LC-NMR聯用技術的研究進展

吳春紅

(中國石油化工股份有限公司北京化工研究院燕山分院，橡塑新型材料合成國家工程研究中心，北京 102500)

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綜述

LC-NMR聯用技術的研究進展

吳春紅

(中國石油化工股份有限公司北京化工研究院燕山分院，橡塑新型材料合成國家工程研究中心，北京 102500)

本文從NMR的靈敏度，溶劑的相容性、溶劑譜峰的抑制、聯用儀器NMR探頭的設計、LC-NMR操作模式等方面對LC-NMR聯用儀器的發展過程進行了較為詳細的介紹，并依托文獻的研究實例對連續流(continuous flow)方式和駐流(stopped flow)方式兩種操作模式進行了對比分析。

LC-NMR聯用連續流駐流

1　引言

最近的幾十年，應用與分離技術相關的儀器聯用技術進行復雜基體的定性和定量分析發展很快。分離技術中高效液相色譜(HPLC)是分析復雜有機物、藥物和生物大分子等混合物的一種重要手段，近年來相關技術的發展實現了高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)聯用的實際應用，但MS本身并不能夠提供清晰的分子結構信息，而且在實際HPLC-MS的使用中，常常需要核磁共振(NMR)的數據。隨著近年來NMR儀器靈敏度的不斷提高，HPLC與NMR直接相連已經成為可能，HPLC與MS或NMR的物理連接增強了解決未知化合物結構問題的能力[1，2]。 20世紀70年代末，第一次有人將HPLC-NMR聯用，由于技術方面的原因，直到80年代末HPLC-NMR技術才作為一種有效的分析手段而得到了承認。最近幾年HPLC-NMR的分析方法迅速發展并取得了巨大的成功，已經被證明為生物化學和藥物化學分析中最重要的分子結構鑒定方法之一[3]。

1978年，第一篇關于LC-NMR聯用的文章問世，采用駐流操作的方法分析了一個含有兩至三個已知化合物的混合物，那時，NMR方面的局限比較嚴重，主要是NMR溶劑、軟件、硬件以及只有在旋轉狀態才能得到較高分辨率的譜圖，使得NMR直接與HPLC聯用比較困難[4]。M.V. Silva Elipe[5]曾經使用四氯乙烯或四氯化碳作溶劑，ETH-Silia作為正相柱進行過聯用實驗，但由于當時溶劑峰抑制技術的欠缺，使得他只能將精力集中在NMR的軟件、硬件以及色譜上使用反相柱等來拓展聯用技術的應用范圍。LC-NMR聯用技術采用反相色譜柱，使得這個技術更復雜，這是因為：(1)使用多于一種的含質子溶劑，會嚴重干擾樣品的分析；(2)如果使用梯度柱，在色譜運行過程中，溶劑在發生變化；(3)分析物質的信號強度與溶劑的信號強度相比太小。1995年，Smallcombedeng[6]克服了上述困難，發展了溶劑抑制技術，大大改善了流動和駐流模式LC-NMR技術的譜圖質量。WET(T1效應水峰抑制技術)優化抑制溶劑產生了高質量的1D譜以及2D譜，采用的兩維譜技術有WET-TOCSY，WET-COSY，WET-NOESY等。

2　LC-NMR

到底是使用NMR還是LC-NMR來分析混合物，取決于色譜分離能力以及NMR的結構分析能力，LC-NMR主要考慮的技術細節是NMR的靈敏度，溶劑的相容性、溶劑的抑制、NMR探頭的設計、色譜峰以及NMR流動池的體積。采用Bruker公司的核磁共振譜儀的LC-NMR聯用儀器構造示意圖[7]如圖1。

2.1NMR靈敏度

相對于MS來說，NMR是一個不靈敏的分析方法，MS分析的檢出限在皮克(pg)數量級，而現代高場NMR譜儀(400MHz或更高)能檢測得到的信號為納克量級(MW300)。對于結構分析來說，亞毫克量級可以較好地解決，樣品量的下限一般是在幾百納克左右。采用超低溫探頭技術，NMR的靈敏度可以大大改善，可以檢測到幾納克量級的樣品信號。因為質子的高靈敏度、高豐度，以及有機化合物中普遍存在的特點，使得質子是NMR分析中最廣泛使用的原子核；相對而言，C-13作為有機化合物的基本骨架結構使它成為另一個較主要的核，但由于其天然豐度較低(1.108%)，只有在目前儀器改進了靈敏度的情況下才成為了一個常規分析的原子核。F-19，自然界中100%的豐度，但使用相對較少，因為只有大約10%的藥物使用含氟的化合物。NMR所能測試的原子核的種類很多，凡是具有核磁矩的原子核都可以進行測試。

在做NMR譜的時候，信號需要累加的時間取決于樣品量和所測試核的種類，為了獲得較好的信噪比，對于1～10μg的樣品量，一般累加過夜是很正常的。

2.2NMR和色譜相容的溶劑

液體NMR需要氘代試劑，一般將溶劑放置在5mm或3mm的樣品管中，容積相當于500μL或150μL，HPLC需要大量的溶劑，這必然大大增加運行成本，D2O是最便宜的氘代試劑，但是價格超過300美元/升；氘代乙氰(CD3CN)的價格取決于D2O的含量，但是也超過1000美元/升。氘代甲醇則更貴，因此使用氘代試劑作為正相溶劑根本承受不了高昂的價格，這就必然要采用反相柱。另外我們必須要考慮的是HPLC梯度柱與NMR操作的相容性，HPLC梯度柱中由于溶劑的相互混和引起磁場的不均勻性大于2～3%/分鐘。

2.3HPLC高濃度溶劑導致的NMR信號抑制

由于LC-NMR運行過程中，溶劑峰的信號強度要大大高于樣品的信號峰強度，我們必須壓制溶劑峰的強度，即使采用氘代試劑，我們也必須抑制溶劑峰。以乙氰為例，CH3或CD3的C-13的兩個衛星峰強度要高于樣品的信號峰強度。WET溶劑峰抑制技術[8]自1995年開發以來，大大改善了LC-NMR譜的質量，而且WET溶劑壓制技術成為一種常規技術。WET溶劑抑制技術是LC-NMR的標準技術，因為相對與其他抑制技術如預飽和或WATERGATE技術，WET技術有能力同時抑制幾個溶劑峰，而基線又不受太大的影響；其缺點就是：在溶劑峰附近的樣品峰的強度也會受到相應的影響，導致結構信息的丟失。

2.4NMR流動探頭設計

常規NMR流動池的設計，有效體積為60μL (相當于接收線圈的長度)，整個流動池的體積為120μL，這就意味NMR只能“看”60μL的色譜峰，假定HPLC的流動速率為1mL/min，采用4.6mm的柱子，那么只有3.6s的色譜峰能被NMR檢測到，而色譜峰寬一般來說要寬于4s，這是LC-NMR與常規的3mm NMR探頭相比明顯的缺陷，常規探頭與色譜峰的寬度是無關的。

2.5 LC-NMR靈敏度

由于NMR是一個低靈敏的技術，需要的樣品量在幾個mg范圍，HPLC如果注入如此多的樣品量的話，HPLC柱子會飽和，這將影響色譜的分辨率和分離效果；另一個影響色譜性能的因素是氘代溶劑，因為一般情況下，采用氘代溶劑會使得色譜峰加寬，偶然情況下色譜峰的保留時間還會改變，這是應該改進色譜技術來得到可靠的分辨率的原因，方法之一是降低流速到低于1mL/min來增加LC-NMR的靈敏度，這種情況下，大部分的色譜峰能被NMR看到；但無論如何，上述情況只有在LC體系的泵在低于1mL/min的流速下可以精準控制時才能實施。

2.6LC-NMR操作模式

HPLC與NMR的連接是通過紅色的聚醚酮(PEEK)，由于超屏蔽NMR磁體的屏蔽效應，HPLC與磁體的距離可以短至30～50cm，常規磁體，HPLC與NMR磁體的距離在1.5～2m之間。聯用時一般使用UV檢測器來監測HPLC的運行，放射性或者熒光檢測器也可以用來檢測感興趣的色譜峰。目前HPLC-NMR的主要操作方式：連續流(continuous flow)方式和駐流(stopped flow)方式，其中駐流方式又分為3種：時間分割(time-sliced)駐流方式、脫機駐流方式和UV-檢測器自動控制NMR取樣方式。

2.6.1 連續流模式

在HPLC-NMR所使用的操作模式中，連續流方式是最簡單的一種。在連續流操作中，HPLC的流動是連續的，不受NMR 進樣的影響，當每一組分由HPLC流經NMR檢測池時儀器就會掃描出這個組分的譜圖。使用這種方法可以在很短的時間內完成樣品的分析并得到各組分分子結構方面的信息。因此連續流操作方式在一些要求較快得出檢測結果的分析中得到了應用。連續流NMR探頭的幾何結構[7]如圖2所示。

Siderman等[8]在1996年首次報道了使用750MHz HPLC-1H NMR采用連續流操作方式進行同分異構體分析，分離2-，3-，4-，氯苯酸葡萄糖苷酸取得了非常理想的效果。Godejohann[9]通過實驗證明了HPLC-NMR的連續流操作方法在某些實際分析中有良好的定量性能，報道中使用了兩種定量方法來分析環境樣品中的硝基爆炸殘余物。分析結果表明標準偏差在mg級不超過2%，在檢測限附近小于40%，完全可以滿足環保定量分析的要求。但是，連續流操作方式在應用上有諸多的限制：首先只能檢測出1H和19F的NMR譜，而目前在生物化學和藥化研究中很多情況下需要用到31P譜的信息；其次若在操作中HPLC采取梯度流出的方式，則NMR溶劑峰位置會隨溶劑組成而變化，這樣必須準確知道不同組成溶劑峰的位置才能有效地抑制溶劑的NMR信號；再次是流動或連續流動需要更多的樣品量來在線檢測，因為樣品在NMR探頭中的停留時間很短，在流動速率為1mL/min時停留時間僅為3.6s，這種方式決定了只能收集NMR一維譜，而且只能分析混合物中的含量較高的組分，使用連續流方式不能夠對待測組分作NMR二維譜，使結構信息的獲得受到了很大的限制。由于以上的缺陷，連續流操作方式在很多情況下不能滿足當今分析研究的需要。

2.6.2駐流模式

如果待測組分的保留時間已知或可用UV、MS等檢測器有效地檢測到色譜峰的存在，則可以使用駐流操作模式。在駐流操作中，NMR不再隨著色譜的連續流動對各個峰進行即時掃描，而是通過不同方式對樣品中各組分(或感興趣的組分)進行單個的、較長時間的掃描。目前較常用的駐流方式主要分為三類：時間分割(time-sliced)駐流方式、脫機駐流方式和UV-檢測器自動控制NMR取樣方式。

駐流模式需要進行延遲時間的校正，所謂的延遲時間就是樣品從UV檢測器到NMR流動池(探頭)的時間，當然延遲時間受到流動速率以及連接HPLC和NMR流動池的距離的影響。一旦色譜峰進入流動池，色譜即暫停工作，這種方式可以使用更少的樣品量，而且還能作2D-NMR實驗，如WET-COSY,WET-TOCSY以及其他，這種模式樣品可以在NMR探頭中停留幾天；短時間或色譜峰較少的情況下，可以得到一系列色譜峰的詳細信息，而不會發生色譜柱的擴散以及降低色譜的分辨率(要求在2小時內完成NMR實驗)。如果采用低溫探頭，還能進一步提供靈敏度。

R. Singh[10]使用LC-NMR應用駐流流動模式進行了下面的化合物在狗和老鼠的尿液代謝產物中的研究(圖3)。

他們所采用的實驗條件是梯度柱5～75% B，0～25min，75～95% B， 25～35min， A：D2O， B：ACN(乙腈)，1mL/min, 235nm, BDS Hypersil C18柱，15cm × 4.6cm, 5μm,即使使用非氘代的乙腈，也能得到較好的NMR峰。

圖4是狗的膽汁和狗的尿液的UV檢測色譜圖，M9保留時間為10min，M11保留時間為21min。M11代謝產物也可以在老鼠的尿中發現。為了利用NMR分析M9和M11的結構，采用駐流方式，加大注射量，M9的1H- NMR譜(Varian Inova500MHz，帶H-C梯度場反相探頭，流動池體積60ul)顯示1,2,4-三取代苯環存在。

圖5是利用溶劑抑制技術對目標化合物進行的核磁共振氫譜的測試，但由于溶劑抑制技術效果不理想，他們應用LC-NMR聯用技術進行的目標化合物的代謝產物實驗不是很成功。于是分別收集樣品，在Varian Unity 400MHz，3mm梯度反相探頭上用兩天的時間收集波譜信號得到NOE圖。

雖然收集的樣品中有很多雜質，但是能看到葡萄糖苷酸連接在C-4位，照射亞甲基，I峰從H-2和H-6得到NOE信號。對M11樣品進行LC-MS分析，只是1-(3-氯苯基)哌嗪，1H -NMR譜缺乏獨立的亞甲基峰，也說明該物質為1-(3-氯苯基)哌嗪(圖6)。

2003年，M.V. Silva Elipe[11]實驗室還利用LC-NMR研究了分子量較小的放射性的揮發性代謝物，利用 UV檢測器來標定代謝物，實驗證實較少的進樣量，UV檢測器即能分辨出代謝物。Wilson等[12]使用駐流操作方式進行了安替比林的藥物代謝研究。給自愿者服用1g 4-羥安替比林(antipyrine)后，收集其尿液冷凍干燥處理，然后用乙睛/水作流動相，以駐流的操作方式進行HPLC-NMR分析。

駐流操作方式和連續流方式相比，具有如下優點：首先使用駐流方式進行分析，可以長時間對樣品掃描，因此所得譜圖精度高，結構信息較充分；其次即使含量較少的組分也可以通過NMR累加掃描來得到結構信息，從而實現了系統較高的靈敏度，這是連續流操作方式所不能做到的；最后，使用駐流操作方式可作COSY、TOCSY等二維譜，得到大量通過一維譜不易獲得的結構信息。所以，駐流操作方式是目前應用最廣泛的HPLC-NMR操作方式。

2.7其他與NMR技術聯用的分離手段

其他色譜技術也在與NMR進行在線聯用，例如，尺寸排阻色譜(SEC)與NMR聯用方法來分析聚合物中的添加劑，固相萃取(SPE)與NMR聯用進行痕量分析，毛細管電泳與NMR聯用(CE-NMR)以及毛細管電泳色譜與NMR聯用(CEC-NMR)分析小樣品量的代謝物。CE-NMR和CEC-NMR采用小體積池帶毛細管分離的NMR探頭，取得了很大的進步，毛細管HPLC(capLC)與NMR聯用(capLC-NMR)采用了商業化的微量探頭，這樣分析的樣品量達到了納克的量級。采用該技術，色譜峰的體積與NMR探頭的流動池的體積相當，流動池的體積大約1.5μL，而且比常規的LC-NMR有更寬的溶劑梯度；capLC-NMR不需濃縮的純化合物，只需分析混合物的柱子，唯一的要求就是樣品必須溶解在5μL或更少的溶劑中。capLC的UV檢測器與NMR流動池之間的延遲時間必須校正，因為不同的色譜條件，不同的溶劑組成，溶液的粘度不同，會影響泵的效率。現在開發了一種多線圈的探頭，同時采集不同成分的NMR譜，至今為止，可以同時采集4種樣品，以后也許可以同時采集96個樣品，就像LC-MS一樣[5]。

2.8 LC-NMR應用

在天然產物領域，LC-NMR廣泛用于分析萃取物中的植物堿和海洋植物堿、類黃酮、倍半萜烯內酯、皂石、維生素E同系物以及抗菌成分；在藥物代謝物研究方面，LC-NMR廣泛由于代謝物、極性代謝物或不穩定代謝物的指認；最后，LC-NMR還可用于降解產物、藥物雜質以及藥物開發、食品分析等方面。

一般來說，在藥物和藥理分析中樣品的組成是非常復雜的，如果要得到樣品中組分的明確結構，必須先將各組分很好地分離開在作結構鑒定。HPLC-NMR能夠將分離和結構鑒定連為一體，大大簡化了分析過程。因此HPLC-NMR在藥物化學中得到了相當普遍的應用，并已經被證明是這一領域中最強有力的分析手段之一。Akira[13]利用HPLC-NMR研究了一種新型牛磺酸相關代謝物的代謝組學，Spraul[14]報道了使用HPLC-NMR進行藥物代謝研究：將服用了消炎藥布洛芬的實驗者的尿液冷凍干燥處理后，分別使用HPLC-NMR的連續流和駐流操作方法進行分析，并在駐流操作時使用了二維譜得到代謝產物的明確結構。后來又有人用同樣的方法作了動物尿液中布洛芬第二階段代謝產物的分析。從此HPLC-NMR在藥物化學特別是在藥物代謝中的應用得到了迅速的發展。

另外，已經有人開始把HPLC-NMR方法應用于質量控制。例如：Pasch等[15]用HPLC-NMR對低聚苯乙烯的構型規整度進行評估，還有用HPLC-NMR監測手性合成、控制產物比例[16]等。

3　展望

HPLC-NMR技術分析復雜樣品速度快且能得出明確的結構信息，已成為最強有力的分析手段之一。但這種分析手段目前還存在檢出限高，不能分析太大分子等特點，所以目前這一方面發表的論文數量不多。預計今后主要有三個發展方向：(1)提高NMR儀器的技術性能。這方面包括使用超高頻的NMR儀器(目前已經有900MHz譜儀投入使用)、改進NMR探頭和使用低溫液體冷卻前置放大器，從而大大提高儀器靈敏度，降低檢出限。(2)研究HPLC-NMR-MS技術。HPLC-MS技術自從電噴霧電離方法(Electrospray Ionization)的使用以來，已經成為一種比較成熟的和強有力的混合物分析手段。如果將MS甚至MS/MS與HPLC-NMR連接，則可能在一次色譜分析中同時得到MS和NMR的信息。國外的一些學者已經在這方面作了一些嘗試并取得了初步的成功。(3)研究CE-NMR技術。毛細管(CE)和HPLC不同之處在于使用外加壓力來達到分離目的。其分離效率要比HPLC高很多。目前CE-NMR聯用技術的主要困難在于CE進樣量比起NMR的檢出限小很多，只有樣品中組分濃度較高時才能體現其靈敏度高的特點。最近有人嘗試用CE-NMR分析納米級的樣品并取得了一定的成功。由于CE在分離性能上的優勢，隨著硬件技術的發展，CE-NMR很可能會成為一種非常重要的結構鑒定手段。

儀器聯用技術增強了化合物結構分析的能力，如今LC-NMR技術的發展使之拓展了復雜混合物的結構分析能力，但是LC-NMR由于其檢測靈敏度偏低，昂貴的氘代試劑、溶劑峰的抑制、色譜峰體積與NMR流動池之間的兼容性等方面的原因，因此是無法與LC-MS相提并論的；為了克服上述缺陷，開發capLC(毛細管液相色譜)-NMR聯用技術，減少溶劑量，色譜峰的體積也與NMR流動池體積兼容，將是LC-NMR聯用技術的發展方向。

至于采用哪一項聯用技術，具體情況具體分析，取決于問題的難度和本質，每一項技術均有它的優缺點，要了解它們的優缺點，便于我們作出準確的選擇。

[1]Lee M S , Kerns E H, Mass Spectrom Rev，1999，16：187.

[2] Clarke N J, Rindgen D, Korfmacher W A, Cox K A. Anal Chem,2001,73:430A.

[3] Lindon, John C , Nicholson, Jeremy K,Wilson,Ian D,Advances in chromatography, 1996, 36:315.

[4]寧永成. 有機化合物鑒定與有機波譜學.2版.北京：科學出版社，2000:38.

[5] Silva Elipe M V, Analytica Chimica Acta,2003, 497:25.

[6] Smallcombe S H, Patt S L, Keifer P A, Magn J. Res Ser A,1995,117:295-303.

[7] Klaus Albert. Journal of Chromatography A,1999,856:199-211.

[8]Sidelmann U G, Nicholls A W, Nicholson J K. Journal of chromatography. A, 1996, 728, (1/2):377.

[9]Godejohann M, Preiss A, Muegge C.Analytical chemistry, 1998,70(3):590-595.

[10]Singh R, Chen I W, Jin L, Silva M V, Arison B H, Lin J H, Wong B K, Drug Metabolism and Disposition, 2001, 29(12):1578-1587 .

[11] Elipe M V S, Huskey S-E W, Zhu B. J Pharm Biomed Anal, 2003,30(5):1431-1440.

[12]Wilson I D, Nicholson J K, Hofmann M. Journal of chromatography, 1993, 617(2):324.

[13] Akira K, Mitome H, Imachi M, Shida Y, Miyaoka H, Hashimoto T. J Pharm Biomed Anal, 2010,51(5):1091-1096.

[14]Spraul M, Hofmann M, Dvortsak P. J Pham Biomed Anal, 2013, 65: 981-989.

[15]Pasch H, Hiller W, Haner R. Polymer,2013, 39: 1515-1523.

[16]Pendela M, Béni S,Haghedooren E,Bossche L,Noszál B, Schepdael A, Hoogmartens J, Adams E. Anal Bioanal Chem, 2012 ,402(2):781-90.

Research progress of LC-NMR technology.

Wu Chunhong1,2

(1.YanshanBranchofBeijingResearchInstituteofchemicalindustry,SINOPEC,Beijing102500,China;2.NationalEngineeringResearchCenterforSynthesisofNovelRubberandPlastic,Beijing102500,China)

This article introduced the development process of LC-NMR including NMR sensitivity and solvent compatibility, solvent peak suppression, NMR probe design, operation modes. And the operation modes of continuous flow and stopped flow were compared.

LC-NMR; continuous flow; stopped flow

吳春紅，分析化學專業博士學位，高級工程師，研究方向是核磁共振波譜分析，E-mail:wuch.bjhy@sinopec.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.02.001

2015-09-06