力打擊大鼠脊髓，打擊后迅速抬起打擊桿，見大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙下肢及軀體回縮撲動后，雙下肢癱瘓，表明撞擊成功。生理鹽水沖洗傷口，徹底止血后予以逐層縫合肌肉、淺筋膜、皮膚。雙側臀部剃毛備皮，常規(guī)消毒鋪巾，逐層切開皮膚、皮下筋膜，肌肉，暴露、分離雙側坐骨神經(jīng)，將刺激電極置于雙側坐骨神經(jīng)干，并用手術縫線將其固定。電極線通過皮下隧道經(jīng)大鼠背部T12～L1水平穿出，并予以手術縫線固定，生理鹽水沖洗傷口后予以逐層縫合肌肉、淺筋膜、皮膚。

1.4術后一般護理

術后大鼠分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度控制在25℃，定期通風；每天更換墊料，保持干燥，因尿失禁而被浸濕的肢體及時用溫水清洗擦干。術后常規(guī)每天2次慶大霉素2～4萬U/kg肌肉注射，持續(xù)3 d。每天2～3次擠壓膀胱協(xié)助排尿，直至恢復排尿反射。每天兩次輕揉大鼠腹部及雙后肢，預防腸梗阻和壓瘡的發(fā)生。

1.5術后神經(jīng)電刺激干預

術后次日對實驗組大鼠進行電刺激干預。每次刺激時將外接電刺激器與固定在大鼠背部的刺激電極相連接，打開電源開關進行電刺激。采用雙通道電池供能的電刺激器，單相波，電壓3 V，波長200 μs，頻率20 Hz；每次1 h，每天3次。此刺激強度剛好能產(chǎn)生雙下肢屈曲，刺激在每天8：00～17：00，大鼠清醒狀態(tài)下進行。

1.6檢查方法

實驗后1 d、1周、2周、4周、8周行BBB（Basso，Beattie and Bresnahan）評分，評分后三組每個時間點所有大鼠行組織灌注取材。10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，進行運動誘發(fā)電位（motor evoked potential，MEP）測定。4%多聚甲醛經(jīng)心內(nèi)灌注，取出脊髓損傷節(jié)段及頭尾端1 cm，在4%多聚甲醛中固定12 h，沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋。每份標本以損傷區(qū)為中心做連續(xù)切片30張，片厚4 μm。行HE染色和免疫組織化學染色。隨機選取10張備用。

1.6.1BBB評分

采用BBB評分觀察大鼠后肢運動功能恢復情況。評分在開放環(huán)境中進行，每次均在上午評分，評分前排空膀胱，觀察期為4 min?？偡?1分，主要依據(jù)實驗動物髖、膝、踝關節(jié)，行走、軀干運動、協(xié)調性情況進行評分［7］。得分越高后肢運動功能越好。0分為未觀察到后肢運動，21分為后肢運動功能正常。本法為主觀評分，為減少結果誤差，在實驗中采用雙人獨立觀察記錄。評分人員為熟悉評分規(guī)則的非本組實驗人員，最后結果為兩名觀察員的平均分。

1.6.2MEP檢測

采用Owen經(jīng)椎板電刺激技術。用神經(jīng)電生理儀（MEDELEC SYNERGY，德國）進行檢測。10%水合氯醛0.3 ml/100g腹腔注射麻醉。刺激電極為兩對針狀電極，分別放置于手術野上、下棘突間隙，即T5/6和L1/2。陰極置于陽極尾側，兩者間距0.5～0.8 cm。刺激類型為矩形脈沖，恒壓輸出，波寬0.05 ms，輸出強度100～150 V。記錄電極也為一對針狀電極，陰極置于左右側小腿脛前肌，陽極置于足墊水平的皮下。MEP信號輸入Viking IV系統(tǒng)前置放大器，靈敏度10 mV，濾波器帶通為10～3000 Hz，分析時間20 ms。采用觸發(fā)（trigger）方式，不作平均。在各時間點分別對三組潛伏期和波幅進行比較。

1.6.3HE染色

常規(guī)HE染色，觀察脊髓損傷后實驗組和對照組的局部大體的病理變化。

1.6.4免疫組織化學染色

將切片透明、脫水，3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10 min，抗原修復，正常山羊血清封閉液封閉20 min。分別滴加鼠單克隆抗體NF-200（1 ∶1000）、兔多克隆抗體GFAP（1∶500）50 μl，滴加二抗45～50 μl，37℃靜置1 h。DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明，中性樹脂封片。

Olympus光學顯微鏡400倍視野下，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件，對每個切片隨機選擇脊髓損傷區(qū)域3個視野，測量其內(nèi)NF-200軸突計數(shù)及GFAP陽性表達面積，取平均值。

1.7統(tǒng)計學分析

2　結果

2.1BBB評分

隨著時間的推移，三組BBB評分較前均有所提高。三組在1 d、1周、2周、4周時評分均無顯著性差異（P＞0.05）；8周時實驗組評分高于空白對照組和對照組（P＜0.05）。見表1。

2.2MEP檢測

術后1周，三組MEP潛伏期和波幅無顯著性差異（P＞0.05）。術后2、4、8周，實驗組較空白對照組和對照組MEP潛伏期縮短，波幅增加（P＜0.05）。見表2、表3。

2.3HE染色

空白對照組和對照組脊髓損傷打擊區(qū)域形態(tài)大體一致，無明顯差異。1周時可見中央灰質結構完整性被破壞，中心灰質區(qū)可見小片狀被破壞，脊髓灰白質內(nèi)大量體積較小的囊泡形成，呈蟲蝕樣改變。2周時灰白質破壞較1周時加重，可見大量體積較大的囊泡形成，并可見較小的脊髓空洞形成，及少量瘢痕組織形成。4、8周時可見損傷區(qū)域脊髓組織結構紊亂，明顯的脊髓空洞形成，可見大量膠質瘢痕。見圖1。

2.4免疫組織化學染色

2.4.1NF-200

脊髓橫行切片，光鏡下觀察，兩組均可見NF-200陽性表達。切片內(nèi)可見神經(jīng)元胞體和軸突被染成褐色，主要分布在脊髓組織白質損傷區(qū)域，2周、4周和8周時鏡下觀察見NF-200陽性表達明顯增強。見圖2。

三組術后1周時NF-200軸突計數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）；2周、4周和8周時，實驗組多于空白對照組和對照組（P＜0.05）。見表4。

2.4.2GFAP

脊髓橫行切片，光鏡下觀察，三組均可見GFAP陽性表達。切片內(nèi)可見被染成褐色的神經(jīng)膠質細胞，主要分布在脊髓組織白質損傷區(qū)域。見圖3。

三組各時間點GFAP免疫陽性細胞面積均無顯著性差異（P＞0.05）。見表5。

表1　三組大鼠各時間點的BBB評分

表2　各組不同時間MEP潛伏期比較（ms）

表3　各組不同時間MEP波幅比較（μV）

圖2　各時間點三組損傷節(jié)段脊髓NF-200表達（免疫組化染色，400×）

表4　各組NF-200染色軸突計數(shù)

圖3　各時間點三組損傷節(jié)段脊髓GFAP表達（免疫組化染色，400×）

表5　各組GFAP免疫陽性細胞面積（μm2）

3　討論

1995年Basso、Beattie及Breshnahan［8］研究制定了BBB行為功能評定量表，該量表是目前評價截癱大鼠后肢運動功能應用最廣泛的運動行為學評定標準。Borgens等對嚴重脊髓壓迫損傷的大鼠進行電刺激，結果顯示實驗組較對照組而言，可產(chǎn)生明顯的運動功能恢復［9］。

本實驗結果顯示，三組BBB評分在1 d、1周、2周、4周時均無顯著性差異；8周時實驗組BBB評分高于對照組和空白對照組（P＜0.05）。這提示周圍神經(jīng)電刺激能有效促進大鼠運動功能恢復，但需干預較長時間；隨著時間的推移，三組BBB評分均有所增長，表明脊髓損傷大鼠脊髓功能存在一定程度自發(fā)恢復現(xiàn)象［10］，這與既往的研究結果一致。

MEP刺激中樞神經(jīng)并在脊髓遠端、周圍神經(jīng)或肌肉記錄信號，能直接反映脊髓下行運動傳導束的功能狀態(tài)，對判斷和評估運動功能恢復有著重要的參考意義［11］。研究表明在反映脊髓運動功能方面MEP比體感誘發(fā)電位更為敏感、客觀［12］。

本實驗結果顯示，脊髓損傷后1周，三組MEP潛伏期和波幅無顯著性差異（P＞0.05），脊髓損傷后2、4、8周，三組MEP潛伏期和波幅存在顯著性差異（P＜0.05），此變化與NF-200的變化一致。說明早期進行電刺激干預，可能對運動傳導功能的恢復起到促進作用，但此過程需要一定的時間。

NF是神經(jīng)元的特異性標志之一［13］，是構成神經(jīng)元胞體和神經(jīng)軸突細胞骨架的主要成分，參與神經(jīng)元形態(tài)的維持，并與膜蛋白進行相互作用。中樞神經(jīng)損傷后，NF-200的表達水平可間接反映神經(jīng)軸突損傷和修復的程度。NF-200表達越強，提示再生的神經(jīng)纖維越多，在形態(tài)學上反映神經(jīng)生長的情況［14］。目前的研究發(fā)現(xiàn)，活動依賴性的基因表達在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展和可塑性中扮演著重要角色。電刺激可通過安全限度的電流刺激已損傷的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)，激活神經(jīng)產(chǎn)生電活動，能夠修復突觸的強壯度，促進細胞的存活［15］，減緩突觸的消失、增強髓鞘形成，并可能促進新生細胞形成［16］。大量的研究表明，功能性電刺激能夠促進損傷后周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復。Gordon等發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)修復期間，電刺激能夠促進運動神經(jīng)元及感覺神經(jīng)元的再生［17］。Udina等在脊髓橫斷模型中通過電刺激促進背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)軸突向中樞方向生長［18］。Brus-Ramer等在大鼠皮質脊髓束損傷的模型中，電刺激皮質椎體促進脊髓內(nèi)突觸的形成［19］。Becker等通過對脊髓橫斷性損傷的大鼠進行電刺激，促進了電刺激節(jié)段脊髓內(nèi)新生神經(jīng)祖細胞和膠質細胞的形成［20］。

本實驗選擇損傷節(jié)段脊髓作為觀測對象，能較好地反映神經(jīng)細胞在創(chuàng)傷后的修復反應。通過對軸突計數(shù)比較，2、4、8周時實驗組的NF-200陽性表達數(shù)量明顯多于空白對照組和對照組，同時2、4、8周MEP的改變與之一致。說明坐骨神經(jīng)電刺激有可能通過促進損傷部位脊髓內(nèi)軸突的再生，促進神經(jīng)功能的恢復。這與既往的研究結果一致。

GFAP是構成神經(jīng)膠質細胞的主要細胞骨架。脊髓損傷后星形膠質細胞功能明顯活躍及膠質化，表現(xiàn)為膠質細胞過度增生，形成膠質瘢痕，從而對神經(jīng)纖維生長及神經(jīng)再通起著機械和化學性的阻礙作用，阻礙損傷神經(jīng)元的修復以及再生軸突的延伸，嚴重影響神經(jīng)修復和肢體功能的改善［21-22］。

Hamid等發(fā)現(xiàn)電場刺激可以減輕損傷部位的神經(jīng)膠質增生［23］。但本實驗各個時間點三組GFAP陽性細胞面積無顯著性差異（P＞0.05）。提示周圍神經(jīng)電刺激對膠質神經(jīng)過度增生沒有明顯的抑制作用，對膠質瘢痕的形成無改善作用。

電刺激促進脊髓恢復的確切機制至今仍不完全明確，其可能的機制如下。①應用電場通過膜受體和第二信使（腺苷酸環(huán)化酶）及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的生理性神經(jīng)營養(yǎng)因子相互作用促進軸突生長［24］。②刺激電流能夠減少損傷后內(nèi)源性鈣內(nèi)流向破壞的軸突，減少細胞自毀效果［3］；同時也就減少面向陰極的軸突末端退化［25］。③減少損傷部位星形膠質細胞［26］，改善損傷后脊髓血流［27］。④電刺激可以增強神經(jīng)再生相關基因的表達［28］，調節(jié)免疫、造血及內(nèi)分泌功能［29］，從而加速周圍神經(jīng)系統(tǒng)的再生。

周圍神經(jīng)電刺激能促進脊髓損傷大鼠的傳導功能和運動功能恢復的出現(xiàn)，傳導功能的恢復需電刺激作用時間達2周以上，運動功能的恢復需電刺激作用時間達8周以上。其作用機制可能與促進脊髓損傷節(jié)段內(nèi)軸突再生相關。

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Effect of Peripheral Nerve Electrical Stimulation onAxon Regeneration after Spinal Cord Injury in Rats

WANG Yong-jie1，HONG Yi2，CHEN Xue-ming1，ZHANG Ya-kui1
1.Department of Orthopedics，Beijing Luhe Hospital，Capital Medical University，Beijing 101149，China；2.Department of Spine Surgery，Beijing Bo'ai Hospital，China Rehabilitation Research Center，Beijing 100068，China

Correspondence to HONG Yi.E-mail：hongyihhyy@163.com

Objective To explore the effect of peripheral nerve electrical stimulation on axon regeneration after spinal cord injury（SCI）in rats.Methods Nighty-two healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank control group（n=12），control group（n=40）and experimental group（n=40）.All groups were suffered NYU impaction to prepare T8SCI models，the control group and the experimental group implanted stimulating electrode on the sciatica nerve.The experimental group received electric intervention in addition.They were evaluated with BBB score one day，one week，two weeks，four weeks and eight weeks after modeling；and with motor evoked potentials （MEP）one week，two weeks，four weeks and eight weeks after modeling.Morphological changes and the expression of neurofilament protein（NF）-200 and glial fibers acid protein（GFAP）were observed by HE staining and immunohistochemistry one week，two weeks，four weeks and eight weeks after modeling.Results There was no significant difference in BBB scores among three groups（P＞0.05）in all the time points except eight weeks（P＜0.05）.There was no significant difference in the amplitudes and latencies among three groups one week after modeling（P＞0.05），however，there was significant difference two weeks，four weeks and eight weeks after modeling（P＜0.05）.All the groups showed syringomyelia and glial scar formation one week，two weeks，four weeks and eight weeks after modeling.There was no significant difference in NF-200 axon count among three groups one week after modeling（P＞0.05），but was different two weeks，four weeks and eight weeks after modeling（P＜0.05）.There was no significant difference in GFAP area count among three groups in all the time points （P＞0.05）.Conclusion Implantable peripheral nerve electrical stimulation can improve conduction function and motor function in rats with SCI.And it may promote axonal regeneration of the injured segments.

spinal cord injury；electrical stimulation；axonal regeneration；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.08.003

R651.2

A

1006-9771（2016）08-0884-08

1.首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院骨科，北京市101149；2.中國康復研究中心北京博愛醫(yī)院，北京市100068。作者簡介：王永杰（1983-），男，北京市人，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：脊柱外科。通訊作者：洪毅。E-mail：hongyihhyy@163.com。

脊髓損傷后由于原發(fā)性及繼發(fā)性因素導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中軸突的連續(xù)性遭到損壞、軸突變性、神經(jīng)細胞壞死、神經(jīng)細胞和膠質細胞凋亡等損害，從而產(chǎn)生持續(xù)性的功能障礙［1-3］。目前的研究認為，神經(jīng)電活動在神經(jīng)的發(fā)育和可塑性中扮演著重要的角色。

電刺激技術通過安全限度的電流，刺激已損傷的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)，能夠激活神經(jīng)產(chǎn)生電活動，有可能促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生與修復［4］。電刺激大體可以分為兩類：一類為電場刺激；另一類為周圍神經(jīng)電刺激。已有大量的文獻表明外加的弱電場可以促進神經(jīng)功能的恢復，可促進軸突的再生，并認為軸突再生與神經(jīng)功能恢復相關［5］。但電場刺激須將電極植入損傷脊髓附近，并長期保留體內(nèi)，不但手術操作困難，且容易造成脊髓二次損傷及脊髓感染等相關并發(fā)癥。

周圍神經(jīng)電刺激由于將刺激器植入于周圍神經(jīng)，可有效避免上述并發(fā)癥的出現(xiàn)，但目前關于周圍神經(jīng)電刺激促進脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復的研究較少。本研究嘗試通過建立動物脊髓損傷模型，對脊髓損傷平面下進行周圍神經(jīng)電刺激，觀察電刺激在不同電刺激周期內(nèi)能否促進軸突再生。

（2016-04-19

2016-06-12）