氣相色譜質譜法測定養(yǎng)殖水體中丁香酚含量不確定度評定

劉海新，余　穎，湯水粉，王麗娟，羅方方

(福建省水產研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

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氣相色譜質譜法測定養(yǎng)殖水體中丁香酚含量不確定度評定

劉海新，余穎，湯水粉，王麗娟，羅方方

(福建省水產研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

根據測量不確定度評定的基本程序，對本實驗室研究建立的氣相色譜質譜法測定養(yǎng)殖水體中丁香酚含量結果進行不確定度評定。分析檢測過程中引入的不確定度分量，包括標準工作液、樣品稱量、樣液定容、儀器測定、樣品前處理重復性等。計算各分量結果并合成相對標準不確定度，在95%置信水平下，包含因子k=2，擴展方法不確定度。結果表明：該檢測方法不確定度主要來源于樣品前處理過程重復性和儀器測定。因此要確保檢測結果的準確可靠，應規(guī)范操作、嚴控工作環(huán)境條件，增加平行檢測樣本數以降低檢測方法不確定度。

不確定度；丁香酚；養(yǎng)殖水體；氣相色譜質譜

丁香酚(Eugenol)化學名為4-丙烯基-2-甲氧基苯酚，分子式為C10H12O2，廣泛存在于丁香油、肉桂葉油、樟腦油、豆蔻油等芳香油中，其藥理作用廣泛，具有麻醉、抗炎、抗過敏、抗細菌和真菌、抗氧化、促進藥物透皮吸收等作用[1]。歐洲食品安全局(EFSA)研究表明，丁香酚具有發(fā)育毒性，根據其未觀察到不良作用水平(NOAEL)，采用100倍安全系數，制定人體食用安全限量為1.0 mg/kg·bw·day[2]。丁香酚對魚類具有麻醉作用[3-4]，其麻醉機理為首先抑制魚類的腦皮質，使其喪失觸覺，然后作用于基底神經節(jié)和小腦，并最終作用于脊髓達到麻醉效果[5]。丁香酚因價格低廉、高效、易于購買，而被許多魚商用于麻醉魚，以提高長途運輸密度。目前，我國尚未批準使用漁用麻醉劑，因此在運輸水體中添加使用丁香酚并不違法，但丁香酚在流通環(huán)節(jié)潛在的風險日益受到人們的關注。水體中丁香酚檢測方法標準尚未出臺，有學者采用較昂貴的氣相色譜-串聯(lián)質譜儀(GC-MS/MS)檢測水體中丁香酚[6]。本研究在參考該檢測方法的基礎上，優(yōu)化提取和凈化過程、增加固相萃取凈化步驟，提高凈化效果，采用相對廉價、普及的氣相色譜-質譜儀(GC-MS)檢測，檢測方法相關性能指標符合標準要求。

測量的不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結果相聯(lián)系的參數，是對測定結果不可信程度或對測定結果有效性的懷疑程度。由于被測量的真值難以準確復現，因此科學合理地進行測量結果不確定度分析，并將其應用于測定結果評定中，對提高檢測結果的質量、降低誤判風險具有重要意義[7]。本文針對本實驗室研究建立的氣相色譜質譜法測定水體中丁香酚含量結果，根據《CNAS-GL06化學分析中不確定度的評估指南》[8]和《JJF1059.1-2012測量不確定度評定與表示》[9]規(guī)定的基本程序，同時參考水產品中甲基睪酮不確定度評定[10]、蘋果中多菌靈殘留量測量不確定度分析[7]、葡萄酒中山梨酸含量的不確定度的評定[11]等，對該檢測方法測量不確定度進行評定，為科學、準確、合理表述檢測結果提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

丁香酚(CAS：97-53-02)和甲基丁香酚(CAS：93-15-2)標準品(純度≥99%)：德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯(色譜純)、正己烷(色譜純)：美國Tedia公司；硅膠固相萃取柱(2 g/6 mL)：德國CNW公司；其余試劑均為國產分析純試劑；水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

1.2儀器與設備

Thermofisher DSQ氣相色譜質譜聯(lián)用儀：美國Thermofisher公司；電子分析天平AB204-E：瑞士梅特勒托利多公司；R206-B旋轉蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；TDL-40B低速臺式大容量離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3檢測方法

1.3.1標準溶液配制

丁香酚標準儲備液和標準中間液：稱取丁香酚標準品10.0 mg(精確至0.1 mg)，用乙酸乙酯溶解定容于100 mL容量瓶，配制成100 μg/mL的標準儲備液，(4±2)℃下避光保存。用1 mL的分度吸量管移取1.00 mL標準儲備液，用乙酸乙酯定容到10 mL，配制成10.0 μg/mL的標準中間液，(4±2)℃下避光保存。

100 μg/mL甲基丁香酚內標儲備液和10.0 μg/mL內標中間液配制方法和保存條件同丁香酚標準儲備液和標準中間液。

內標稀釋液：移取10.0 μg/mL的內標中間液1.00 mL，乙酸乙酯定容到10 mL，得到1.00 μg/mL的內稀釋液；移取10.0 μg/mL的內標中間液0.40 mL，乙酸乙酯定容到10 mL，得到0.40 μg/mL的內標稀釋液，使用時現配現用。

標準工作液：用1 mL的分度吸量管和10 mL的容量瓶，移取適量10.0 μg/mL丁香酚標準中間液，用乙酸乙酯溶液逐級稀釋成濃度為0.005、0.01、0.05、0.10、0.15、0.50、1.00 μg/mL的標準工作液。標準工作液定容前，加入1.00 μg/mL的內標稀釋液1.00 mL，使得每個濃度標準工作液中內標物濃度均為0.10 μg/mL，使用時現配現用。

1.3.2樣品提取和凈化

水樣經0.45 μm濾膜抽濾，用50 mL量筒量取過濾后的水樣20.0 mL于三角瓶中，加入氯化鈉1.5～2.0 g，振蕩溶解。將水樣轉入100 mL分液漏斗中，加入20 mL正己烷，劇烈振蕩2 min后靜置5 min，收集上層有機相于100 mL三角瓶中。用15 mL正己烷重復提取一次，合并兩次萃取的有機相。加入4.0～5.0 g無水硫酸鈉，旋渦振蕩10 s后，轉入100 mL雞心瓶中。用5 mL正己烷洗滌無水硫酸鈉，合并正己烷于雞心瓶中。于37℃減壓濃縮至8～10 mL，用于固相萃取。

硅膠固相萃取柱(2 g/6 mL)預先用3 mL正己烷活化，上樣，4 mL正己烷淋洗，8 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于玻璃刻度試管中，40 ℃氮吹至1.5 mL，加入0.40 μg/mL內標樣液添加液0.5 mL，定容到2 mL，混勻，0.22 μm有機相針式過濾器過濾，供氣相色譜-質譜儀測定。

1.3.3儀器條件

1)色譜條件

色譜柱：Thermo TG-1701MS石英毛細管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250℃；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL；色譜柱升溫程序：初始溫度為80℃，保持2 min；10℃/min升溫至185℃；20℃/min升溫至250℃，保持4 min。

2)質譜條件

電離模式：電子轟擊電離源(EI)，能量：70 eV；離子源溫度：250℃；傳輸線溫度：250℃；溶劑延遲10 min。

離子檢測方式：選擇離子檢測(SIM)，丁香酚檢測離子為：103、131、149、164，定量離子164；甲基丁香酚檢測離子：103、147、163、178，定量離子178。

1.3.4結果計算

采用內標法單離子定量，選定濃度與樣液相近的標準工作液，按內標法以峰面積比計算。標準工作溶液和樣液中的丁香酚和甲基丁香酚響應值均應在儀器線性范圍內，水體中丁香酚含量計算公式如下：

(1)

式中：X為試樣中目標物質的含量，μg/L；A為樣液中丁香酚的峰面積；Cs為標準工作液中丁香酚的濃度，μg/mL；Bs為標準工作液中內標的峰面積；B為樣液中內標的峰面積；As為標準工作液中丁香酚的峰面積；Vm為試樣體積，mL；V為試樣定容體積，mL。

2　結果與分析

2.1不確定度來源

從檢測過程和計算公式進行分析，樣品測定不確定度來源主要包括以下幾個方面：標準工作液引入的不確定度urel(std)、樣品稱量引入的不確定度urel(m)、樣液定容引入的不確定度urel(Vd)、儀器測定引入的不確定度urel(Y)、樣品提取凈化過程重復性引入的不確定度urel(rep)，如圖1所示。

2.2各分量不確定的計算

2.2.1標準工作液引入的不確定度urel(std)

根據標準工作液的配制過程，標準工作引入的不確定度包含兩個分量：丁香酚標儲備液配制引入的不確定度urel(Ceugenol)和標準工作液稀釋過程引入的不確定度urel(Vw)。

1)丁香酚標儲備液引入的不確定度urel(Ceugenol)

(1)標準物質純度引入的不確定度urel(P)

丁香酚純度為99%，最大允許誤差為1%，服從正態(tài)分布，95%置信水平包含因子k=2，標準不確定度u(P)=0.01/2=5.00×10-3，相對標準不確定度為urel(P)=5.00×10-3。

(2)標準物質稱量引入的不確定度urel(Mr)

(3)標準儲備液定容引入的不確定度urel(Vs)

2)標準工作液稀釋過程引入的不確定度urel(Vw)

(1)量器校準引入的相對標準不確定度urel(Vw1)

由于采用內標法定量，在評定標準工作液引入的不確定度時，需同時評定標準工作液中的目標物和內標引入的不確定度。根據丁香酚含量結果計算的數學公式，結果僅與內標的響應值有關，而與內標實際濃度值無關。同時，由于標準溶液和樣液中的內標都來源于10.0 μg/mL的內標中間液，因此，內標對檢測結果不確定度的引入，與內標儲備液配制和稀釋到10.0 μg/mL內標中間液之前的過程無關。內標加入到標準工作溶液中的環(huán)節(jié)，是在標準工作液最終定容到10 mL前，加入1.00 μg/mL的內標稀釋液1.00 mL。

urel(Vw1)=

=8.80×10-3

表1　標準溶液稀釋量器校準引入的不確定度

注：稀釋過程使用的分度吸量管和容量品均為A級。

Note：The graduated pipettes and volumetric flasks used in dilution process of standard solution are grade A.

(2)環(huán)境溫度變化引起溶劑體積改變引入的相對標準不確定度urel(Vw2)

2.2.2樣品稱量引入的不確定度urel(m)

2.2.3樣液定容引入的確定度urel(Vd)

由于采用內標法定量，樣液定容不確定度來源于樣液中加入的內標量。樣液中內標引入是在樣液進儀器分析前，加入0.50 mL濃度為0.40 μg/mL的內標稀釋液。

1)量器校準引入的相對標準不確定度urel(Vd1)

urel(Vd1)=

=0.010 5

表2　內標稀釋及加入樣液過程量器校準引入的不確定度

注：稀釋過程使用的分度吸量管和容量品均為A級。

Note：The graduated pipettes andvolumetric flasks used in process of standard solution diluted are grade A.

2)環(huán)境溫度變化引起溶劑體積改變引入的相對標準不確定度urel(Vd2)

2.2.4儀器測定引入的不確定度urel(Y)

2.2.5樣品前處理重復性引入的不確定度urel(rep)

表3　加標水樣平行檢測結果

2.3合成相對標準不確定度及擴展不確定度

上述各項不確定度分量見表4，互相獨立，養(yǎng)殖水體中丁香含量檢測合成相對不確定度為：urel(X)=

表4　不確定度分量表

根據不確定度評定指南[8]，在95%置信水平，推薦包含因子k=2。試樣中丁香酚含量測定的擴展不確定度為：U(X)=k×u(X)=2×2.5=5.0 μg/L。因此，結果表述為：檢測結果平均值及其不確定度為(50.2±5.0)μg/L。

2.4不同濃度點的不確定度差異對檢測結果影響

本方法采用的定量方式為內標法單離子定量，選定濃度與樣液相近的標準工作液，以峰面積比計算。由于不同濃度標準工作液稀釋次數不同，濃度越低的標準工作液，相對標準不確定度越高，對結果引入的不確定度也相應增大。本方法標準工作液最高濃度點為1.00 μg/mL，最低濃度點為0.005 μg/mL，按照上述方法計算，對應的相對標準不確定度分別為urel(std1.00)=0.013 4和urel(std0.005)=0.016 7，檢測結果的相對標準不確定度分別為urel(X1.00)=0.049和urel(X0.005)=0.050。因此，由標準工作液不確定度不同，而導致最終檢測結果不確定度的差異可以忽略。

3　結論

本研究從標準溶液配制、樣品稱量、樣液定容、儀器測定、樣品前處理重復性等幾方面對養(yǎng)殖水體中丁香酚殘留檢測結果的不確定度進行分析。由表4可知，檢測結果不確定度主要來源于樣品提取凈化過程重復性和儀器測定。因此，要保證檢測結果的準確可靠應注意以下四方面：1)嚴格控制樣品前處理過程，特別強調操作的規(guī)范性；2)控制好氣相色譜—質譜聯(lián)用儀的工作環(huán)境條件及儀器中易污染部件的潔凈，降低由儀器測定引入的不確定度；3)標準工作液和陽性樣品的儀器測定值，必須以多次進樣的算術平均值參與結果計算；4)陽性樣品要以平行樣品的算術平均值作為檢測結果，單樣的檢測結果不確定度大。

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Uncertainty evaluation for detecting eugenol in aquaculture water by gas chromatography mass spectrometric

LIU Haixin，YU Ying，TANG Shuifen，WANG Lijuan，LUO Fangfang

(Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province，Fisheries Research Institute of Fujian，Xiamen 361013，China)

According to the procedure for uncertainty assessment，we evaluated the measurement uncertainty of detecting eugenol in aquaculture water by GC-MS method which established in our lab.The components of uncertainty in the detecting process were studied and analyzed，including standard work solution，weighting sample，constant sample solution volume，instrument detection and sample preparation repeatability，then calculating and combining these components of uncertainty.At the 95% confidence level，the coverage factor k=2，expanding the method uncertainty.The results showed the major factors of uncertainty in this method were sample preparation repeatability and instrument detection.In order to insure that the detecting results are accuracy and reliable，we should standardize the operation，strictly control environmental condition and increase parallel sample.

uncertainty；eugenol；aquaculture water；gas chromatography mass spectrometric

2016-05-22

福建省屬公益類科研院所基本科研專項(2016R1003-14)；閩臺重要海洋生物資源高值化開發(fā)技術公共服務平臺(2014FJPT01)；福建重要海洋經濟生物種質庫與資源高效開發(fā)技術公共服務平臺(14PZY017NF17).

劉海新(1974-)，男，副研究員，主要從事水產品安全檢測技術研究.E-mail：liuhaixin303@163.com

O657

A

1006-5601(2016)04-0310-08

劉海新，余穎，湯水粉，等.氣相色譜質譜法測定養(yǎng)殖水體中丁香酚含量不確定度評定[J].漁業(yè)研究，2016，38(4)：310-317.