迷走神經電刺激對腦外傷昏迷大鼠前額葉皮質5-羥色胺2A受體表達的影響①

董曉陽，馮　珍

迷走神經電刺激對腦外傷昏迷大鼠前額葉皮質5-羥色胺2A受體表達的影響①

董曉陽，馮珍

目的探討迷走神經電刺激對腦外傷昏迷大鼠促醒作用及對前額葉皮質5-HT2A受體表達的影響。方法將72只Sprague-Dawley大鼠隨機分為空白對照組、假刺激組、刺激組和拮抗劑組，每組18只。應用自由落體撞擊法建立腦外傷昏迷模型。拮抗劑組注入OXR1受體拮抗劑SB334867，采用迷走神經電刺激治療刺激組和拮抗劑組。觀察其行為學變化，并用免疫組織化學技術檢測各組大鼠前額葉皮質5-HT2A受體表達的影響。結果刺激組12只蘇醒，拮抗劑組9只蘇醒，假刺激組4只蘇醒。5-HT2A受體含量從低到高依次為：空白對照組、拮抗劑組、假刺激組、刺激組（χ2=11.464，P=0.009）。結論迷走神經電刺激可提高腦外傷昏迷大鼠意識狀態，其機制可能與上調5-HT2A受體有關。

腦外傷；昏迷；迷走神經電刺激；5-羥色胺2A受體；食欲素A；大鼠

［本文著錄格式］董曉陽，馮珍.迷走神經電刺激對腦外傷昏迷大鼠前額葉皮質5-羥色胺2A受體表達的影響［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（4）：404-408.

CITED AS：Dong XY，Feng Z.Effect of vagus nerve stimulation on expression of 5-hydroxytryptamine 2A receptor in prefrontal cortex of coma rats with traumatic brain injury［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（4）：404-408.

專家預測，腦外傷在2020年將成為全球第三大疾病負擔［1］。隨著腦外傷救治技術的進步，腦外傷患者的死亡率有明顯下降，但是仍有高達14%的腦外傷患者經搶救后處于長期昏迷或植物狀態，從而降低了患者和家庭的生活質量，增大了醫療費的支出壓力［2］。昏迷促醒的治療一直以來是臨床上的重點和難點，目前治療腦外傷后昏迷的方法有藥物治療、高壓氧治療、音樂療法、中醫中藥及針灸治療、電刺激治療等［3］。電刺激治療主要包括深部腦刺激（deep brain stimulation，DBS）、頸部脊髓硬膜外刺激（cervical spinal cord stimulation，cSCS）、正中神經電刺激（median nerve electrical stimulation，MNES）、迷走神經電刺激（vagus nerve electrical stimulation，VNS）等。5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是一種興奮性神經遞質，5-HT2A受體（5-HT2AR）主要與睡眠覺醒相關，本次研究旨在探討VNS對腦外傷昏迷大鼠的促醒效果及對5-HT2AR變化的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物、材料及儀器

成年Sprague-Dawley大鼠72只，體質量250～300 g，普通級，由南昌大學醫學部動科部提供，適應環境飼養1周后開始實驗?？?-HT2AR（BA2048）：武漢博士德有限公司。

抗β-actin單克隆抗體（CW0096）、組織蛋白抽提試劑盒（CWB10）：北京康為世紀生物科技有限公司。食欲素1受體拮抗劑（SB334867）：美國Tocris bioscience公司。ZS-BS數顯腦立體定位儀：北京眾實迪創科技發展有限公司）。電刺激儀（ES-420）：日本伊藤超短波株式會社。切片機（RM2015）：LEICA。

1.2模型建立及分組

本實驗應用經典“自由落體撞擊法”來構建動物模型。乙醚吸入性麻醉，麻醉起效后暴露顱骨頂部，于左側中線旁2 mm、冠狀縫前1 mm用注射器針頭在顱骨表面“十”字標記打擊點。根據體質量不同，400 g圓柱形撞擊錘從38～42 cm高度沿垂直金屬桿自由下落，撞擊左側顱骨表面打擊點上的薄鋁墊片，致使顱骨凹陷性骨折，消毒后縫合皮膚，放回籠中。1 h后根據大鼠的感覺、運動功能，將大鼠意識狀態分6級：Ⅰ級，在籠內活動如常；Ⅱ級，在籠內活動減少；Ⅲ級，在籠內活動減少并運動失調；Ⅳ級，當背部放在籠的底部時能滾動（翻正反射存在）但不能站立；Ⅴ級，翻正反射消失但對疼痛刺激有肢體回縮反應；Ⅵ級，對任何刺激無反應。Ⅴ級、Ⅵ級納入實驗［4］。

將72只大鼠隨機分為空白對照組（普通健康大鼠）、假刺激組（腦外傷昏迷大鼠）、刺激組（腦外傷昏迷+VNS），拮抗劑組（腦外傷昏迷+OXR1受體拮抗劑SB334867+VNS），每組18只。在造模過程中有10只大鼠死亡，再次挑選新的大鼠進行補充。

1.3側腦室注射食欲素1受體受體拮抗劑

腹腔注射10%水合氯醛0.3 ml/100 g麻醉腦外傷后大鼠，待麻醉起效后，對大鼠頭頂部消毒，暴露顱骨，將大鼠頭部及四肢俯臥位固定于腦立體定位儀上，于前囟后約1.0 mm、正中線旁開1.5 mm標記基點后，用顱骨鉆在標記基點鉆孔，用微量進樣器吸入SB3348675 μl（10 mg/kg粉末溶解于60∶40 DMSO），垂直注入顱骨表面下4.5 mm。微量泵參數：速度2.50 μl/min，時間2 min，啟動微量泵，注射完畢后留針2～3 min退針。縫合頭皮，消毒，放置于加熱墊上，觀察反應，1 h后繼續給予VNS。

1.4 VNS

刺激組和拮抗劑組需要進行VNS。將大鼠置入無菌環境下，手術前用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，硫酸慶大霉素0.1 ml/100 g肌肉注射預防感染。待麻醉起效后固定于手術臺，左側頸部消毒，靠近頸部正中線切開皮膚，鈍性分離皮下脂肪、唾液腺、肌肉（胸骨舌骨肌和胸鎖乳突肌），切開頸動脈鞘（迷走神經和頸動脈），分離左側迷走神經5 mm。將特制刺激電極包繞迷走神經，通過靈敏電流表檢測電極是否與迷走神經接觸良好，檢測接觸良好后給予電刺激。刺激之后取出電極，縫合手術切口，將大鼠放置于溫床30 min，然后放回籠中。VNS治療參數［5］：頻率30 Hz，脈寬0.5 ms，電流1.0 mA，刺激總時間為15 min。刺激結束后1 h，再次評估意識狀態等級評分，實驗完畢后放回籠中。假刺激組則按刺激組同樣操作，但無電流輸出。

1.5免疫組化染色

在實驗結束后1 h，再次評定大鼠意識狀態。實驗完成后的6 h、12 h、24 h，腹腔注射10%水合氯醛0.1 g/ml深度麻醉后，向心臟灌注4%多聚甲醛至全身僵硬，斷頭取腦，4%水合氯醛固定12 h，并在20% PBS中冷凍保存。按此方法每組每個時間點均處死6只。腦組織冠狀切片，片厚4 μm，PBS漂洗后0.3%的H2O2處理30 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育1 h，滴加稀釋的兔抗5-HT2AR抗體（1∶400），4℃過夜，PBS漂洗后再滴加生物素標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。由兩位有經驗的病理實驗師觀察免疫組化結果，最后計算出免疫組化得分（immunohistochemical score，IHS）。

1.6統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。不同組別和時間點的5-HT2AR含量以秩均值表示，作Kruskal-Wallis H秩和檢驗。顯著性水平α=0.05。

2　結果

2.1行為學評估

治療后1 h，刺激組中，12只大鼠蘇醒（Ⅲ級8只，Ⅳ級4只）；6只仍昏迷（Ⅴ級4只，Ⅵ級2只）。拮抗劑組中，9只蘇醒（Ⅲ級4只，Ⅳ級5只）；9只昏迷（Ⅴ級4只，Ⅵ級5只）。假刺激組中，4只蘇醒（Ⅲ級2只，Ⅳ級2只）；14只昏迷（Ⅴ級8只，Ⅵ級6只）。治療之后大鼠蘇醒的數量（Ⅴ～Ⅵ級）順序為：假刺激組＜拮抗劑組＜刺激組＜空白對照組。

2.2免疫組化檢測

5-HT2AR分布于前額葉皮層神經元的胞漿和胞膜中。見圖1。

組間比較4組5-HT2AR的表達水平呈有非常顯著性差異（P＜0.05），空白對照組＜拮抗劑組＜假刺激組＜刺激組。見表1。

3個時間點的5-HT2AR的表達水平無顯著性差異（P＞0.05）。見表2。

表1　不同組別5-HT2AR表達（秩均值）

表2　不同時間點5-HT2AR表達

3　討論

VNS已廣泛應用于難治性癲癇和持續性、復發性抑郁及認知功能障礙等［6］。近年來，研究表明VNS可減少腦外傷后癲癇患者白天嗜睡時間和快動眼睡眠周期（rapid eye movement，REM），延長覺醒時間，但其機制尚不完全明晰［7］。目前認為VNS延長覺醒時間的可能作用機制如下。

①迷走神經廣泛的纖維投射。80%迷走神經傳入纖維止于孤束核（nucleus of the solitary tract，NTS），小部分止于三叉神經脊束核、網狀結構和疑核等，傳入神經可直接投射到大腦皮層和間接通過NTS到達網狀上行激活系統（ascending reticular activating system，ARAS）［8］。ARAS是激活和維持覺醒的重要組成部分，電刺激迷走神經可提高ARAS信號輸入，進而可能達到促醒作用。

②影響腦電活動。VNS可提高REM之前的慢波睡眠（slow-wave sleep，SWS）并能夠增加REM的頻率，此外，睡眠梭狀波及δ波普顯著增加［9］。

③抗炎效應。迷走神經介導的抗炎效益主要是通過膽堿能抗炎通路實現，抑制炎癥細胞因子釋放避免神經細胞的第二次損傷［10］。

④改善腦部血流量。VNS可提高丘腦、下丘腦、前額葉皮層、網狀結構等與覺醒密切相關腦區的腦血流量，腦血流量的增加對細胞存活，促醒神經功能的恢復具有重要的意義［11］。

⑤增加神經營養因子的表達和增強突觸可塑性。神經營養因子在調節神經元存活、生長、功能及可塑性中扮演著重要的作用。VNS可促進腦源性神經生長因子和神經生長因子在海馬區、大腦皮層及前額葉區域中的表達［12］。

⑥影響腦內相關神經遞質的改變。研究表明VNS可提高下丘腦和前額葉皮層細胞內去甲腎上腺素水平、中縫背核的5-HT、前額葉和伏核的多巴胺水平等［13-14］。

⑦其他機制，包括VNS可促進內源性神經干細胞的增長、影響細胞去極化活動水平、降低顱內壓、減少梗死面積、減輕大腦水腫程度及降低血腦屏障的損傷等［15］。

因此，VNS有望成為腦外傷昏迷促醒的有效方法。本次研究旨在探討VNS昏迷促醒效果和對前額葉5-HT2AR表達變化的影響。

5-HT又稱為血清素（serotonin），存在于機體多種組織，神經系統中的5-HT主要參與機體對攝食、性行為、神經內分泌、疼痛感知、學習記憶和情緒、睡眠-覺醒等生理過程的調控［16］。5-HT有7個受體亞型，其中5-HT2AR在腦內分布廣泛，特別是高密度分布于前額葉皮層，與覺醒的調節密切相關。

圖1　前額葉各組各時間點5-HT2AR表達（免疫組化染色，400×）

Yuen等發現5-HT可抑制鉀離子通道，增加突觸前谷氨酸的釋放，進而激活5-HT2AR興奮前額葉皮層神經元［17］。Monti等研究證明，向老鼠體內注入非選擇性5-HT2AR拮抗劑可減少非快速動眼睡眠和快速動眼睡眠，增加覺醒［18］。隨后，Yoshida等在鼠胚胎皮層神經元中發現5-HT2A/2C激動劑可促進樹突棘的形成與成熟［19］；在體外，Ohtani等也證明，在老鼠皮層神經元內，5-HT2AR可調節樹突棘的形態變化［20］。因此，5-HT2AR在促覺醒和神經元發育方面扮演著重要的角色。

本研究發現各組蘇醒大鼠數量呈假刺激組、拮抗劑組、刺激組、空白組依次遞增，表明VNS具有意識改善的效果。此外，通過免疫組織化學技術檢測發現5-HT2AR含量呈空白組、拮抗劑組、假刺激組、刺激組依次遞增，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。刺激組明顯高于假刺激組，表明VNS可上調5-HT2AR表達；假刺激組高于空白組，可能是由于腦外傷后應激保護作用引起5-HT2AR高表達。我們前期研究發現，VNS可上調食欲素A和食欲素1受體表達進而促進覺醒且食欲素A扮演著關鍵性作用，但食欲素A是否影響5-HT2AR表達尚不明晰，本實驗通過側腦室注射食欲素1受體拮抗劑SB334867進而給予VNS，發現拮抗劑組大鼠蘇醒的數量和前額葉5-HT2AR表達含量均低于刺激組，進一步表明食欲素A能夠影響VNS促進覺醒的效果，其機制之一可能與調節5-HT2AR水平有關，但具體的分子機制有待進一步研究。組內比較發現，6 h、12 h、24 h 3組5-HT2AR含量無明顯差異，可能是由于VNS作用于機體的反應期有關。

綜上所述，VNS對腦外傷昏迷大鼠具有促進意識恢復的效果，其作用機制可能與5-HT2AR的高表達有關，且在這一過程中食欲素A參與調節。但VNS促昏迷覺醒的效果尚無直接報道，需要進一步研究證實。

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Effect of Vagus Nerve Stimulation on Expression of 5-hydroxytryptamine 2A Receptor in Prefrontal Cortex of Coma Rats with Traumatic Brain Injury

DONG Xiao-yang，FENG Zhen
Department of Rehabilitation Medicine，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330006，China
Correspondence to FENG Zhen.E-mail：fengzhenly@sina.com

Objective To explore the effect of vagus nerve stimualtion on wake-promoting and the expression of 5-hydroxytryptamine（5-HT）2A receptor in the prefrontal contex of coma rats with traumatic brain injury.Methods 72 Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group，sham-stimulated group，stimulated group and antagonist group with 18 rats in each group.Traumatic brain injury model was established by a weight-drop head injury.The antagonist group was injected with SB334867，and both the antagonist group and the stimulated group received vagus nerve stimulation.Their behaviors were recorded.And immunohistochemistry technique was used to detect the expression of 5-HT2Areceptor in the prefrontal cortex.Results 12 rats in the stimulated group，9 in the antagonist group and 4 in the sham-stimulated woke up.The expression of 5-HT2Areceptor from low to high was ranged as the control group，the antagonist group，the sham-stimulated group and the stimulated group（χ2=11.464，P=0.009）.Conclusion Vagus nerve stimulation could raise consciousness in coma rats after traumatic brain injury，which may be related to up-regulating the expression of 5-HT2Areceptor.

traumatic brain injury；coma；vagus nerve stumulation；5-hydroxytryptamine 2Areceptor；orexin-A；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.007

R651.1

A

1006-9771（2016）04-0404-05

1.國家自然科學基金項目（No.81260295）；2.江西省研究生創新基金（No.YC2015-S090）。

南昌大學第一附屬醫院康復醫學科，江西南昌市330006。作者簡介：董曉陽（1991-），男，江西九江市人，碩士研究生，主要研究方向：神經康復。通訊作者：馮珍，女，江西南昌市人，教授，主任醫師，主要研究方向：神經康復。E-mail：fengzhenly@sina.com。

（2015-12-15

2016-01-18）