丁苯酞對1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導細胞自噬的影響①

賈玉鳳，吳慶文，程月發，陳　娟，孟　奇

丁苯酞對1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導細胞自噬的影響①

賈玉鳳1，吳慶文1，程月發2，陳娟1，孟奇3

目的研究丁苯酞對1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）誘導的SH-SY5Y細胞自噬相關因子的影響，探討丁苯酞對帕金森病細胞模型的神經保護作用機制。方法將SH-SY5Y細胞分為空白對照組（A組）、MPP+組（B組）、雷帕霉素預處理+MPP+組（C組）和丁苯酞預處理+MPP+組（D組）。采用噻唑藍（MTT）比色法測定細胞相對存活率，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態的變化，Western blotting檢測微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白表達，RT-PCR檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1 mRNA表達。結果B組SH-SY5Y細胞存活率顯著低于A組（t=20.270，P＜0.001），C組和D組顯著高于B組（t＞8.770，P＜0.001），且C組和D組間無顯著性差異（t=2.270，P=0.064）。與A組相比，B組LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白和mRNA表達明顯增加（t＞6.647，P＜0.01）；C組和D組明顯高于B組（t＞3.630，P＜0.01），C組與D組間無顯著性差異（t＜2.238，P≥0.05）。結論丁苯酞可以提高MPP+誘導的SH-SY5Y損傷細胞存活率，其可能通過誘導帕金森病模型細胞自噬，發揮治療作用。

丁苯酞；帕金森病；SH-SY5Y細胞；自噬；大鼠

［本文著錄格式］賈玉鳳，吳慶文，程月發，等.丁苯酞對1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導細胞自噬的影響［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（4）：422-427.

CITED AS：Jia YF，Wu QW，Cheng YF，et al.Effect of butylphthalide on autophagy of SH-SY5Y cells induced by l-methyl-4-phenyl-pyridiniumion［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（4）：422-427.

1　材料與方法

1.1細胞株

SH-SY5Y細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2藥物與試劑

丁苯酞：中國食品藥品檢定研究院。MPP+、噻唑藍（MTT）：SIGMA公司。DMEM/F12=1∶1培養基、胰酶（trypsin）、胎牛血清（FBS）：GIBICO公司。磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GADPH）抗體：華安生物技術有限公司。LC3抗體：MBL公司。Beclin 1抗體：北京博奧森生物工程有限公司。引物由INVITROGEN公司設計合成。

1.3儀器

CO2培養箱（Thermo Scientific Forma）、酶標儀、PCR儀、Gel DocTM EZ Imager：意大利BIO-RAD公司。倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡：OLYMPUS公司。超凈工作臺：中國蘇州凈化設備廠。低溫離心機：日本日立公司。凝膠成像系統：意大利BIO-RAD公司。

1.4方法

1.4.1細胞培養及分組

將SH-SY5Y細胞株置于DMEM/F12=1∶1培養基（含10%的胎牛血清，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml），37℃，5%CO2孵育箱中培養，2～3 d換一次培養基，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態，待達到80%～90%細胞匯合后，按1∶2對細胞進行傳代，選取對數生長期的細胞進行實驗。實驗共分4組，分別是空白對照組（A組）、MPP+組（B組）、雷帕霉素預處理+ MPP+組（C組）和丁苯酞預處理+MPP+組（D組）。

A組：細胞正常含血清培養基進行培養。

B組：待達到70%～80%細胞匯合后的3 h之后向培養基中加入1 mmol/L的MPP+繼續培養至24 h。

C組：待達到70%～80%細胞匯合后向培養基中加入200 nmol/L的雷帕霉素培養3 h后再加入1 mmol/L的MPP+繼續培養至24 h。

D組：待達到70%～80%細胞匯合后向培養基中加入10 μmol/L丁苯酞培養3 h后再加入1 mmol/L的MPP+繼續培養至24 h。

1.4.2 MTT比色法

采用MTT比色法檢測細胞存活率。以每孔（1～5）× 104個/ml的活細胞懸液100 μl接種于96孔板中，細胞干預情況同上，分別加入50 mg/ml的MTT 15 μl繼續孵育3 h，吸去培養基，加入150 μl的DMSO，搖床15 min，酶標儀490 nm波長檢測吸光度值（OD值），計算細胞生長抑制率，實驗重復6次。計算公式：

1.4.3 Western blotting

采用Western blotting檢測自噬相關蛋白的表達情況。細胞干預情況同上，每孔加入100 μl裂解液，用細胞刮刮掉細胞，放入EP管中，超聲打碎，離心，取上清。用BCA試劑盒檢測樣品濃度進行蛋白定量。蛋白變性，SDS-PAGE電泳，采用濕轉轉膜，5%牛奶封閉1 h，LC3單克隆抗體（1∶1000），Beclin 1（1∶500）、GAPDH（1∶1000）一抗4℃搖床過夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗37℃孵育1 h，TBST洗3次，ECL顯色，用Image J軟件對結果進行分析，條帶灰度值表示蛋白表達含量，用內參GAPDH進行校準，計算各組蛋白相對表達含量。以上實驗重復6次。

1.4.4 RT-PCR

細胞干預情況同上，按Trizol試劑說明書提取細胞總RNA；用Q3000型微量分光光度計測RNA濃度，根據所測濃度，計算出各組所需RNA的體積；按反轉錄試劑盒進行cDNA合成；配置引物（引物序列見表1）；根據這4個基因序列的不同特點，進行RT-PCR擴增，反應條件為94℃預變性4 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，40個循環；最后72℃延伸5 min，4℃保存。其中退火溫度依次為LC3-Ⅰ，58.5℃；LC3-Ⅱ，57℃；Beclin 1，60℃；β-actin，57℃。PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，Gel DocTMEZ Imager掃描成像，用Image J軟件對結果進行分析，條帶灰度值表示基因表達含量，用內參β-actin進行校準，計算出各組mRNA相對表達含量。以上實驗重復6次，取平均值。

表1　引物序列

1.5統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料用（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2　結果

2.1細胞存活率

與A組比較，B組細胞存活率顯著降低（P＜0.001）。與B組比較，C組和D組細胞存活率顯著降低（P＜0.001）。C組和D組間無顯著性差異（P＞0.05）。見表2。

2.2 LC-3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白的表達

B組LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1蛋白表達量明顯高于A組（P＜0.01），C組和D組LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1蛋白表達量明顯高于B組（P＜0.01），C組和D組間無顯著性差異（P≥0.05）。見表3、圖1。

2.3 LC-3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1 mRNA的表達

B組LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1 mRNA表達量明顯高于A組（P＜0.01），C組和D組LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1 mRNA表達量明顯高于B組（P＜0.01），C組和D組間無顯著性差異（P＞0.05）。見表4、圖2。

2.4細胞形態

B組的細胞大部分胞體腫脹變圓，突起結構減少，貼壁細胞數目減少；C組和D組與B組相比，貼壁細胞增多，胞體和軸突完整，細胞間的突起聯系增多且細胞形態逐漸接近A組。見圖3。

表2　各組SH-SY5Y細胞存活率比較（%）

圖1　Western blotting檢測各組細胞LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1蛋白表達水平

圖2　RT-PCR檢測各組細胞LC3、Beclin 1 mRNA表達水平

圖3　各組細胞形態學的變化（光鏡，100×）

表3　各實驗組細胞LC3-Ⅱ/Ⅰ及Beclin 1蛋白相對表達量

表4　各組細胞LC3-Ⅱ/Ⅰ及Beclin 1的mRNA相對表達量

3　討論

研究表明，丁苯酞具有抗氧化應激、保護線粒體，減少活性氧等功效［10-11］。Huang通過研究丁苯酞對細胞凋亡的保護作用機制發現，丁苯酞可降低由MPP+誘導對細胞產生的毒性作用，抑制線粒體的膜電位發生變化，減少細胞的氧化應激作用，增加細胞中谷胱甘肽的含量，同時也可降低α-突觸核蛋白的累積，進而減少路易小體的形成［12］。基礎研究及臨床研究均表明，丁苯酞對帕金森病有確切療效［13］。

自噬是細胞自我保護、自我更新的一種重要機制［14］。氧化應激導致受損線粒體的降解及因泛素-蛋白酶體系統（ubiquitin-proteasome system，UPS）障礙而無法降解的異常蛋白的降解均需要自噬的參與［15-17］，及時降解多余的、受損的及衰老的蛋白與細胞器，可以防止氧化應激的級聯反應，同時也為細胞重建、再生和修復提供必需原料，維持細胞內穩態。

自噬受各種信號因子的調節影響，其中mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是雷帕霉素的靶分子，能抑制自噬的發生，而使用雷帕霉素抑制mTOR的活性能激活自噬。Beclin 1是酵母自噬相關基因Atg6/ Vps30的哺乳動物同源基因，參與自噬體形成的初始步驟［18］。其通過與Bcl-2、UVRAG、mVps34、Barkor、死亡相關蛋白激酶1（death associated protein kinase 1，DAPK1）的相互作用調節細胞自噬［19-20］。有研究將表達Beclin 1的慢病毒轉染至α-突觸核蛋白轉基因小鼠的大腦內，α-突觸核蛋白在邊緣系統的積聚減少，神經元突觸和樹突的病理改變在一定程度上得以改善［21-22］；而Beclin 1水平的下調可能導致自噬不足，從而加劇神經退行性疾病的進程［23］。當自噬程序啟動時，新合成的LC3前體經加工形成其胞質形式LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ被Atg7激活轉變成Atg3，并在其羧基端剪切22個氨基酸殘基形成LC3-Ⅱ，最終與磷脂（磷脂酰乙醇胺）結合形成膜連接的LC3-Ⅱ［24］。因此LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的轉變是自噬體形成的標志。

本研究結果顯示，4組中LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1的蛋白表達及mRNA的表達依次增多，提示自噬途徑被激活，但由于MPP+組自噬的防御功能得不到充分發揮，過量的活性氧、異常聚集的α-synuclein及受損的細胞器將誘導細胞進入凋亡途徑，導致細胞死亡［25］。當給予細胞丁苯酞或雷帕霉素預處理后，LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1的蛋白表達及mRNA的表達均較MPP+組明顯升高，說明丁苯酞起上調自噬的作用。同時，兩預處理組細胞存活率也有所改善，說明適度提高自噬水平有助于保護受損的神經元細胞，這與Crews等的研究結果［26］一致。

由上述研究結果可推測，丁苯酞可能通過上調自噬水平，防止受損細胞發生繼發性損傷來發揮保護作用，進而控制帕金森病的發生發展，提高帕金森病患者生存質量。

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Effect of Butylphthalide onAutophagy of SH-SY5Y Cells Induced by l-methyl-4-phenyl-pyridiniumion

JIA Yu-feng1，WU Qing-wen1，CHENG Yue-fa2，CHEN Juan1，MENG Qi4
1.College of Nursing and Rehabilitation of North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei 063000，China；2.Jitang College of North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei 063000，China；3.West China School of Public Health，Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610041，China
Correspondence to WU Qing-wen，CHENG Yue-fa.E-mail：wxywqw@163.com（WU Qing-wen）；arthurcyf@163. com（CHENG Yue-fa）

Objective To observe the effects of butylphthalide on the expression of autophagy-related protein and mRNA in l-methyl-4-phenyl-pyridiniumion（MPP+）-induced SH-SY5Y cells，and to explore the protective effect and possible mechanism of butylphthalide to the cell model of Parkinson's disease.Methods The SH-SY5Y cells were divided into control group（A），MPP+group（B），rapamycin pretreated+MPP+group（C）and Butylphthalide pretreated+MPP+group（D）.The relative viability of SH-SY5Y cells induced by MPP+was measured with MTT assay，the morphology of SH-SY5Y cells was observed.The expression of microtubule associated protein 1 light chain 3（LC3）-II/I and Beclin 1 protein was detected by Western blotting.And the expression of LC3-II/I and Beclin 1 mRNA were assayed by real-time quantitative reverse transcription-PCR（RT-PCR）.Results The viability rates of cells were significantly lower in group B than in group A（t=20.270，P＜0.001），and were significantly higher in groups C and D than in group B（t＞8.770，P＜0.001），however，there was no significantly difference between groups C and D（t=2.270，P=0.064）.The expression of LC3-II/I and Beclin 1 was higher in group B than in group A（t＞6.647，P＜0.01），and was higher in groups C and D than in group B（t＞3.630，P＜0.01），however，there was no significantly difference between groups C and D（t＜2.238，P≥0.05）.Conclusion Butylphthalide could prevent the injury of SH-SY5Y cells induced by MPP+，which may affect Parkinson's disease by inducing autophagy.

butylphthalide；Parkinson's disease；SH-SY5Y cells；autophagy；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.011

R742.5

A

1006-9771（2016）04-0422-06

河北聯合大學博士科研啟動基金項目（No.35647699）。

1.華北理工大學護理與康復學院，河北唐山市063000；2.華北理工大學冀唐學院，河北唐山市063000；3.四川大學華西公共衛生學院，四川成都市610041。作者簡介：賈玉鳳（1988-），女，漢族，河北唐山市人，碩士研究生，主要研究方向：神經康復。通訊作者：吳慶文（1966-），女，博士，教授，碩士研究生導師，主要研究方向：康復醫學、神經康復。程月發（1967-），男，博士，教授，碩士研究生導師，主要研究方向：藥理學。E-mail：wxywqw@163.com（吳慶文）、E-mail：arthurcyf@163.com（程月發）。

帕金森病（Parkinson's disease）是一種以黑質紋狀體致密部的多巴胺能神經元進行性丟失、α-突觸核蛋白大量沉積為主要病理特征的神經退行性疾病［1］，其病因及確切的發病機制目前尚未明確。近年研究證實自噬途徑異常調控在帕金森病的發生、發展過程中起著重要的作用［2-3］。

自噬是細胞對外源性刺激的重要適應性反應［4］，其作為真核細胞中普遍存在的一種溶酶體依賴型途徑，對應激狀態下細胞存活、清除神經細胞內衰老的細胞器或錯誤折疊與聚集的蛋白質具有重要作用。適度調節自噬水平已經成為預防或治療神經退行性病變的一條重要途徑［5-6］。

丁苯酞為脂溶性的藥物，可以直接通過血腦屏障發揮作用，具有改善線粒體功能、抗氧化應激、抑制凋亡、促進神經元再生、穩定內皮細胞等多種作用［7］，現已應用于帕金森病的臨床治療［8］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是衰老和衰老相關疾病的一個關鍵性調節因子。雷帕霉素（rapamycin，RAPA）可通過抑制mTOR通路，誘導和促進細胞自噬［9］。

1-甲基-4-苯基吡啶離子（l-methyl-4-phenyl-pyridiniumion，MPP+）是神經毒素1-甲基-4-苯基-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）在腦內的代謝產物，它能夠特異抑制線粒體復合物Ⅰ，導致黑質多巴胺能神經元死亡，而人體神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞具有多巴胺能神經元特性，因此，MPP+刺激神經細胞能夠構建帕金森病的細胞模型，這也是國內外廣泛應用的帕金森病細胞模型。

本研究采用MPP+誘導SH-SY5Y細胞建立帕金森病細胞模型，以自噬促進劑雷帕霉素為對照，觀察丁苯酞預處理后，細胞存活率、形態變化和自噬相關因子Beclin 1和微管相關蛋白1輕鏈3β（microtubule associated protein 1 light chain 3β，LC3β）的表達及變化，探討丁苯酞治療帕金森病的作用機制。

（2015-11-16

2015-12-28）