粵西地區凡納濱對蝦蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下和造血組織壞死病毒感染情況的初步調查

陳祿芝，余霞艷，胡一丞，李色東

(1.湛江恒興南方海洋科技有限公司，廣東 湛江，524073；2.湛江市海洋與漁業發展研究中心，廣東 湛江，524039；3.南海生物資源開發與利用協同創新中心，廣東 廣州，510275)

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粵西地區凡納濱對蝦蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下和造血組織壞死病毒感染情況的初步調查

陳祿芝1，3，余霞艷1，3，胡一丞1，3，李色東1，2，3*

(1.湛江恒興南方海洋科技有限公司，廣東 湛江，524073；2.湛江市海洋與漁業發展研究中心，廣東 湛江，524039；3.南海生物資源開發與利用協同創新中心，廣東 廣州，510275)

針對近年來粵西地區養殖戶普遍反映凡納濱對蝦長不大的情況，本實驗室運用對蝦EHP和IHHNV的熒光定量PCR檢測方法，對該兩種病原進行了流行性調查。結果顯示，在87份樣品中，EHP的檢出率為41.38%，IHHNV的檢出率為12.18%。在檢測樣品中，兩份不同海域的海水樣品有檢測到EHP和IHNNV，而經處理過的養殖用水和育苗用水中未檢測出上述病原；成蝦的EHP檢出率最高達93.75%，種蝦的IHHNV檢出率最高為38.10%。在本地選育的種蝦和進口種蝦中，均有檢出EHP，檢出率分別為80.00%和33.33%，進口種蝦中未檢測出IHHNV。在不同養殖場樣品的檢測結果中，EHP載量指數最高的對蝦平均日增長體重最小，即載量指數為10的對蝦樣品日增長量為0.039g；而EHP載量指數最低的日增量大，即載量指數為2的日增長量為0.90g。對B養殖場不同養殖時長的對蝦進行檢測，結果發現3份樣品的EHP載量指數分別為6、7和7；B養殖場20號池不同規格的對蝦EHP載量指數均為4。

凡納濱對蝦；蝦肝腸胞蟲(EHP)；傳染性皮下和造血組織壞死病毒(IHHNV)；實時熒光定量PCR

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)原產于太平洋西海岸至墨西哥灣中部，具有生長快、抗逆性強、易養殖等特點，是當前世界對蝦養殖產量最高的優良品種之一。自2001年以來，凡納濱對蝦養殖面積和產量占據我國對蝦養殖面積和產量的首位。目前凡納濱對蝦在養殖過程中遇到大小不均、長不大等問題，給養殖戶造成了很大的損失。有研究認為，引發這些問題的病原可能是蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下和造血組織壞死病毒[1]。蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP或者ECZ)，是一種可感染多種真核生物的專性細胞內寄生蟲，2009年在泰國的斑節對蝦中被首次發現而命名，另有研究表明EHP病原體來自于澳大利亞，而且蝦與蝦之間的直接傳播方式可能來自于鮮活餌料[2-3]。在國內，中國水產科學研究院黃海水產研究所對該寄生蟲研究較多，稱之為腸胞蟲，并且建立了一套快速檢測腸胞蟲的方法[4]。感染EHP的對蝦肌肉發白、腸道吸收功能下降，嚴重的出現肝胰腺萎縮[5]，俗稱“棉花蝦”[4]。雖然這不會導致對蝦的死亡，但蝦肝腸胞蟲卻是近年來凡納濱對蝦生長緩慢的主要原因之一[6-7]。除蝦肝腸胞蟲外，傳染性皮下和造血組織壞死病毒(infectionshypodermalandhematopoieticnecrosisvirus，IHHNV)也是導致養殖對蝦生長緩慢的主要原因之一，感染IHHNV的凡納濱對蝦生長遲緩，甚至整個養殖期都無法長大[8]。EHP和IHHNV傳播途徑較廣，既可通過受精卵或種苗垂直傳播[9]，也可以通過養殖水體水平傳播[10]。這兩種病害目前已嚴重影響對蝦養殖業的健康與持續發展。

針對養殖戶反映的凡納濱對蝦生長緩慢的現象，本研究采用EHP和IHHNV實時熒光定量PCR(real-timePCR，RT-PCR)檢測方法，對粵西地區的凡納濱對蝦親蝦、蝦苗、成蝦、餌料、鮮活餌料和育苗與養殖水體進行檢測，分析這兩種病原在種苗生產與對蝦養殖中的流行情況。

1　材料與方法

1.1實驗材料

采用探針法熒光定量PCR，對EHP和IHHNV進行檢測；EHP實時熒光定量PCR檢測試劑盒、IHHNV實時熒光定量PCR檢測試劑盒均來自國家海洋局第三海洋研究所(廈門)；熒光定量PCR儀(TL988)；解剖剪等。

1.2實驗方法

1.2.1樣品預處理

蝦苗：用生理鹽水沖洗蝦苗表面3次以上，隨機挑取0.1g，置于玻璃研磨器中充分研磨后，轉入1.5mL的EP管中，提取DNA。親蝦、成蝦：分別取鮮活蝦體的肝胰臟0.1g，處理方式同上。種蝦餌料：取種蝦餌料0.1g，處理方式同上。水樣：各取80mL的水樣分裝于50mL離心管，6 000rpm離心8min，棄上層清夜，留少許上清液，懸浮沉淀，轉入1.5mL的EP管中，12 000rpm離心5min，棄上層清夜。

1.2.2樣品DNA提取

預處理的樣品參照試劑盒說明書提取樣品總DNA。

1.2.3Real-timePCR檢測

以上述提取的DNA為模板，進行real-timePCR檢測。20uL反應體系，參照試劑盒的說明書進行配制。擴增條件：95℃預變性2min；94℃變性10s，60℃退火30s(此處采集熒光，設置為FAM綠色熒光)，共40個循環。

1.2.4試劑盒特異性檢測

EHP試劑盒特異性檢測：分別選擇傳染性皮下和造血組織壞死病毒(IHHNV)、白斑綜合征病毒(WSSV)的質粒標準品和健康的凡納濱對蝦總DNA為陰性對照，水為模板的空白對照，以感染EHP的凡納濱對蝦總DNA為陽性，通過real-timePCR擴增檢測，分析試劑盒特異性。

IHHNV試劑盒特異性檢測：分別選擇蝦肝腸胞蟲(EHP)、白斑綜合征病毒(WSSV)的質粒標準品和健康凡納濱對蝦總DNA為陰性對照，水為模板的空白對照，以感染IHHNV的凡納濱對蝦總DNA為陽性，通過real-timePCR擴增檢測，分析試劑盒特異性。

1.2.5Real-timePCR標準曲線以及重復性試驗

分別對EHP、IHHNV檢測試劑盒的4個陽性標準品(4個梯度)進行real-timePCR，建立質粒拷貝數與循環數(Cycleofthreshold，Ct)對應的標準曲線，通過分析標準曲線相關系數來判斷標準曲線的質量，重復3次。用Excel對重復性擴增結果的Ct值進行方差分析。

1.2.6數據處理方法

本文采用生物統計學方法對樣品進行取樣處理，運用Excel對檢測結果進行數據統計和分析。

相比啟發式算法存在精度不高的問題，采用線性數學優化方法可以尋找到全局最優解或近優解，以Marco等[9]為代表，將FPGA布局問題轉化為MILP求優問題，文獻[10]中首先對芯片資源和待布局邏輯功能進行建模，然后設立芯片和邏輯功能需要滿足的各項約束，最后確定優化目標函數.采用該方法可以有效提高布局精度，但是由于求解時間過長，通常在待布局邏輯功能數量過大時需要設置求解器的運行時限，同時，隨著FPGA芯片規模不斷擴大，對其進行準確建模的難度也急劇增加.

2　結果與分析

2.1試劑盒特異性檢測

EHP試劑盒特異性檢測結果如圖1所示。結果顯示，除了感染EHP的凡納濱對蝦樣品有擴增曲線外，其余樣品均未檢測到熒光信號。

IHHNV試劑盒特異性檢測結果如圖2所示。結果顯示，除了感染IHHNV的凡納濱對蝦樣品有擴增曲線外，其余樣品均未檢測到熒光信號。

2.2Real-timePCR標準曲線以及重復性實驗

分別對EHP、IHHNV檢測試劑盒的4個陽性標準品(4個梯度)進行real-timePCR，以蒸餾水為空白對照，其擴增曲線呈標準的S曲線(圖3和圖4)。

對EHP、IHHNV檢測試劑盒進行重復性實驗分析，結果如表1和表2所示。從表中可知，組內3個平行Ct值基本一致，方差小于1，且變異系數小于15%，結果表明試劑盒重復性滿足檢測要求。

表1　EHP實時熒光定量PCR檢測重復性試驗

表2　IHHNV實時熒光定量PCR檢測重復性實驗

2.3多種樣品的EHP和IHHNV檢測結果

用real-timePCR檢測方法對粵西地區的有關凡納濱對蝦樣品進行EHP和IHHNV檢測，結果匯總后如表3所示。從表中可知，共檢測的87份樣品中，EHP的檢出率為41.38%，IHHNV的檢出率為12.18%。成蝦和種蝦樣品的EHP檢出率較高，分別為93.75%和66.67%。同樣，IHHNV檢出率也較高，分別為31.25%和38.10%。其中未經處理過的2份海水樣品均有檢出EHP和IHNNV，但經過砂濾、臭氧消毒、泡沫分離、紫外消毒等一系列處理后的育苗與養殖用水未檢測到EHP和IHHNV。

表3　粵西地區凡納濱對蝦有關樣品EHP和IHHNV的檢測結果

2.4進口樣品與本地樣品的EHP和IHHNV檢測結果

分別對進口種蝦、進口一代苗、本地種蝦和本地蝦苗進行檢測，結果見表4。從表中可知，6份進口種蝦樣品中，EHP檢出率較低，為33.33%，且未檢測到IHHNV。同樣，進口的一代苗中，EHP檢出率為30.00%，IHHNV的檢出率較低，為10%。本地種蝦的EHP和IHHNV檢出率最高，分別為80.00%和53.33%。本地蝦苗的EHP檢出率為21.74%，IHHNV檢出率為34.78%。

表4　進口種蝦與本地種蝦的EHP和IHHNV檢測結果

2.5不同成蝦樣品的EHP和IHHNV檢測結果

為探究凡納濱對蝦感染EHP和IHHNV對生長的影響，對不同養殖環境(不同養殖場)、不同養殖時長和不同規格的對蝦樣品進行了上述病原的檢測。不同養殖場成蝦檢測結果如表5所示，A養殖場的腸胞蟲載量最高，對蝦平均日增長體重(以下簡稱“日增長量”)最低，為0.039g。C養殖場的腸胞蟲含量最少，其平均日增長量比其它兩個場的高，為0.090g。3個養殖場的樣品均未檢測出IHHNV。

表5　不同養殖場成蝦樣品的檢測結果

注：表中“-”代表檢測結果呈陰性，下同。

Notes：-representedanegativetestresultsinthetable，thesamebelow.

B養殖場不同養殖時長對蝦的檢測結果如表6所示。3份樣品均有檢出EHP，其日增長量最大的B-24樣品，EHP載量相對最低；而日增長量最小的B-17樣，EHP載量相對較高。另在B-23的樣品中有檢出IHHNV。

表6　B養殖場不同養殖時長成蝦的EHP和IHHNV病原檢測結果

B養殖場20號池不同規格對蝦(養殖時間116d)的檢測結果如表7所示，EHP的載量指數(ERCEHP)相同；其平均日增長量為0.071g，其成蝦樣品中沒有檢測到IHHNV。

表7　B養殖場20號池不同規格蝦的EHP和IHHNV檢測結果

根據以上檢測對蝦的養殖時長和體重以及對其EHP的檢測結果，得到日增長量與EHP載量指數(ERCEHP)的關系圖(圖5)。從圖中可見對蝦的日增長量與EHP載量指數呈一定的對數關系(R2=0.574 3)。

3　討論

近年來，EHP在全球凡納濱對蝦養殖業中流行范圍很廣，先后在泰國、馬來西亞、印度等國檢測出該病原，在我國江蘇沿海和廣東沿海地區也都有檢出。EHP嚴重威脅著對蝦養殖業的發展，給養殖戶帶來了巨大的經濟損失。2015年浙江省水產技術推廣站對浙江地區的134份蝦苗樣品進行檢測，EHP的檢出率高達53.8%[11]，HHNV的檢出率為25.4%[11]；江蘇沿海地區凡納濱對蝦EHP的發病率約為25.0%[12]。本研究對粵西區域的87份樣品進行檢測，EHP的檢出率為41.38%，IHHNV的檢出率為12.18%。另在檢測樣品中，發現未經過處理的海水樣品均有檢測到EHP和IHNNV，而經過砂濾、臭氧消毒、精密過濾、紫外消毒等一系列處理過的水體中未檢測出上述病原，可見消毒處理可以預防感染EHP和IHHNV。

微孢子蟲廣泛的宿主范圍使得國內外研究者對其識別和檢測進行了大量探索研究。傳統的染色鏡檢法直觀，但對檢測人員的技術要求高，而方法靈敏度低；免疫學檢測技術主要利用抗體與抗原特異性結合的原理，結合免疫放大技術，其操作簡便，但特異性和靈敏度有待進一步提高。本實驗使用絕對定量PCR方法，不同于一般相對定量法利用內參基因得到相對表達量，絕對定量法通過測定已知拷貝數的質粒標準品，得到Ct值與拷貝數的標準曲線，然后測定樣品的Ct值，代入標準曲線得出具體的樣品中病毒的拷貝數，具有靈敏度和特異性高的特點，操作簡便，省時省力，適用于大批量樣品的檢測。

從本文對不同養殖場、不同養殖時長和不同規格對蝦的檢測結果中發現：3個養殖場的對蝦EHP載量差異大，EHP載量高的對蝦日增長量最小，而日增量大的EHP載量低；在B養殖場不同時長的對蝦檢測結果中，發現養殖時長與EHP載量沒有相關性，其感染量基本相同；B養殖場20號池不同規格的對蝦EHP載量指數一致。綜上所述，對蝦EHP的載量與養殖環境有緊密聯系，環境不同其EHP的載量指數不同。因此在對蝦養殖過程中，養殖水體、飼養餌料以及養殖工具等環境因素的嚴格把關，對控制對蝦感染EHP病原極為重要。對蝦日增長量與EHP載量指數呈一定的對數關系(R2=0.574 3)，EHP載量指數增大，日增長量呈對數下降。結果與劉珍[4]的實驗結果呈負相關性吻合。但由于實驗局限，R2較低，且樣品的養殖環境和感染時間有差異，因此EHP載量指數與對蝦日增長的關系有待后期實驗進一步的探索，本文結果可作為一個探討趨勢。

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Preliminary investigation of Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) and infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV)from Litopenaeus vannamei in west Guangdong Province

CHEN Luzhi1,3，YU Xiayan1,3，HU Yicheng1,3，LI Sedong1,2,3*

(1.ZhangjiangEvergreenSouthOceanTechnologyCo.Ltd.,Zhanjiang524073,China;2.ZhanjiangOceanandFisheryDevelopmentResearchCenter,Zhanjiang524039,China;3.TheBiologicalResourcesDevelopmentandUtilizationofCollaborativeInnovationCenteroftheSouthChinaSea,Guangzhou510275,China)

Inrecentyears,thegrowthretardationofwhiteshrimp(Litopenaeus vannamei)hasbeenacommonphenomenoninwestGuangdongProvince.ThepotentialpathogeniesofthisdiseaseareconsideredEnterocytozoon hepatopenaei (EHP)andinfectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus(IHHNV).Thefluorescentquantitativereal-timePCR(RT-PCR)methodswerefoundedsoastoestimatetheepidemicofthesetwopathogenies.Thesemethodswereusedtodetect87samplesofjuniorshrimps,parentshrimps,adultshrimps,freshfeedandwaterwhichsampledacrossthewestGuangdongProvince.TheresultsshowedthatthepositiverateofEHPwas41.38%,theIHHNVpositiverateof12.18%.Andintestingsamples,EHPandIHNNVhavebeendetectedintwoseawatersamplesindifferentareas,buthavenotbeendetectedincultivationwateraftersterilized.ThehighestEHPpositiverateofadultshrimpswas93.75%andhighestIHHNVpositiverateof38.10%.EHPwasdetectedinbothlocalandimportedparentshrimp,positiverateof80.00%and33.33%,respectively,butIHHNVwasnotdetectedinimportedparentshrimp.Inthetestresultsofsampleswithdifferentfarms,theshrimp,whichloadindexofEHPwasthehighestof10,theaverageweightofdailygrowthwastheminimumof0.039g.AndloadindexofEHPwasthelowestof2,whiletheaverageweightofdailygrowthwasthemaximumof0.090g.ButtheloadindexofEHPwasthesamewiththedifferentsizeshrimpsinthepoolof20.ThenitwasfoundthatthecontentofEHPinsmallerjuniorshrimpsfromdifferentpondswassignificantlyhigherthanlargeones,indicatingthatEHPhadasignificantimpactonthegrowthoftheshrimp.TheyhadasimilarogarithmicrelationshipandthecorrelationcoefficientwasR2= 0.574 6.

Litopenaeus vannamei;EHP;IHHNV;real-timePCR

2016-06-17

國家蝦產業技術體系(CARS-47)；餌料微藻的濃縮產品開發及應用示范(A201508C05).

陳祿芝(1990-)，女，碩士，研究方向：水產經濟動物病害防治.E-mail：clz4900@163.com

李色東(1963-)，男，教授級高級工程師，研究方向：水產經濟動物育種.E-mail：lisedong@163.com

S-3

A

1006-5601(2016)04-0273-08

陳祿芝，余霞艷，胡一丞，等.粵西地區凡納濱對蝦蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下和造血組織壞死病毒感染情況的初步調查[J].漁業研究，2016，38(4)：273-280.