頭穴叢刺結合跑臺訓練對坐骨神經損傷大鼠軸突再生及S-100蛋白表達影響①

王艷，趙玖玫，朱路文

·基礎研究·

頭穴叢刺結合跑臺訓練對坐骨神經損傷大鼠軸突再生及S-100蛋白表達影響①

王艷1，趙玖玫2，朱路文1

目的探討頭穴叢刺結合跑臺訓練對坐骨神經損傷大鼠軸突再生及S-100蛋白表達的影響。方法清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠90只，隨機分為空白組、假手術組、模型組、跑臺組和頭穴叢刺結合跑臺組，每組18只，每組分為7 d、14 d、21 d三個亞組。鉗夾法造模，假手術組暴露坐骨神經但不鉗夾。造模3 d后進行干預，跑臺組進行跑臺訓練，頭穴叢刺結合跑臺組行頭穴叢刺治療結合跑臺訓練，空白組、假手術組及模型組除定時抓取外不做任何干預。各組相應時間點測定坐骨神經功能指數（SFI）；取材后坐骨神經HE染色觀察軸突生長情況，免疫組化染色檢測S-100蛋白表達情況。結果各時間點跑臺組及頭穴叢刺結合跑臺組SFI高于模型組（P＜0.05），但低于假手術組和空白組；頭穴叢刺結合跑臺組SFI高于跑臺組（P＜0.05）。各時間點跑臺組和頭穴叢刺結合跑臺組軸突生長情況均優于模型組，頭穴叢刺結合跑臺組優于跑臺組。各時間點空白組和假手術組S-100蛋白均呈少量表達，跑臺組、頭穴叢刺結合跑臺組S-100蛋白表達均高于模型組（P＜0.05），頭穴叢刺結合跑臺組S-100蛋白表達高于跑臺組（P＜0.05）。結論頭穴叢刺結合跑臺訓練能夠促進S-100蛋白的表達，促進損傷神經軸突再生，提高坐骨神經功能。

坐骨神經損傷；頭穴叢刺；跑臺訓練；S-100蛋白；坐骨神經功能指數

［本文著錄格式］王艷，趙玖玫，朱路文.頭穴叢刺結合跑臺訓練對坐骨神經損傷大鼠軸突再生及S-100蛋白表達影響［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（8）：904-910.

CITED AS：Wang Y，Zhao JM，Zhu LW.Effect of cluster needling of scalp acupuncture combined with treadmill training on axonal re-generation and expression of S-100 protein in rats with sciatic nerve injury［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（8）：904-910.

神經幾乎存在于人體所有的組織器官中。與中樞神經系統不同，大多數周圍神經更加表淺并缺乏骨性結構的保護，因此周圍神經損傷是臨床常見問題，非戰爭時期約占全部創傷的1.5%～4%，35%的血管損傷并發周圍神經損傷，7%～9%的骨折、脫位并發周圍神經損傷，而且修復緩慢［1-2］。

周圍神經損傷主要表現為神經支配區的疼痛，運動和/或感覺功能障礙等。周圍神經損傷的修復是一個復雜的過程。雖然顯微手術可以精細修復神經的連續性，但其功能的恢復不盡人意，據統計僅有50%可能會完全恢復［3］。周圍神經損傷后，中樞神經、損傷部位和遠端肌肉及末梢效應器均會發生改變。中樞神經系統結構和功能的完整性是靠外周信號的輸入和效應器官的正常功能活動來維持的，周圍神經損傷和中樞神經系統損傷一樣也會引起腦功能的重塑。皮層代表區的持續競爭使那些接受重要信息的皮層區域增大，并導致其他區域減小。神經信號輸入不足或完全喪失可導致鄰近皮層代表區侵入去神經輸入的皮層代表區，使其功能進一步喪失［4］。周圍神經損傷后腦功能重塑的程度是影響神經功能恢復的重要因素之一［5］。因而康復治療應從周圍神經系統和中樞神經系統綜合考慮。

針灸在周圍神經損傷后的治療作用早有研究證實，但多數是在受損部位局部取穴［6］。頭部針刺對周圍神經損傷治療作用及機制尚有待研究。跑臺訓練作為運動訓練的一種方式，由于其精確、可控等優點，現已在實驗中廣泛應用。崔松彪等對坐骨神經卡壓的大鼠進行跑臺訓練，證明運動訓練能夠促進神經運動功能的恢復［7］。坐骨神經橫斷后即刻進行適度的跑臺運動，可促進軸突再生，恢復肌肉反射能力，提高大鼠適應不同生物力學要求的步行能力［8］。

神經損傷修復的微環境中，功能最顯著、最被人熟知的周圍神經膠質細胞就是施萬細胞，它包繞周圍神經軸突［9］，功能活躍。研究周圍神經損傷后施萬細胞增殖已成為促進神經損傷修復的熱點［10］。在周圍神經系統中，S-100蛋白只分布于施萬細胞內。在周圍神經系統中檢查到S-100蛋白時，則表明該處施萬細胞增殖活躍［11-12］。

本研究觀察頭穴叢刺結合跑臺訓練對坐骨神經損傷大鼠S-100蛋白表達及軸突再生［13］的影響，為周圍神經損傷的治療提供理論依據。

1　材料與方法

1.1實驗設備

組織包埋機：德國THERMO HISTOSTAR。HM 340E石蠟切片機：德國THERMO。BX60研究型顯微鏡、DP72顯微攝像系統：日本OLYMPUS。數碼醫學圖像分析系統Med 6.0：中國MOTIC。

1.2實驗動物與分組

清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠90只，體質量（200±20）g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。采用隨機數字表法隨機分為空白組、假手術組、模型組、跑臺組、頭穴叢刺結合跑臺組，每組18只。每組按時間點分為3個亞組，每個時間點6只。三個時間點分別是造模后7 d、14 d、21 d。

1.3模型制備

用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，以角膜反射消失為標準。于大鼠右側股后正中行長1 cm縱形切口，逐層分離深筋膜及肌肉，游離出坐骨神經，在距坐骨結節6 mm處，用長約12 cm止血鉗，前端套無菌滴管進行鉗夾，鉗夾處神經長約3 mm，扣滿3扣，鉗夾10 s，放松10 s，連續3次，然后逐層縫合。假手術組游離神經后不鉗夾神經?？瞻捉M不手術。

1.4造模成功判定標準

經行為學觀察，造模后大鼠行走時身體向健側傾斜，患側腿部肌肉收縮無力，前行時靠患側臀部肌肉的收縮代償，足拖地且足背下垂，患側足趾并攏，伸趾不能，整體行走時呈現出扭臀且跳躍步態，鏡下可見軸突、髓鞘、內膜管及內在纖維斷裂，但束膜尚完整，符合SunderlandⅢ度損傷，即為造模成功。

1.5干預方法

空白組、假手術組、模型組均正常飼養，除每天定時抓取外不做其他任何干預。跑臺組于造模后3 d行跑臺訓練，頭穴叢刺結合跑臺組于造模后3 d行頭部針刺治療的同時進行跑臺訓練。

1.5.1跑臺訓練

造模前，跑臺組和頭穴叢刺結合跑臺組大鼠均進行適應性跑臺訓練3 d。將大鼠放置于跑臺上，啟動跑臺，緩慢調節至大鼠所能適應的速度，保證大鼠運動速度與跑臺速度一致。造模成功3 d后，開始正式訓練，坡度為0°。速度：訓練第1～3天8 m/min，第4～7天12 m/min，7 d后15 m/min。每次30 min，每天1次。

1.5.2頭穴叢刺

采用直徑0.25 mm，長25 mm針灸針（安迪），經碘伏消毒后，取百會及其兩側旁開2 mm處平刺，深15 mm?？焖倌磙Dl min后留針2 h，每天1次。

1.6坐骨神經功能指數（sciatic functional index，SFI）［14］

自制大鼠足印行走箱，內徑8.5 cm，長50 cm，一側開門，將等寬、等長70 g白紙放在箱底。大鼠雙足蘸碳素墨水后由一端放入箱內，走向箱的另一端，并從側門走出。每側足留下3或4個足印，選實驗側足（E）、正常側足（N）足印測量3個變量。

①足印長度（podogram length，PL）：足印的最長距離，即從足跟到足尖。②足趾寬度（toe spread，TS）：第1趾到第5趾連線長。③中間足趾距離（inter-toes distance，IT）：第2趾到第4趾連線長。將上述3個變量代入Bain公式計算出SFI。

SFI以0為正常值，-100為神經完全斷離。

1.7標本采集

各時間點，用10%水合氯醛0.35 ml/100g腹腔注射麻醉大鼠后，經由造模時切口，逐層分離，暴露神經，手術線標記受損神經遠端，剪取鉗夾處的神經組織約1 cm，即刻固定于10%甲醛溶液中。

1.8標本制備

將組織切成厚0.3 mm的組織塊，放入包埋盒內再固定。梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。石蠟切片，厚4 μm，60℃烤片機內烤片12 h，4℃冰箱備用。

1.9HE染色

切片脫蠟至水，入蘇木素染液5 min，70%鹽酸酒精分化10 s，自來水充分沖洗，使細胞核藍化，蒸餾水洗，入伊紅染液1 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹脂封片。每組取6張切片，每張切片隨機取5個視野。采用BX60多功能顯微鏡進行觀察。

1.10免疫組化染色

切片脫蠟、水化。采用抗原修復液（pH 6.0）對組織切片進行預處置。3%H2O2去離子水孵育15 min，以阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗。滴加一抗（S-100蛋白，1∶200，北京中杉金橋生物制劑有限公司），4℃孵育過夜。PBS浸洗，滴加IgG抗體-Fab 段-HRP多聚體，室溫37℃孵育30 min，PBS洗3 min×5次。DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明、樹脂封片。每組觀察6張切片，每張切片隨機取5個視野。采用BX60多功能顯微鏡進行觀察。采用Mad 6.0數字病理圖像分析系統（麥克奧迪公司）對圖像進行分析，得出IOD值。

1.11統計學分析

2　結果

2.1一般情況

造模大鼠均于造模結束1.5 h后蘇醒，其中模型組、跑臺組和頭穴叢刺結合跑臺組大鼠造模后較空白組和假手術組大鼠活動減少，患側后肢拖行，患側足背伸無力，足下垂現象明顯。治療后，隨著治療時間延長，跑臺組和頭穴叢刺結合跑臺組活動量逐漸增大，拖行、足背伸無力、足下垂現象均改善，模型組自然恢復也略有改善，但改善程度遠不及另兩組。

假手術組大鼠未出現自噬現象，模型組自噬現象最重，可見趾骨暴露，患側足部腫大、潰爛，跑臺組、頭穴叢刺結合跑臺組偶有自噬且程度均較輕，偶見患足略紅腫，未出現潰爛現象。與其他組比較，模型組大鼠毛發光滑度差且精神萎靡。跑臺組、頭穴叢刺結合跑臺組大鼠較模型組大鼠精神活躍，毛發光澤。

2.2SFI

空白組和假手術組各時間點大鼠SFI為0。隨著時間推移，各組造模大鼠SFI增加。造模后各時間點，頭穴叢刺結合跑臺組和跑臺組SFI均高于模型組（P＜0.05），頭穴叢刺結合跑臺組SFI均高于跑臺組（P＜0.05）。見表1。

2.3HE染色

各時間點空白組和假手術組呈現出正常神經的解剖結構，即坐骨神經由大小不等的神經束組成，外面由外膜、束膜兩層包繞，神經組織結構完整，軸突直徑一致，均勻分布，緊密有序、排列規則。

各時間點模型組神經組織排列松散，纖維雜亂無序、纖維發生潰變，細胞腫脹，間質水腫，呈現明顯空泡樣改變，胞核皺縮或溶解碎裂明顯。可見炎性細胞小灶性浸潤。再生髓鞘少且薄，再生神經纖維稀少、分散。

各時間點跑臺組和頭穴叢刺結合跑臺組與模型組比較，細胞腫脹較輕，空泡和核的改變較少，散在炎性細胞浸潤，髓鞘較完整、規則，出現的新生纖維較多，神經干和外膜也有新生血管，束間結締組織較少。且頭穴叢刺結合跑臺組軸突生長情況優于跑臺組。見圖1。

其中7 d時即損傷初期，模型組、跑臺組、頭穴叢刺結合跑臺組組間差異最小，各組損傷最重，治療后，各組開始恢復，隨著治療時間延長，三組間差異逐漸變大，21 d時組間差異最大。

2.4免疫組織化學染色

各時間點空白組和假手術組S-100蛋白均少量表達。術后7 d可見模型組、跑臺組、頭穴叢刺結合跑臺組S-100蛋白表達升高（P＜0.05），且7 d時各組S-100蛋白表達最高，出現峰值，術后14 d、21 d呈下降趨勢。與模型組比較，7 d、14 d、21 d各干預組S-100蛋白均有不同程度升高（P＜0.05），且頭穴叢刺結合跑臺組表達高于跑臺組（P＜0.05）。見圖2、表2。

表1　各組大鼠各時間點SFI

圖1　各組坐骨神經21 d形態（HE染色，bar=50 μm）

圖2　各時間點各組坐骨神經S-100蛋白表達（免疫組化染色，bar=50 μm）

表2　各組大鼠各時間點坐骨神經S-100蛋白表達（IOD）

3　討論

以往研究發現中樞神經具有可塑性［15］。有學者指出周圍神經也具有可塑性，人體和動物研究，已發現在周圍神經系統損傷后大腦皮質代表區可以很快出現重構的現象，周圍神經損傷后幾秒的時間里，就可觀察到相應的大腦皮質代表區發生了變化［16］。

周圍神經損傷后，治療也應從中樞和周圍兩方面入手。我們一方面針刺頭部運動代表區加強對中樞的刺激，一方面進行跑臺訓練，對坐骨神經損傷大鼠進行雙向干預。結果顯示頭穴叢刺結合跑臺訓練效果優于單純跑臺訓練，也就是中樞、外周雙向干預效果優于單純的外周干預。

施萬細胞是周圍神經系統特有的膠質細胞，不但在周圍神經的發生、發育、形態和功能維持方面起重要作用，也在周圍神經損傷后軸突再生與髓鞘形成過程中起著重要作用［17］。一方面吞噬軸突和髓鞘潰變而形成的髓球和脂滴，另一方面增殖的施萬細胞沿著基膜管整齊排列形成細胞索帶，對再生軸突起引導作用，誘導軸突生長錐沿一定方向生長直至終末器官。而且施萬細胞能分泌多種活性物質，從而誘導、刺激和調控軸突的再生和髓鞘的形成；還能產生細胞外基質和細胞黏附分子，與相鄰軸突形成縫隙連接和緊密連接，這些功能都與神經再生密切相關［18］。促進施萬細胞增殖，可能促進周圍神經修復與再生［19］。

S-100蛋白是一種分子量為21～24 kDa的高溶解性酶。免疫組化和免疫細胞化學的研究發現，在周圍神經系統中，S-100蛋白只存在于施萬細胞中，當施萬細胞增殖活躍時，S-100蛋白的表達水平隨之升高。檢測S-100蛋白的含量，可間接反映神經損傷后施萬細胞的增殖情況，是一種較好的反映周圍神經修復與再生的形態學指標［20］。本實驗結果顯示，頭穴叢刺結合跑臺訓練可以提高S-100蛋白的表達水平并促進軸突再生，說明頭穴叢刺結合跑臺訓練可能通過促進施萬細胞的增殖來進一步誘導軸突再生，從而促進了神經損傷的修復。

頭穴叢刺針法是由于致順教授首先提出。多年研究證明，對頭部穴位針刺可產生針場，將生物電傳到大腦皮層以改變大腦皮層神經細胞的興奮性［21-22］。根據周圍神經損傷后引起皮質代表區改變的特點，本實驗針刺區域覆蓋與大鼠運動功能最密切的頂區、頂前區［23］，并在針刺同時進行跑臺訓練，結果顯示，通過干預，頭穴叢刺結合跑臺組大鼠軸突生長情況較模型組和跑臺組改善，S-100蛋白的表達高于模型組和跑臺組，SFI也高于模型組和跑臺組。說明頭穴叢刺結合跑臺訓練可以促進軸突再生和S-100蛋白高表達，從而促進大鼠坐骨神經損傷的修復。本課題組前期的研究中也證實頭穴叢刺、神經松動術以及頭穴叢刺結合神經松動術均能改善周圍神經損傷術后患者的運動和感覺功能，并且頭穴叢刺結合神經松動術優于單純的頭穴叢刺與神經松動術［24］。

跑臺訓練對周圍神經的作用早有證實。朱齊寧等制備坐骨神經切斷模型，每天進行零坡度跑臺運動訓練，每周遞增速度，結果表明跑臺訓練組可促進神經軸突再生，提高運動神經元存活率［25］。本實驗用跑臺訓練治療坐骨神經損傷的大鼠，HE染色結果顯示各時間點跑臺訓練可減輕損傷神經的炎性反應，有效促進神經軸突的再生；跑臺組SFI高于模型組，跑臺組S-100蛋白的表達均高于模型組，可見跑臺訓練可促進坐骨神經功能的恢復、軸突再生及S-100蛋白的表達。池松鶴對神經損傷大鼠進行不同負荷的跑臺訓練，研究發現其可增加大鼠在傾斜臺上維持姿勢的最大角度，提高SFI，縮短潛伏期，增大波幅，也證實對坐骨神經受損傷大白鼠進行運動訓練時能促進其運動功能的恢復［26］。

在本研究中，模型組、跑臺組、頭穴叢刺結合跑臺組S-100蛋白表達均呈先升高后降低的趨勢。7 d、14 d頭穴叢刺結合跑臺組表達高于跑臺組，跑臺組高于模型組。表明兩種干預方法都可以促進施萬細胞增殖，但頭穴叢刺結合跑臺組的效果更好。損傷后21 d，各組S-100蛋白表達水平下降，逐漸趨于正常水平，HE染色結果也顯示神經纖維有序排列，這時頭穴叢刺結合跑臺組及跑臺組S-100蛋白表達高于模型組，而頭穴叢刺結合跑臺組又優于跑臺組。各時間點頭穴叢刺結合跑臺組及跑臺組SFI值高于模型組，而頭穴叢刺結合跑臺組又高于跑臺組。這些總體說明兩個處理組延緩了S-100蛋白的下降，但頭穴叢刺結合跑臺組的作用更明顯。有研究顯示，損傷后神經組織內S-100合成增加、積聚明顯，至損傷后5、7 d達高峰，之后S-100軸漿轉運加速，積聚的S-100開始減少，至21 d趨正常［27］，與本實驗的研究一致。

綜上所述，頭穴叢刺結合跑臺訓練可以上調S-100蛋白表達水平并促進軸突再生，對促進大鼠坐骨神經損傷修復有重要意義。

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Effect of Cluster Needling of Scalp Acupuncture Combined with Treadmill Training on Axonal Regeneration and Expression of S-100 Protein in Rats with Sciatic Nerve Injury

WANG Yan1，ZHAO Jiu-mei2，ZHU Lu-wen1
1.The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin，Heilongjiang 150001，China；2.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin，Heilongjiang 150040，China

Correspondence to WANG Yan.E-mail：swallow-1113@163.com

Objective To explore the effect of cluster needling of scalp acupuncture combined with treadmill training on axonal regeneration and expression of S-100 protein in rats with sciatic nerve injury.Methods Ninety male Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank group，sham group，model group，treadmill group and cluster needling of scalp point combined with treadmill group（combination group），each group was further divided into 7，14 and 21 days subgroups，with 6 rats in each subgroup.The sciatic nerve of rats was clamped in the model group，the treadmill group and the combination group.The sham group was subjected to the same surgical procedure with sciatic nerve exposure but without crush injury.Three days after modeling，the treadmill group was treated with treadmill training，and the combination group was treated with cluster needling of scalp acupuncture and treadmill training，while the other groups were grabbed regularly，with no other intervention.The sciatic functional index（SFI）was tested，the condition of axon growth was observed with HE staining，and the expression of S-100 protein was examined with immunohistochemistry at each time point.Results At each time point，SFI was higher，the axon grew better，and the S-100 protein was higher expressed in the treadmill group and the combination group than in the model group （P＜0.05），especially in the combination group（P＜0.05）.Conclusion Cluster needling of scalp acupuncture combined with treadmill training can accelerate the regeneration of axons and increase the expression of S-100 protein and improve sciatic function after sciatic nerve injury.

sciatic nerve injury；cluster needling of scalp acupuncture；treadmill training；S-100 protein；sciatic functional index

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.08.006

R745.4

A

1006-9771（2016）08-0904-07

1.黑龍江中醫藥大學創新人才基金項目（No.051290）；2.黑龍江省博士后基金項目（No.LBH-Z13202）。

1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱市150001；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱市150040。作者簡介：王艷（1967-），女，遼寧莊河縣人，博士，博士后，主任醫師，教授，主要研究方向：周圍神經損傷康復。E-mail：swallow-1113@163.com

（2016-02-02

2016-03-28）