響應面法優化促植物生長枯草芽孢桿菌CK15產芽孢條件

黃時海，盤慧群，黃廣上，吳建飛， 張溢峰， 白先放

(廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧 530004)

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響應面法優化促植物生長枯草芽孢桿菌CK15產芽孢條件

黃時海，盤慧群，黃廣上，吳建飛， 張溢峰， 白先放*

(廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧 530004)

[目的]優化枯草芽孢桿菌CK15的發酵條件，提高其芽孢產量。[方法]通過單因素試驗優化碳源種類及濃度、氮源種類及濃度、無機鹽種類、裝液量、搖床轉速、初始pH、溫度、接種量，采用Plackett-Burman試驗篩選出培養基中的顯著因素，再利用Box-Behnken試驗確定3個因素的最佳濃度。[結果]在玉米粉10.7 g/L、豆粕粉24.4 g/L、CaCO37.4 g/L、NaCl 5.0 g/L、MnSO40.4 g/L、KH2PO41.0 g/L、裝液量50 mL/250 mL、轉速為200 r/min、初始pH 7.2、溫度30 ℃、接種量2.0%條件下，芽孢產量達到7.4×109cfu/mL，比優化前提高了80.49%。[結論]響應面法有效提高了枯草芽孢桿菌CK15的芽孢產量。

枯草芽孢桿菌；芽孢；響應面法

微生物肥料能夠增加土地肥力，凈化修復土壤，抑制植物對有害物質的吸收，減少農作物病蟲害發生，改善農產品品質[1]。枯草芽孢桿菌是一類普遍存在于植物表面的革蘭氏陽性好氧型細菌，可產生耐熱抗逆性強的芽孢，對人畜無毒無害，不污染環境[2]。目前，世界上主要選用玉米粉、豆粕粉作為枯草芽孢桿菌發酵的碳源[3]和氮源[4]。Greene曾報道大量CaCO3能夠通過調節pH來強烈啟動芽孢的生成[5]。枯草芽孢桿菌的微生態制劑可以作為飼料或肥料的添加劑來防治動物疾病和植物病害，制劑中活菌數是衡量其質量的重要指標[6]。枯草芽孢桿菌在生物防治上的應用報道很多[7-8]。微生態制劑中的活菌數會隨著其存放時間的延長而減少，最終影響其使用效果，而制成干粉劑型有利于微生物制劑的儲藏[9]。

響應面法具有試驗周期短、回歸方程精度高、可以研究多種因素間交互作用等優點[10-13]。筆者以單因素試驗為基礎，通過Plackett-Burman試驗研究了影響枯草芽孢桿菌CK15的芽孢產量的顯著因子，然后通過最陡爬坡試驗靠近最優區域，最后根據Box-Behnken試驗研究了最佳發酵條件，旨在為提高枯草芽孢桿菌的芽孢產量提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種。枯草芽孢桿菌BacillussubtilisCK15，由廣西大學生命科學與技術學院保存。

1.1.2試驗材料與試劑。糖蜜、木薯淀粉、麩皮、玉米粉、豆粕粉、玉米漿干粉、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、蛋白胨、尿素、硫酸銨、CaCO3、MgSO4、MnSO4、NaCl、KH2PO4、CaCl2、CuCl2均為國產分析純。

1.1.3培養基。種子培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L。碳源基礎培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L。氮源基礎培養基：葡萄糖 5 g/L，NaCl 5 g/L。無機鹽基礎培養基：葡萄糖 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L。

1.2方法

1.2.1菌種活化。取斜面保藏菌種劃線至平板上，28 ℃恒溫倒置培養1 d。

1.2.2種子培養。用接種環從活化好的平板上刮取菌株，接種至裝有100 mL LB培養基的250 mL三角瓶中，在搖床上28 ℃、180 r/min培養12 h至對數期。

1.2.3發酵培養。按2%的量接種至裝有100 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，在搖床上28 ℃、180 r/min培養48 h。

1.2.4芽孢檢測。取1 mL發酵液至EP管中，置于80 ℃恒溫水浴鍋中20 min，取出EP管冷卻至室溫，取0.1 mL發酵液至裝有0.9 mL無菌水的EP管中，用移液槍吹打混合均勻，然后再取0.1 mL稀釋好的發酵液0.1 mL至另一管裝有0.9 mL無菌水的EP管中，用移液槍吹打混合均勻，依次稀釋至合適濃度，取0.1 mL稀釋好的發酵液涂平板。將平板置于28 ℃恒溫培養箱培養24 h，計數平板上的菌落數[14]。

1.2.5單因素試驗。研究碳源種類(蔗糖、糖蜜、可溶性淀粉、木薯淀粉、麩皮、葡萄糖、玉米粉)及篩選出的最佳碳源濃度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、氮源種類(豆粕粉、玉米漿干粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨)及篩選出的最佳氮源濃度(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%)、無機鹽種類(CaCO3、MgSO4、MnSO4、NaCl、KH2PO4、CaCl2、CuCl2)、裝液量(50、75、100、125、150 mL)、搖床轉速(140、160、180、200、220 r/min)、初始pH(6.8、7.0、7.2、7.4、7.6)、發酵溫度(26、28、30、32、34 ℃)、接種量(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%)對芽孢產量的影響。

1.2.6Plackett-Burman試驗。在單因素試驗的基礎上，以芽孢量(cfu/mL)為響應值，選擇A(玉米粉)、B(豆粕粉)、D(KH2PO4)、E(CaCO3)、G(NaCl)、H(MnSO4)6個因素進行Plackett-Burman試驗，另設3個虛擬項作為誤差分析，每個因素取高(+1)、低(-1)2個水平。用minitab.V17.1.0軟件考察各個因素對芽孢產量的重要性，試驗設計見表1。

1.2.7最陡爬坡試驗。以Plackett-Burman 試驗篩選出的顯著因素，用單因素試驗結果設計步長，因素為正效應步長遞增，負效應步長遞減。其他因素取單因素最佳水平，進行最陡爬坡試驗，接近芽孢產量最大值區域。

1.2.8Box-Behnken 試驗。Box-Behnken 法可用于 2～5 個因素的優化試驗，每個因素取 3 個水平。根據試驗表得到結果后，對數據進行二次回歸擬合，得到帶交互項和平方項的二次多項回歸模型，對該模型進行方差和回歸分析，在一定水平范圍內得到芽孢產量的最佳值。用篩選出的影響芽孢產量最顯著的3個因素進行三水平的中心組設計。根據Plackett-Burman試驗得到的數據結果，對預測模型斜率是正值的因素，適當提高其水平，斜率是負值的因素，適當降低其水平，不顯著的單因素取單因素試驗最佳值。

表1　Plackett-Burman 試驗因素與水平

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果由圖1可知，以玉米粉為碳源，濃度為1%時芽孢產量最高；豆粕粉濃度為2%時，芽孢產量最高；過高過低的C/N都不利于芽孢的積累；CaCO3、MnSO4、KH2PO4、NaCl對芽孢產量影響顯著；裝液量為在50 mL、轉速為220 r/min時，芽孢產量最高，但與200 r/min時相比芽孢產量增幅不大，所以選擇200 r/min為最佳轉速；芽孢產量先增后減，當pH為7.2、溫度為30 ℃、接種量為2%時芽孢產量最高。單因素試驗只考慮各因素的最優值，未考慮因素之間相互作用，所得發酵條件未必為最優條件。

圖1　單因素對芽孢產量的影響Fig.1　Effect of single factors on spore production yield

2.2Plackett-Burman 試驗結果由表2可知，整個模型顯著，A(玉米粉)、B(豆粕粉)、D(KH2PO4)、E(CaCO3)、H(MnSO4)5個因素影響顯著。由p-value值可知，影響重要性大小依次為B(豆粕粉)、A(玉米粉)、E(CaCO3)、D(KH2PO4)、H(MnSO4)，選取前3個影響較大因素進一步試驗。

表2　Plackett-Burman 試驗設計與結果

2.3最陡爬坡試驗結果根據Plackett-Burman試驗結果，以芽孢產量的梯度方向為爬坡方向，根據T值可知各因素對芽孢產量的影響，玉米粉為負效應，豆粕粉和CaCO3為正效應，其余3個因素均取最低水平。由表3可知，第2組試驗芽孢產量最高，說明最優點在第2組試驗附近。選擇第2組為響應面中心點，即玉米粉10.5 g/L、豆粕粉24.0 g/L、CaCO37.5 g/L，進一步試驗。

表3　最陡爬坡試驗結果

2.4響應面試驗結果由最陡爬坡試驗結果所得中心點，運用minitab.V17.1.0創建Box-Benhnken進行響應面分析，試驗設計及結果見表4。

以芽孢產量(Y)為響應值，各試驗因素對響應值的影響可用下列函數表示：

表4　Box-Behnken 試驗設計及結果

芽孢產量(Y)響應值最大時的各因素水平為：X1=10.697 0，X2=24.378 8，X3=7.434 3，此時芽孢產量預測值為7.638 1×109cfu/mL。

發酵最優條件為：玉米粉10.7g/L,豆粕粉24.4g/L,CaCO37.4g/L,NaCl5.0g/L,MnSO40.4g/L,KH2PO41.0g/L,裝液量50mL/250mL,轉速200r/min,初始pH7.2,溫度30 ℃,接種量2.0%。在上述條件下對試驗結果進行預測和分析。優化發酵條件試驗結果表明，發酵條件優化后的芽孢產量比優化前大大提高(表5)。

運用minitab.V17.1.0軟件可得到3個重要因子之間的響應面曲面圖及其等高線圖。等高線的形狀反映因子交互作用的強弱，橢圓表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著。

由圖2可知，CaCO3濃度一定時，隨著玉米粉和豆粕粉的不斷增加，芽孢產量開始不斷提高，后期小幅度下降。一定程度上增加玉米粉有利于芽孢產生，但過多的玉米粉導致C/N過高，不利于芽孢產量的提高。

表5發酵條件優化前后芽孢產量對比

Table5Comparisonofsporeproductionbeforeandafterfermentationoptimization

×109 cfu/mL

圖2　玉米粉、豆粕粉與芽孢產量的響應面和等高線Fig.2　Response surface and contour plot of corn flour and soybean meal powder

由圖3可知，當豆粕粉一定時，芽孢產量隨玉米粉和CaCO3的不斷增加而先增加后減少，說明碳源的過高或過低都不利于芽孢的積累。CaCO3對芽孢產量影響較顯著，表現為較陡的曲面，玉米粉對芽孢產量的影響較小，曲面平滑。

由圖4可知，豆粕粉與CaCO3的交互作用影響小于玉米粉與CaCO3。在玉米粉一定時，隨著豆粕粉和CaCO3的不斷增加，芽孢產量呈現開始上升，到達最高點后下降。豆粕粉和CaCO3對芽孢產量都有較大影響，合適的豆粕粉和CaCO3濃度有利于芽孢的積累。

圖3　玉米粉、CaCO3與芽孢產量的響應面和等高線Fig.3　Response surface and contour plot of corn flour and CaCO3

圖4　豆粕粉、CaCO3與芽孢產量的響應面和等高線Fig.4　Response surface and contour plot of soybean meal powder and CaCO3

2.5模型的驗證綜合響應面結果分析，應用minitab.V17.1.0軟件分析得出芽孢產量的最佳發酵條件為X1=10.697 0，X2=24.378 8，X3=7.434 3，此時芽孢產量預測值為7.638 1×109cfu/mL。采用上訴最優條件進行試驗，得到芽孢產量為7.4×109cfu/mL與預測值7.638 1×109cfu/mL接近，表明該模型能較好地預測實際芽孢產量情況。

3　結論

在單因素試驗的基礎上，應用Plackett-Burman試驗從眾多因素中篩選出顯著因素分別為玉米粉、豆粕粉、CaCO3。用爬坡試驗靠近最大值范圍，通過Box-Behnken試驗得到顯著因素的最佳水平，最終得出最佳發酵條件為：玉米粉10.7 g/L、豆粕粉24.4 g/L、CaCO37.4 g/L、NaCl 5.0 g/L、MnSO40.4 g/L、KH2PO41.0 g/L、裝液量50 mL/250 mL、轉速為200 r/min、初始pH 7.2、溫度30 ℃、接種量2.0%。實際得到芽孢產量為7.4×109cfu/mL，比優化前提高了80.49%，與預測值接近，表明預測模型可用于實際生產中。

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Optimization of Fermentation Condition for Spore Production of Plant Growth PromoterBacillussubtilisCK15 by Response Surface Methodology

HUANG Shi-hai, PAN Hui-qun, HUANG Guang-shang, BAI Xian-fang*et al

(College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004)

[Objective] To optimize the fermentation condition ofBacillussubtilisCK15 and to enhance the Spore Production yield. [Method] Single factor test was used to optimize the type and concentration of carbon source, type and concentration of nitrogen source, the type of inorganic salt, loaded liquid volume, shaker speed, initial pH, temperature and inoculum size. The optimal concentrations of three factors were determined by Plackett-Burman design; and the optimal concentrations of three factors were obtained by Box-Behnken test. [Result] The spore production was 7.4 × 109cfu/mL under the conditions of 10.7 g/L corn flour, 24.4 g/L soybean meal powder, 7.4 g/L CaCO3, 5 g/L NaCl, 0.4 g/L MnSO4, 1.0 g/L KH2PO4, 50 mL/250 mL loaded liquid volume, 200 r/min rotation speed, initial pH 7.2, 30 ℃ temperature, and 2 % inoculation amount. Thus, the spore production increased by 80.49% than before. [Conclusion] The response surface method effectively improves the spore production ofBacillussubtilisCK15.

Bacillussubtilis; Spore; Response surface method

黃時海(1967-)，男，廣西南寧人，教授，博士，從事食品與發酵工程研究。 *通訊作者，教授，碩士生導師，從事生物技術研究。

2016-04-08

S 144

A

0517-6611(2016)20-025-05