正相高效液相色譜法測定L-蘋果酸中的對映異構體D-蘋果酸

段先哲　李　南*　譚凱旋　謝焱石　陳　亮　胡　楊　馮志剛　韓世禮　馬　強

(1. 南華大學，衡陽 421001; 2. 湖南省核燃料循環(huán)技術與裝備協(xié)同創(chuàng)新中心，衡陽 421001)

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正相高效液相色譜法測定L-蘋果酸中的對映異構體D-蘋果酸

段先哲1,2李南1,2*譚凱旋1謝焱石1陳亮1胡楊1馮志剛1韓世禮1馬強1

(1. 南華大學，衡陽 421001; 2. 湖南省核燃料循環(huán)技術與裝備協(xié)同創(chuàng)新中心，衡陽 421001)

建立了測定L-蘋果酸中對映異構體D-蘋果酸的的正相高效液相色譜檢測方法。色譜柱為手性色譜柱CHIRALPAK-IC(4.6×250mm；5μm)，流動相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1，流速為0.5mL/min，進樣量為100μL，檢測波長為210nm，柱溫為35℃。系統(tǒng)適用性實驗中L-蘋果酸和D-蘋果酸的理論塔板數(shù)大于5000，L-蘋果酸與相鄰峰的分離度為2.6，D-蘋果酸與相鄰峰的分離度為2.9。此方法檢測L-蘋果酸中的D-蘋果酸敏度高，分離度良好。溶液穩(wěn)定性實驗中，在24小時內(nèi)測定D-蘋果酸含量的相對標準偏差為5.78%，溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密度實驗中6次重復進樣D-蘋果酸含量的相對標準偏差為3.59%，精密度良好。L-蘋果酸的檢出限為0.22ng。該方法可用于分離L-蘋果酸及其對映異構體D-蘋果酸。

L-蘋果酸對映異構體D-蘋果酸正相高效液相色譜法

蘋果酸，又名2-羥基丁二酸，有兩種對映異構體，即D-蘋果酸和L-蘋果酸。大自然中，蘋果酸以3種形式存在，即D-蘋果酸、L-蘋果酸及其混合物DL-蘋果酸。L-蘋果酸會在人體中自然產(chǎn)生并具有生物活性，是人體一種必須的有機酸，作為性能優(yōu)異的食品添加劑和功能性食品廣泛應用于食品行業(yè)中；D-蘋果酸的生理活性低，生物體內(nèi)積累過量的 D-蘋果酸時會產(chǎn)生病變[1]；美國糧食和藥物管理局(FDA)規(guī)定DL-蘋果酸不能用于嬰兒食品添加劑[2]。在醫(yī)藥行業(yè)，蘋果酸常作為一種藥物成分添加在一些藥物制劑中，能明顯提高藥物主要成分的吸收率；蘋果酸還可以治療肝病、貧血、免疫力低下等多種疾病；在藥物研究中蘋果酸作為一種藥物成分，就必須嚴格控制其本身帶來的其它雜質(zhì)，必須嚴格控制D-蘋果酸的限度，所以對L-蘋果酸及其中的D-蘋果酸的測定方法的研究具有重大意義。目前國內(nèi)對蘋果酸含量測定的方法有酶法[2]、生物傳感器法[3]、雙波長分光光度法[4]、離子色譜法[5-8]、氣相色譜法[9，10]、毛細管電泳法[11，12]和高效液相色譜法[13-22]等方法。酶法雖操作簡易，但由于催化反應的酶本身特異性不高，易于催化其它底物，使測定結(jié)果產(chǎn)生較大誤差。生物傳感器法，需要制作兩種電極，并且需要分別測定D-蘋果酸和L-蘋果酸，操作比較繁瑣。其它方法對蘋果酸的測定都只是針對D-蘋果酸和L-蘋果酸混合物的含量測定，并不能有效區(qū)分這兩種異構體。而本研究通過采用手性色譜柱CHIRALPAK-IC和對分析方法的優(yōu)化所建立的正相高效液相色譜法，是一種分離并測定L-蘋果酸及其對映異構體D-蘋果酸的準確、靈敏、高效、便捷的方法。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

島津HPLC-2010C ；CPA225D型電子天平(賽多利斯)。

L-蘋果酸標準品(中國藥品生物制品檢定所)；DL-蘋果酸標準品(中國藥品生物制品檢定所)； L-蘋果酸原料(中照力德化工有限公司；含量：99.31%)。

1.2色譜條件

色譜柱CHIRALPAK-IC (4.6×250mm；5μm)；進樣量100μL ； 測定波長210nm ；柱溫：35oC；流動相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1；流速0.5mL/min。

1.3溶液的配制

稱取一定量的DL-蘋果酸標準品加流動相配制成濃度為1mg/mL的DL-蘋果酸溶液；稱取一定量的L-蘋果酸原料加流動相配制成濃度為1mg/mL的L-蘋果酸供試溶液；取L-蘋果酸供試溶液用流動相稀釋100倍，得到其1%自身對照溶液。D-蘋果酸含量按照1%自身對照計算，其計算公式為：D-蘋果酸含量(%)=A1/A2(注：A1為供試液中D-蘋果酸峰面積，A2為1%自身對照溶液中L-蘋果酸峰面積)。

2　結(jié)果與討論

2.1檢測波長的選擇

用紫外分光光度計對L-蘋果酸溶液和DL-蘋果酸溶液進行紫外全波長掃描，最大吸收波長為210nm，所以確定檢測波長為210nm。

2.2色譜條件的優(yōu)化

取上述DL-蘋果酸溶液按照上述色譜條件進行測定，對比了各條件下D-蘋果酸和L-蘋果酸的保留時間和分離情況，見表1。流速變化測定結(jié)果比較表明，流速越高，D-蘋果酸和L-蘋果酸保留時間越短，色譜柱壓力越大，在流速為1.0mL/min時色譜柱壓力為3.4MPa，其值較高，所以為了延長色譜柱的壽命，選擇流速為0.5mL/min。通過調(diào)整流動相三相的比例得知，異丙醇濃度越大，保留時間越短，D-蘋果酸與相鄰峰的分離度越小，當流動相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=90∶10∶0.1時，保留時間太長；當流動相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=70∶30∶0.1時，保留時間太短，D-蘋果酸和L-蘋果酸的出峰時間間隔太短，D-蘋果酸與相鄰峰的分離度為2.6；當流動相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1時，保留時間合適， D-蘋果酸峰無雜質(zhì)干擾，D-蘋果酸與相鄰峰的分離度為3.2，分離度良好；取L-蘋果酸供試液進行測定，進樣量50μL和100μL對比結(jié)果顯示，100μL時，D-蘋果酸峰高比較合適。所以最終確定的色譜條件：進樣量100uL， 測定波長210nm，柱溫35℃，流動相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1，流速0.5mL/min。

表1　色譜條件的優(yōu)化

2.3系統(tǒng)適用性實驗

取空白溶劑、L-蘋果酸供試溶液在上述色譜條件下進行測定，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，空白溶劑對樣品測定不產(chǎn)生干擾，L-蘋果酸的保留時間為11.90min，D-蘋果酸的保留時間為13.52min， L-蘋果酸與相鄰峰的分離度為2.6，D-蘋果酸與相鄰峰的分離度為2.9，理論塔板數(shù)大于5000，此方法檢測L-蘋果酸中的D-蘋果酸敏度高，分離度良好。

表2　方法的系統(tǒng)適用性實驗

2.4溶液穩(wěn)定性

配制1mg/mL L-蘋果酸供試溶液、1%自身對照溶液，按照上述色譜方法分別在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h進樣，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在24小時內(nèi)測定D-蘋果酸含量的相對標準偏差為5.78%，溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定。

表3　溶液穩(wěn)定性結(jié)果

注：A為峰面積

2.5精密度

配制1mg/mL L-蘋果酸供試溶液、1%自身對照溶液，按照上述色譜方法重復進樣6針，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，6次重復進樣D-蘋果酸含量的相對標準偏差為3.59%，精密度良好。

表4　精密度結(jié)果

注：A為峰面積

2.6方法的檢出限

配制1mg/mL的L-蘋果酸供試溶液，按照上述色譜方法，不斷的稀釋進樣，當信噪比S/N為3時，即為L-蘋果酸的檢出限，經(jīng)計算得出檢出限為0.22ng。

3　結(jié)論

本實驗建立了一種簡單有效的測定L-蘋果酸中的其對映異構體D-蘋果酸的檢測方法。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性實驗說明此方法檢測L-蘋果酸中的D-蘋果酸靈敏度高，分離度良好。溶液穩(wěn)定性實驗中，在24小時內(nèi)測定D-蘋果酸含量的相對標準偏差為5.78，溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密度實驗中6次重復進樣D-蘋果酸含量的相對標準偏差為3.59，精密度良好。L-蘋果酸的檢出限為0.22ng。該方法簡便、快速、有效、靈敏、具有良好的精密度，可作為L-蘋果酸中的對映異構體D-蘋果酸的定量分析方法。

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Determination of enantiomer D-malic acid in L-malic acid by normal-phase high performance liquid chromatography.

Duan Xianzhe1,2, Li Nan1, 2*, Tan Kaixuan1, Xie Yanshi1, Chen Liang1, Hu Yang1, Feng Zhigang1,Han Shili1, Ma Qiang1

(1.UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China; 2.CooperativeInnovationCenterforNuclearFuelCycleTechnologyandEquipment,Hengyang421001,China)

The chromatographic column was CHIRALPAK-IC ( 4.6×250mm；5um)；the mobie phase was N-hexane∶isopropyl alcohol∶trifluoroacetic acid (80:20:0.1), the flow rate was 0.5ml/min, the injection volume was 100μL, the detection wavelength was at 210 nm, and the column temperature was 35℃. In the suitability experiment, the theoretical plate number of L-malic and D-malic acids were more than 5000, the resolution between L-malic acid and its adjacent peak was 2.6, and the resolution between D-malic acid and its adjacent peak was 2.9, indicating that this method had a high sensitivity and good resolution. In the solution stability experiment, the relative standard deviation of D-malic acid concentration was 5.78% within 24 hours, demonstrating that the solution was stable within 24 hours. In the precision experiment, the relative standard deviation of the D-malic acid concentrations in six repeated sampling was 3.59%, showing a satisfactory precision of this method. The detection limit of L-malic acid was 0.22ng. This method could be used for quantitative determination of D-malic acid in the L-malic acid.

L-malic acid; enantiomer; D-malic acid; high performance liquid chromatography

國家自然科學基金(41503016)；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項目(15B201)；中國博士后科學基金(2015M582334)；南華大學博士啟動基金(2014XQD08)；國防基礎科研計劃項目(B3720110004)；南華大學“蒸湘學者計劃”。

段先哲，男，1985年出生，博士，主要從事地球化學、儀器分析等方面的研究工作。

李南，女，1985年出生，碩士，主要從事分析化學、儀器分析等方面的研究工作，E-mail：linan19851018@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.02.006