不隨意運動型腦性癱瘓血清代謝輪廓的特征分析①

陳俊臣，何　霞，段　宇，彭云川，張明偉

不隨意運動型腦性癱瘓血清代謝輪廓的特征分析①

陳俊臣1，2，何霞2，段宇2，彭云川2，張明偉1

目的利用代謝組學方法研究不隨意運動型腦癱患兒血清代謝的輪廓特征，分析其異常代謝通路。方法收集2014年5～8月本院門診診斷的10例6～12歲不隨意運動型腦癱患兒（患兒組）及7名正常兒童（對照組）的血清樣本，利用代謝組學方法，將所有血清樣本進行核磁共振掃描，所得到的核磁圖譜進行分段積分，利用偏最小二乘法模型對積分矩陣回歸分析，分離對照組，計算特征化學位移段。在代謝數據庫中查詢小分子代謝產物，分析不隨意運動型腦癱患兒代謝輪廓擾動差別。結果在偏最小二乘法模型中，15個重要變化化學位移段被確定，其中2.04 ppm、2.12 ppm、3.00 ppm、3.24 ppm、3.76 ppm、6.50 ppm信號值有顯著性差異（P＜0.05）。通過生物核磁數據庫發現谷氨酸、酮戊二酸、谷氨酰胺、亮氨酸、左旋丙氨酸水平升高；而牛磺酸、延胡索酸、草酰乙酸、丙酮酸、檸檬酸、天門冬氨酸、琥珀酸、蘋果酸、半胱氨酸水平下降。在代謝數據庫中進一步分析發現，不隨意運動型腦癱患兒血清中牛磺酸代謝通路、谷氨酸代謝通路和能量代謝通路波動異常。結論基于代謝組學偏最小二乘法模型能成功區分不隨意運動型腦癱代謝輪廓，該實驗發現異常波動的代謝產物及代謝通路可成為進一步研究的重點。

腦性癱瘓；不隨意運動型；代謝組學；核磁共振波譜；偏最小二乘法

作者單位：1.四川醫科大學中西醫結合學院（附屬中醫醫院神經外科），四川瀘州市646000；2.四川省康復醫院，四川成都市611135。作者簡介：陳俊臣（1982-），男，漢族，四川儀隴縣人，主治醫師，主要研究方向：小兒腦性癱瘓，顱腦創傷。通訊作者：張明偉（1973-），男，漢族，四川簡陽市人，主任醫師，副教授，碩士研究生導師，主要研究方向：小兒腦性癱瘓，顱腦外傷創傷的基礎與臨床。E-mail：drcc82@163.com。

［本文著錄格式］陳俊臣，何霞，段宇，等.不隨意運動型腦性癱瘓血清代謝輪廓的特征分析［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（4）：448-454.

CITED AS：Chen JC，He X，Duan Y，et al.Metabolic profile of dyskinetic cerebral palsy based on metabonomics［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（4）：448-454.

腦癱是由發育不成熟的大腦（產前、產時或產后）先天性發育缺陷（畸形、宮內感染）或獲得性（早產、低出生體重、窒息、缺氧缺血性腦病、核黃疸、外傷、感染）等非進行性腦損傷所致［1］。腦癱是兒童時期最常見致殘因素，給個人帶來巨大生理及心理痛苦，也給家庭和整個社會造成巨大的負擔［2］。不隨意運動作為腦癱的一種亞型，約占整個腦癱患者的17%，主要包括舞蹈性手足徐動和肌張力障礙；該型最明顯特征是非對稱性姿勢，頭部和四肢出現不隨意運動，目前并沒有十分有效的治療方式［1，3］。研究發現，有相當一部分患兒是由于本身攜帶致病基因或其他代謝因素失調，因診斷不明而歸為腦癱［4］。例如，多巴胺反應型肌張力障礙，常與不隨意運動型腦癱表現相似，因為自身基因缺陷導致體內多巴胺代謝障礙，小劑量多巴胺制劑對其治療效果良好［5］；精氨酸血癥，為體內精氨酸代謝障礙，在體內堆積，是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，常導致兒童期的痙攣性癱瘓［6］；葡萄糖轉運體-1缺乏綜合征也可導致小兒難治性癲癇、發育遲緩、復雜性運動障礙［7］。腦癱是一組典型征候群，常出現誤診誤治，其內部代謝也可能出現特征性變化。

代謝組學是通過考察生物體系內小分子代謝產物圖譜及其隨時間動態變化特點的學科，與基因組學、轉錄組學和蛋白質組學共同構成了系統生物學的研究體系。現已廣泛應用于包括疾病的診斷、藥理學、病理生理學、營養學、環境科學和材料學等重要領域［8］。常用的檢測手段包括核磁共振（nuclear magnetic resonance）、質譜和色譜分析等，其檢測的生物體液波譜具有高通量特征，包含上千種小分子物質信息。對不同特點的波譜，需要建立數學模型分析，其中非監督性模式識別中的主成分分析（principal component analysis，PCA）和監督性模式識別中的偏最小二乘法-判別分析（partial leastsquares discriminant analysis，PLS-DA）是最常用的分析方法［9］。

目前基于核磁共振的代謝組學技術，在許多兒科疾病的發病機制研究中發揮重要作用，如孤獨癥［10］、Ⅰ型糖尿病［11］、哮喘［12］及中樞性腫瘤［13］等已有運用。雖然也有文章提示代謝組學作為一種新的研究方法在肌張力障礙疾病中研究的可行性，但并沒有提出具體的代謝擾動途徑［14］。

本研究利用代謝組學技術對不隨意運動型腦癱與正常兒童的血清進行核磁共振波譜分析，希望從中發現有關該型患兒的異常代謝狀態關鍵點，為進一步研究提供可靠線索。

1　資料與方法

1.1一般資料

2014年5～8月，四川省康復醫院功能神經外科門診，經副主任醫師以上的專家確診的不隨意運動型腦癱患兒納入研究。

診斷標準［1］：①中樞性運動障礙持續存在；②運動和姿勢發育異常；③以錐體外系受損為主，不隨意運動增多的臨床表現；④反射異常；⑤肌力、肌張力異常。

納入標準：①年齡6～12歲；②有明確的圍產期及發育期的腦損傷病史；③粗大運動功能分級Ⅰ～Ⅲ級；④頭部MRI腦損傷表現為陳舊、靜止性；⑤6個月內未服用任何藥物。

排除標準：①原發性或進行性運動障礙病；②其他嚴重的并發癥，如癲癇、智力障礙、行為異常等；③伴有牽張反射亢進、病理反射陽性的臨床表現；④其他發育遲緩疾病。

對照組為相仿年齡段健康兒童。實驗實施前，每名兒童監護人被告知實驗目的和相關方案，并征得同意。實驗計劃經四川省康復醫院倫理委員會批準。

納入實驗兒童均記錄性別、年齡、身高、體質量并計算體質量指數（body mass index，BMI）。

采用SPSS 19.0進行分析。利用獨立樣本t檢驗對患兒組及對照組年齡、身高、體質量及BMI進行分析。

1.2樣本采集和制備

所有入選對象于清晨6時，空腹8 h后，采集靜脈血4 ml。采血前1 d按日常生活飲食活動，禁止高脂高蛋白飲食及劇烈活動或康復訓練。血液樣本在室溫下自然凝固1 h，采集上層血清，置-70℃超低溫冰箱備用。

1.3樣本檢測

在四川大學分析測試中心核磁共振實驗室進行檢測。血清樣本編號加入重水后置于核磁管中，放于600 MHz核磁儀中進行檢查。實驗參數：譜寬8000 Hz，采樣點數32 K，采樣時間2 s，累加次數64次，t為400 ms，2 nt為320 ms，弛豫延遲為2 s，其間采用低功率脈沖對水峰進行預飽和。以甲乳酸基雙峰信號的左側峰定義為d1.33，然后調整相位并進行基線校正。后將所有樣本的自由感應衰減信號導入核磁解析MESTREC（version 4.4.0）軟件，進行傅立葉轉換后，獲得氫核核磁共振波譜（1H-NMR）。將0.00～8.00 ppm范圍內的化學位移在MESTREC按照0.04 ppm進行分段積分，得到200個波譜強度值。為了減少系統誤差，在進行模式識別分析前對分割后的目標積分段值進行加合和歸一化處理。所得數據輸出并轉換到Excel文件。

1.4多元統計分析

將a名患兒和b名正常兒童的核磁波譜信號分段積分，得到矩陣A和矩陣B。行代表每個納入實驗兒童，列代表200個化學位移段積分后的信號強度值。A代表不隨意運動腦癱患兒組，B代表正常兒童組，用于模式識別分析。

本實驗首先將A矩陣和B矩陣無差別地在Matlab平臺中進行主成分分析，其作為無監督判別模式，并沒有將兩組樣本有效區分。

再對A矩陣和B矩陣在Matlab偏最小二乘法平臺中中提前分組（監督模式），進行PLA-DA判別。

目的一：建立PLS-DA模型，并了解模型是否具有可重復性和可預測性。目的二：如果模型穩定，設定模型重要變量參數（variable important parameter，VIP）值為1.70，計算出在模型中影響A、B矩陣分離最大的化學位移段。在SPSS下，通過配對樣本的t檢驗驗證VIP化學位移段信號值是否具有統計學意義（α=0.05）。

1.5代謝產物的確定

特定的化學位移段是不同分子或化學結構在磁場中不同的衰減變化信號，通過代謝數據庫（http：//www. hmdb.ca/）推測代謝產物。

人體內的代謝產物之間的相互作用關系、基因調控和酶作用變化，可以通過查閱KEGG代謝通路數據庫（KEGG Pathway Database），進一步分析得出。

2　結果

2.1納入對象

經嚴格篩選，10例不隨意運動型腦癱患兒納入本實驗，其中男性6例，女性4例，年齡6～12歲，平均8.9歲。病因包括產時缺氧、黃疸、高熱驚厥和腦出血，頭顱MRI檢查，除10號患兒外，均有異常表現（表1）。10例患兒均有不隨意運動表現，但查體均無病理征或反射亢進；患兒都有不同程度的語言障礙（表2），但均能聽懂指令，無明顯智力障礙和行為異常。

對照組7名健康兒童，年齡6～11歲，平均8.9歲。年齡與患兒組無顯著性差異（P＞0.05）。

不隨意運動型腦癱患兒身高、體質量均落后于正常兒童，但無顯著性差異（P＞0.05）。患兒大多身體瘦小，BMI小于對照組（P＜0.05），見表3。

2.2多變量分析

血清的核磁波譜信分段積分后數值導入到Matlab偏最小二乘法判別工作平臺，PLS-DA模型成功建立后，通過得分圖可以觀察到患兒組和對照組代表散點在第一主成分（t1）和第二主成分（t2）區分情況（圖1）。模型的參數R2表示模型的解釋率，Q2表示模型的預測率。該模型R2=0.832，Q2=-0.184，說明該模型算法有較高的可重復性和預測性。

在軟件中將VIP值標準調整到1.70，篩選特征化學位移段（單位：ppm）。0～1.00 ppm化學位移段1個：0.96；2.02～3.00 ppm段9個：2.04、2.12、2.16、2.36、2.40、2.48、2.52、2.80、3.00；3.02～4.00 ppm段3個：3.24、3.76、3.92；4.00～6.00 ppm段2個：4.28、6.50。通過獨立樣本t檢驗，確定6個有統計學意義的信號化學位移段：2.04 ppm、2.12 ppm、3.00 ppm、3.24 ppm、3.76 ppm、6.50 ppm。通過人類代謝數據庫（http：//www.hmdb.ca/），設置在上述特征位移段±0.02 ppm查詢代謝產物，發現14種最能反映與對照組區別的小分子代謝產物（表4）。

2.3代謝特征分析

通過查閱KEGG代謝通路數據庫，進一步分析以上小分子物質所位于的代謝路徑。課題組進行最后分析，確定了不隨意運動型腦癱患兒的異常特征代謝，表明在腦癱患兒中牛磺酸代謝通路、三羧酸循環活動下降，而谷氨酸代謝通路上升。見圖2。

表1　不隨意運動型腦癱患兒性別、年齡、病因及MRI

表2　患兒步態及語言基本臨床表現

表3　兩組一般資料比較

圖1　偏最小二乘法模型得分圖

表4　根據VIP值及代謝數據庫確定相關性高的小分子物質

圖2　不隨意運動型腦癱代謝異常擾動圖

3　討論

在以往眾多研究中，都有證據表明腦癱患兒與正常兒童機體代謝有著顯著差異。腦癱患兒常生長發育遲緩，在粗大運動功能分級重度到極重度的患兒中，發現骨密度較正常兒童明顯降低［15］；另外，肌纖維和Ⅰ型膠原蛋白會在腦癱患兒肌細胞內過量堆積，也造成肌細胞的不可逆損害和粗大運動功能的提升受限［16］；除了在運動系統和神經系統，腦癱患兒在呼吸系統、消化系統等也存在不同程度的缺陷［17］。本實驗納入的不隨意運動型腦癱患兒BMI低于對照組，說明患兒在腦癱致病條件下，全身骨骼肌肉不自主收縮，加重消耗，也可對消化功能及生長發育產生一定影響。更加說明作為臨床醫生及康復醫生，應將患兒作為一個整體，全面看待其身體功能轉歸及代謝變化。雖然國內也曾有報道對類似的運動障礙、肌張力障礙疾病的代謝組學研究，但還沒有針對不隨意運動型腦癱患兒的報道，也沒有較明確的代謝網絡異常通道比較分析［14］。

本研究發現，牛磺酸、谷氨酰胺和能量代謝通路擾動異常在患兒體內有意義，其中牛磺酸代謝通路擾動明顯。人體內含有大量牛磺酸。它不僅僅是作為一種必需能量物質，參與機體的生長代謝，而且還能夠參與維持機體的免疫功能，調節全身多系統正常工作。已有研究發現牛磺酸通路代謝異常與許多運動障礙性疾病有關。有研究表明，在舞蹈病大鼠中，腦組織中多個區域的牛磺酸含量下降［18］，給予牛磺酸治療后，相關酶活性上調，患病大鼠的運動能力明顯提高［19］。在帕金森病患者腦脊液中，牛磺酸含量降低，給予立體定向高頻電刺激手術后，在運動能力改善的患者中發現，殼核和尾狀核中牛磺酸含量較術前升高［20］。一系列研究顯示，牛磺酸通過減弱氧化反應途徑，抵抗凋亡，穩定細胞膜通透性，來保護線粒體和內質網［21］。本實驗發現的牛磺酸代謝異常，如果在不隨意運動型腦癱患兒中具有普遍性，干預牛磺酸代謝有可能成為治療腦癱的新方向。

谷氨酰胺含量升高及其代謝通路異常，是本實驗另一發現。在缺血缺氧體外模型中，隨著損傷的加重，谷氨酰胺也釋放增多［22］。谷氨酸酰胺的興奮性毒性也被證明與許多神經退化性疾病相關。例如在多發性硬化患者中，過度的谷氨酰胺釋放，導致其離子型和代謝型受體活性升高，加速細胞漿內的Ca2+堆積而后加速細胞凋亡［23］。谷氨酰胺代謝通路在不隨意運動型腦癱患兒中上升也進一步印證其作為興奮性毒性產物對患兒的損害。

在本研究中，患兒血清三羧酸能量循環減弱也是另一重要發現。三羧酸循環不僅是人體內能量代謝的中心，也是糖、蛋白質、脂類三大物質代謝的樞紐。在本研究中發現檸檬酸、延胡索酸、丁酮二酸等循環網絡中重要物質含量下降，一方面可能與腦癱患兒產生能量物質能力下降或循環路徑不暢有關；另一方面也可能是由于患兒消耗增加所致。三羧酸代謝異常也會導致一系列運動障礙疾病。延胡索酸缺乏癥是一種在胎兒期極其少見的常染色體隱性遺傳病，可導致不隨意運動、癲癇等［24］。而通過口服二甲基延胡索酸，可以作為治療多發性硬化的方法之一［25］。

雖然納入患兒都應被歸為不隨意運動型腦癱，但病因包括出生后黃疸、產時缺氧、產后腦出血和高熱驚厥，且腦損傷部位、臨床表現并不完全相同。本研究樣本量偏少，組內患兒身體狀態、腦損傷程度、臨床表現等具有一定差異。今后的工作將繼續收集相關的病例資料，分析相關影響因素，利用代謝組學方法，結合其他分子學方法，定量分析本研究得出的通路上擾動代謝產物上下游關系。

綜上所述，本實驗利用代謝組學方法研究不隨意運動型腦癱患兒內環境，發現包括牛磺酸代謝通路、谷氨酰胺代謝通路及能量代謝通路異常，為病理生理機制研究打下基礎。

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Metabolic Profile of Dyskinetic Cerebral Palsy Based on Metabonomics

CHEN Jun-chen1，2，HE Xia2，DUAN Yu2，PENG Yun-chuan2，ZHANG Ming-wei1
1.Sichuan Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China；2.Sichuan Rehabilitation Hospital，Chengdu，Sichuan 611135，China
Correspondence to ZHANG Ming-wei.E-mail：drcc82@163.com

Objective To analyze the metabolic profile of children with dyskinetic cerebral palsy by metabolomics，and its abnormal metabolic pathway.Methods The serum of 10 children with dyskinetic cerebral palsy（patient group）and 7 healthy children（control group）aged 6 to 12 years were collected at clinic from May to August，2014.The serum samples were tested by the nuclear magnetic resonance spectrometer and the spectroscopies were discriminated by partial least squares-discriminant analysis.According to the human metabolome database，the final metabolites disturbed would be figured out.Results 15 chemical shifts were defined，and 6 of them，including 2.04 ppm，2.12 ppm，3.00 ppm，3.24 ppm，3.76 ppm，6.50 ppm，were significantly different between 2 groups（P＜0.05）.The KEGG Pathway Database showed that the levels of taurine，fumarate，oxaloacete，pyruvate，citrate，aspartate，succinate，malate，cysteine decreased，and the levels of glutamate，2-oxoglutarate，glutamine，leucine，alanine increased.The abnormal metabolism was found in taurine metabolism，glutamine metabolism and energy metabolism pathways.Conclusion Based on metabolomics，the metabolic profile of children with dyskinetic cerebral palsy was discriminated out successfully.The further research can focus on the small molecules found out.

cerebral palsy；dyskinetia；metabolomics；nuclear magnetic resonance spectroscopy；partial least square discriminant analysis

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.016

R742.3

A

1006-9771（2016）04-0448-07

（2015-09-27

2015-10-28）