Trametes sp.LS-10C漆酶催化酸性鉻藍(lán)K脫色條件優(yōu)化

劉　宇，湯　斌，李　松（安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖　241000）

Trametes sp.LS-10C漆酶催化酸性鉻藍(lán)K脫色條件優(yōu)化

劉宇，湯斌?，李松
（安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖241000）

用栓菌Trametes sp.LS-10C漆酶對(duì)酸性鉻藍(lán)K進(jìn)行脫色，得到了LS-10C漆酶催化酸性鉻藍(lán)K脫色的最適反應(yīng)條件.在給酶量10 U/m L、p H 4.5、溫度45℃、染料質(zhì)量濃度100 mg/L、ABTS 10μmol/L的條件下反應(yīng)2 h后，酸性鉻藍(lán)K的脫色率達(dá)到79.56%.研究表明，栓菌Trametes sp.LS-10C漆酶在處理染料廢水脫色領(lǐng)域具有研發(fā)和應(yīng)用前景.

栓菌；漆酶；偶氮染料；脫色

有機(jī)合成染料根據(jù)其發(fā)色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)主要分為偶氮類和蒽醌類等，其中，偶氮染料（Azo dyes）是廣泛應(yīng)用于紡織和印染工業(yè)中的第一大類染料［1］.偶氮染料是一類含有一個(gè)或者多個(gè)偶氮基團(tuán)（-N=N-）的芳香族化合物，具有致癌、致畸或其他毒性作用［2］.在染料的生產(chǎn)和使用過程中，約有10%～15%的染料直接隨廢水一起排出，嚴(yán)重影響著生態(tài)系統(tǒng)的和諧穩(wěn)定.因此，尋求經(jīng)濟(jì)有效的偶氮染料降解或去除方法對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和人類的健康具有重要意義.

漆酶（Laccase，EC 1.10.3.2）是多銅氧化酶家族（Multi-copperoxidases，MCOs）中最重要的一員，1883年由Yoshida在漆樹（Rhus vernicifera）汁液中首次發(fā)現(xiàn)［3-4］.漆酶具有較高的氧化還原電勢(shì)，可以催化氧化酚類化合物；在某些小分子介體（Mediators）存在的條件下，還能夠氧化非酚類物質(zhì)［5-6］.因此，漆酶在木質(zhì)素的去除、紙漿的生物漂白、印染廢水的處理以及環(huán)境保護(hù)中的生物修復(fù)等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛和深入［7］.研究發(fā)現(xiàn)，漆酶可對(duì)多種偶氮染料進(jìn)行有效脫色，是生物酶法處理印染廢水的常用酶種之一［8-9］.

選擇偶氮染料酸性鉻藍(lán)K利用栓菌Trametes sp.LS-10C漆酶進(jìn)行脫色處理，研究中考察了小分子介體、漆酶用量、染料質(zhì)量濃度、作用溫度和p H等因素對(duì)該酸性染料脫色率的影響，以期為偶氮染料的生物酶法處理提供參考.

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

（1）菌株.漆酶產(chǎn)生菌株Trametes sp.LS-10C由安徽工程大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（M2015191）.

（2）培養(yǎng)基.PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、土豆浸出汁200 g/L、瓊脂20 g/L、p H自然；種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉3 g/L、p H自然；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L、豆渣10 g/L、麩皮浸出汁100 g/L、NH4Cl 3.0 g/L、KH2PO41.5 g/L、CuSO4·5H2O 0.25 g/L、NaCl 1.5 g/L、MgSO41.0 g/L、Tween-80 0.3%、p H自然.

（3）主要試劑.ABTS［2，2＇-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽］和DMP（鄰苯二甲酸二甲酯）購(gòu)自Sigma公司；酸性鉻藍(lán)K（Acid Chrome Blue K，ACBk，λmax=545 nm）購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；香蘭素、丁香醛、HOBT（1-羥基苯并三氮唑）、阿魏酸、丁香酸、HBA（對(duì)羥基苯甲酸）等購(gòu)置于上海源葉生物科技有限公司；其他化學(xué)純或分析純生化試劑購(gòu)置于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；麩皮和豆渣，均為市售.酸性鉻藍(lán)K的結(jié)構(gòu)式如圖1所示.

（4）主要的儀器設(shè)備.QHZ-123B組合式全溫度振蕩培養(yǎng)箱（太倉市華美生化儀器廠）；BIOTECH-10JS-9000C自動(dòng)發(fā)酵罐（上海保興生物設(shè)備工程有限公司）；L5紫外可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；HH-601A數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；PHSJ-3F雷磁p H計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）.

圖1　酸性鉻藍(lán)K的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.2實(shí)驗(yàn)方法

（1）粗酶液的制備.挑取斜面中培養(yǎng)的Trametes sp.LS-10C菌絲（約3 cm2）接種至種子培養(yǎng)基中（150 m L/500 m L），置于30℃、200 r/min培養(yǎng)48 h后，以10%的接種量轉(zhuǎn)接于10 L自動(dòng)發(fā)酵罐.發(fā)酵條件控制為：裝液量7 L、溶氧30%、溫度30℃、p H自然.發(fā)酵7 d后取發(fā)酵液于4℃、5 000 r/min離心30 min，收集上清液即得粗酶液，置于4℃保存?zhèn)溆?

（2）漆酶的分離純化［10］.

（3）漆酶活力的測(cè)定.以ABTS為底物［11］，將等體積的0.5 mmol/L ABTS溶液與適當(dāng)稀釋的漆酶液置于40℃水浴中反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)前3 min內(nèi)反應(yīng)體系在420 nm處吸光值的變化，并且定義1 min內(nèi)氧化1μmol ABTS所需要的酶量為一個(gè)漆酶活力單位（U）.其中，ABTS溶液或酶液均使用醋酸—醋酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，p H 4.0）配置或稀釋并以煮沸滅活的酶液作為對(duì)照.已知，420 nm處ABTS的摩爾消光系數(shù)ε420=36 L/（mmol·cm）.

2　結(jié)果與分析

2.1介體對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

在漆酶催化染料脫色的過程中，介體的參與往往可以顯著提升脫色效率和脫色率［12］.因此，研究在酸性鉻藍(lán)K脫色體系中分別加入香蘭素、丁香醛、HOBT、阿魏酸、DMP、丁香酸、HBA和ABTS等介體至終濃度均為10μmol/L，對(duì)照組不添加任何介體，結(jié)果如圖2a所示.由圖2a可知，ABTS對(duì)Trametes sp.LS-10C漆酶催化ACBk脫色有明顯的促進(jìn)作用.ACBk脫色率是對(duì)照組的1.87倍；丁香醛和HOBT對(duì)ACBk脫色的促進(jìn)作用則不明顯，分別是對(duì)照組的1.27倍和1.21倍；其他介體對(duì)于該漆酶催化酸性鉻藍(lán)K脫色的影響較小.因此，選擇ABTS作為L(zhǎng)S-10C漆酶對(duì)ACBk脫色研究的最佳介體.

在反應(yīng)體系中加入不同濃度的ABTS，以研究ABTS濃度對(duì)ACBk脫色的影響，結(jié)果如圖2b所示.由圖2b可知，在沒有ABTS情況下，LS-10C漆酶對(duì)ACBk的脫色率為40.48%；并且該酸性染料的脫色率隨ABTS濃度的增加而增加，最高可達(dá)到80.17%；當(dāng)ABTS濃度高于10μmol/L時(shí)，該漆酶對(duì)ACBk脫色率的增加開始趨于平緩.所以，ACBk的脫色反應(yīng)中ABTS的最適加入量為10μmol/L.關(guān)于漆酶/介體對(duì)染料脫色的影響在相關(guān)文獻(xiàn)中也有報(bào)道，如Woodward［13］等研究發(fā)現(xiàn)HBT等介體在Trametes trogii漆酶處理工業(yè)紡織廢水中具有顯著的促進(jìn)作用，但鄰香豆酸等介體則具有強(qiáng)烈的抑制作用.趙敏［14］等研究發(fā)現(xiàn)以TEMPO為介體時(shí)能大大增強(qiáng)疣孢漆斑菌NF-05漆酶對(duì)橙黃G6的脫色效率.

圖2　介體種類和ABTS濃度對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

2.2給酶量對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

適當(dāng)稀釋Trametes sp.LS-10C漆酶液并分別加入各反應(yīng)體系至不同的終濃度，以研究給酶量對(duì)ACBk脫色的影響，測(cè)定結(jié)果如圖3所示.由圖3可知，隨著給酶量的增加ACBk脫色率也相應(yīng)地得到提高；當(dāng)給酶量增加至10 U/m L時(shí)，ACBk脫色率基本接近最大值；繼續(xù)增加漆酶用量時(shí)，ACBk脫色率趨于穩(wěn)定.因此，漆酶的最適給酶量為10 U/m L.

2.3染料質(zhì)量濃度對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

使用緩沖液將ACBk分別稀釋至25 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L、150 mg/L、175 mg/L和200 mg/L并進(jìn)行脫色，結(jié)果如圖4所示.由圖4可知，當(dāng)ACBk質(zhì)量濃度從25 mg/L增加至100 mg/L時(shí)，ACBk脫色率逐漸上升至73.53%；當(dāng)ACBk質(zhì)量濃度繼續(xù)增大至200 mg/L時(shí)，ACBk脫色率基本穩(wěn)定.所以，Trametes sp.LS-10C漆酶對(duì)ACBk在100～200 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)脫色效果較好.

圖3　漆酶濃度對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

圖4　染料質(zhì)量濃度對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

2.4溫度對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

將ACBk脫色體系分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃等一系列溫度下進(jìn)行脫色反應(yīng)，以研究脫色溫度對(duì)ACBk脫色的影響，結(jié)果如圖5所示.由圖5可知，在20～45℃之間，Trametes sp.LS-10C漆酶對(duì)ACBk脫色率與溫度呈正相關(guān)關(guān)系，45℃時(shí)ACBk脫色率達(dá)到最大值75.37%；當(dāng)脫色溫度繼續(xù)上升，ACBk脫色率隨之下降，在60℃時(shí)該漆酶對(duì)ACBk染料的脫色率下降至66.31%.因此，選擇45℃作為L(zhǎng)S-10C漆酶催化ACBk脫色的最適脫色溫度.

2.5p H對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

用p H分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.5、6.5和7.0的緩沖溶液配置ACBk染料并進(jìn)行脫色反應(yīng)，以研究p H對(duì)ACBk脫色的影響，結(jié)果如圖6所示.由圖6可知，隨著p H的增加，ACBk脫色率先增加后下降，p H 4.5時(shí)脫色率最大（74.52%）；在p H 4.0～5.0范圍內(nèi)，ACBk脫色率較高，基本在66%以上；當(dāng)p H在5.0～7.0時(shí)，ACBk脫色率迅速下降至28.27%.因此，Trametes sp.LS-10C漆酶對(duì)ACBk的最佳脫色p H為4.5.

2.6酸性鉻藍(lán)K脫色率隨時(shí)間的變化規(guī)律

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將ACBk染料的脫色反應(yīng)體系控制在最優(yōu)條件下進(jìn)行，并延長(zhǎng)其脫色時(shí)間至24 h，ACBk脫色率隨時(shí)間的變化規(guī)律如圖7a所示.由圖7a可知，Trametes sp.LS-10C漆酶對(duì)ACBk的脫色率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，24 h時(shí)脫色率最高可達(dá)到83.82%.從整個(gè)反應(yīng)趨勢(shì)可以看出，添加ABTS可以顯著提升ACBk的脫色效率（2 h，79.56%/47.18%）；隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，不添加ABTS使得ACBk脫色率仍然較低（24 h，83.82%/71.93%）.上述結(jié)果表明，ABTS不但可以提高Trametes sp.LS-10C漆酶對(duì)ACBk在脫色反應(yīng)前期（0～6.0 h）的催化效率，還可以提高ACBk脫色率.這可能是因?yàn)椋浩崦阜肿訌腁BTS或ACBk得到電子，將氧氣還原為水；ACBk被氧化為很不穩(wěn)定的陽離子自由基后，從而引發(fā)一系列反應(yīng)如發(fā)色基團(tuán)發(fā)生斷裂等，ACBk生色結(jié)構(gòu)的破壞表現(xiàn)為染料顏色的消失或變淡；由于ACBk空間位阻等因素，影響漆酶對(duì)該染料降解效率；小分子介體ABTS轉(zhuǎn)變成陽離子自由基后，具有較高的氧化還原電勢(shì)，不但能夠?qū)CBk快速氧化脫色，還可以將漆酶較難單獨(dú)降解的物質(zhì)進(jìn)一步氧化.上述猜想在一系列文獻(xiàn)中得到了進(jìn)一步的佐證，Baldrian［15］認(rèn)為HBT等介體通過促進(jìn)氧氣和漆酶底物之間的電子傳遞進(jìn)程，協(xié)助漆酶將底物氧化.Galai［16］等研究發(fā)現(xiàn)Stenotrophomonas maltophilia AAP56漆酶/ABTS對(duì)活性黑5脫色過程中，漆酶單獨(dú)不能降解的活性黑5的偶氮連接橋部分礦化，檢測(cè)到至少有5種中間產(chǎn)物生成.張瑞景［17］等研究表明Pleurotus sp.N3漆酶/HOBT對(duì)苯胺藍(lán)的脫色可能是因?yàn)樵撊玖系娘@色基團(tuán)C=N斷裂解聚生成3種中間產(chǎn)物.

分別對(duì)處理24 h后的反應(yīng)體系和對(duì)照樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（300～800 nm），結(jié)果如圖7b所示.由圖7b可知，ACBk脫色液在其最大吸收波長(zhǎng)處還有明顯的特征吸收峰，表明單獨(dú)使用LS-10C漆酶時(shí)ACBk的降解程度相對(duì)漆酶/ABTS體系較低，這與上述實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果是相符的.

圖5　溫度對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

圖6　p H對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

圖7　ACBk脫色率隨時(shí)間變化曲線和漆酶處理前后ACBk脫色液的吸收光譜圖

3　結(jié)論

以染料脫色率為考察指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)栓菌Trametes sp.LS-10C漆酶催化偶氮染料ACBk脫色條件進(jìn)行了研究.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，部分介體對(duì)ACBk脫色效率有促進(jìn)作用，而ABTS對(duì)LS-10C漆酶催化ACBk脫色的促進(jìn)作用最高.研究中發(fā)現(xiàn)，在漆酶用量10 U/m L、p H 4.5、溫度45℃、染料質(zhì)量濃度100 mg/m L、ABTS 10μmol/L的條件下反應(yīng)2 h后，酸性鉻藍(lán)K的脫色率可以達(dá)到79.56%，展現(xiàn)了Trametes sp.LS-10C漆酶在該類偶氮染料脫色中良好的處理效果，具有進(jìn)一步研究和開發(fā)的價(jià)值.

［1］何瑾馨.染料化學(xué)［M］.北京：中國(guó)紡織出版社，2009.

［2］M M Tauber，G M Gübitz，A Rehorek.Degradation of Azo Dyes by Oxidative Processes-laccase and Ultrasound Treatment［J］.Bioresource Technology，2008，99（99）：4 213-4 220.

［3］P Giardina，G Sannia.Laccases：Old Enzymes with a Promising Future［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2015，72（5）：855-856.

［4］H Yoshida.Chemistry of Lacquer（Urushi）Part 1［J］.Journal of the Chemical Society，1883，43：472-486.

［5］S Woodward，M Ellouz，A Dhouib.Decolourization and Detoxification of Textile Industry Wastewater by the Laccase-Mediator System［J］.Journal of Hazardous Materials，2010，175（1-3）：802-808.

［6］A Ca?as，S Camarero.Laccases and Their Natural Mediators：Biotechnological Tools for Sustainable Eco-friendly Processes［J］.Biotechnology Advances，2010，28（6）：694-705.

［7］C Pezzella，L Guarino，A Piscitelli.How to Enjoy Laccases［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2015，72（5）：923-940.

［8］R Cristóv?o R，A P M Tavares M，L A Ferreira，et al.Modeling the Discoloration of A Mixture of Reactive Textile Dyes By Commercial Laccase［J］.Bioresource Technology，2009，100（3）：1 094-1 099.

［9］S Rodríguez-Couto.Decolouration of Industrial Metal-Complex Dyes in Successive Batches by Active Cultures of Trametes Pubescens［J］.Biotechnology Reports，2014，4（1）：156-160.

［10］李松，劉宇，湯文晶，等.1株真菌漆酶高產(chǎn)菌株的篩選及其漆酶的純化和性質(zhì)研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41（9）：45-50.

［11］傅愷.真菌漆酶高產(chǎn)菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶及酶促降解有機(jī)染料的動(dòng)力學(xué)研究［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2013.

［12］S D Ashrafi，S Rezaei，H Forootanfar，et al.The Enzymatic Decolorization and Detoxification of Synthetic Dyes by the Laccase from a Soil-isolated Ascomycete，Paraconiothyrium Variabile［J］.International Biodeterioration and Biodegradation，2013，85（11）：173-181.

［13］S Woodward，M Ellouz，A Dhouib.Decolourization and Detoxification of Textile Industry Wastewater by the Laccasemediator System［J］.Journal of Hazardous Materials，2010，175（1-3）：802-808.

［14］趙敏，王海東，趙丹，等.產(chǎn)漆酶疣孢漆斑菌NF-05的分離及對(duì)偶氮染料的脫色［J］.菌物學(xué)報(bào)，2011，30（4）：604-611.

［15］P Baldrian.Fungal Laccases-occurrence and Properties［J］.Fems Microbiology Reviews，2006，30（2）：215-242.

［16］S Galai，H Korri-Youssoufi，M N Marzouki.Characterization of Yellow Bacterial Laccase Smlac/role of Redox Mediators in Azo Dye Decolorization［J］.Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2014，89（11）：1 741-1 750.

［17］張瑞景，李慧星，張建華，等.漆酶/HOBT體系對(duì)苯胺藍(lán)的脫色條件及機(jī)理研究［J］.安全與環(huán)境學(xué)報(bào)，2015，15（6）：233-238.

Optimization of Conditions in Decolorization of Acid Chrome Blue K by Laccase from Trametes sp.LS-10C

LIU Yu，TANG Bin?，LI Song
（Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation in Anhui Province，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

Decolorization of acid chrome blue K is conducted with the laccase from Trametes LS-10C.The optimum decolorization conditions of acid chrome blue K catalyzed by laccase from LS-10C are obtained.The results show that the amount of enzyme is 10 U/m L，p H is 4.5，temperature is 45℃，the dye concentration is 100 mg/L，the ABTS concentration is 10μmol/L.Under the optimized conditions，the decolorization rate of acid chrome blue K is 79.56%after 2.0 h.The study suggests that the laccase from Trametes sp.LS-10C has research，development and application prospects in treating dye wastewater decolorization.

Trametes sp.；laccase；azo dyes；decolorization

TS193.2

A

1672-2477（2016）04-0012-05

2016-01-10

安徽省自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目（1408085QC61）

劉宇（1988-），男，山東蘭陵人，碩士研究生.

作通訊者：湯斌（1954-），男，安徽桐城人，教授，碩導(dǎo).