響應(yīng)面法優(yōu)化費(fèi)菜SOD提取條件的研究

王 美， 武紀(jì)汝, 劉艷芳， 王文斗，2*

(1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041000; 2.山西師范大學(xué)現(xiàn)代文理學(xué)院，山西臨汾 041000)

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響應(yīng)面法優(yōu)化費(fèi)菜SOD提取條件的研究

王 美1， 武紀(jì)汝1, 劉艷芳1， 王文斗1，2*

(1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041000; 2.山西師范大學(xué)現(xiàn)代文理學(xué)院，山西臨汾 041000)

[目的]利用響應(yīng)面法優(yōu)化費(fèi)菜SOD的提取條件。[方法]首先進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)，單因素分別為時間、pH、液料比。經(jīng)過單因素優(yōu)化試驗(yàn)，得出最優(yōu)時間、最優(yōu)pH、最優(yōu)料液比。通過Design expert8.0.5軟件設(shè)計出17種試驗(yàn)方案。通過試驗(yàn)，得出每種方案的蛋白得率，利用Design expert8.0.5軟件進(jìn)行了方差分析，各因素之間的交互作用分析，并得出了相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型。[結(jié)果]單因素試驗(yàn)中，最優(yōu)時間為1 h，最優(yōu)pH為7.8、最優(yōu)料液比為1∶15 g/mL。各因素交互作用分析表明，提取費(fèi)菜SOD的最佳方案為提取時間0.98 h、pH 7.79、料液比1∶13.71 g/mL。利用鄰苯三酚自氧法測得提取的SOD酶活為12 U/g。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為費(fèi)菜資源的進(jìn)一步利用與研究提供參考。

費(fèi)菜；SOD；響應(yīng)面法

費(fèi)菜(SedumaizoonL.)為景天科景天屬多年生肉質(zhì)草本植物[1]，抗性極強(qiáng)，在很多類型的土質(zhì)環(huán)境中都能生長。費(fèi)菜是一種藥材，藥效與三七相近，有擴(kuò)張動脈血管、活血止血、安靜定氣等作用[2]。在日常生活中，費(fèi)菜又被視為保健蔬菜，廣受青睞[3]。

SOD是一種蛋白酶，由蛋白亞基與金屬離子組成，廣泛存在于各種動植物以及一些微生物體內(nèi)[4]。在生物體內(nèi)，SOD催化自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，清除體內(nèi)自由基，是世界公認(rèn)的具有抗氧化、抗衰老的活性物質(zhì)，常用于保健產(chǎn)品中[5-6]。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料。費(fèi)菜，采于山西臨汾堯都區(qū)，采取鮮葉用于試驗(yàn)。

1.1.2化學(xué)試劑。丙酮、無水乙醇、三氯甲烷、馬斯亮藍(lán)G-250、95%乙醇、85%磷酸、濃鹽酸、鄰苯三酚、Tris-HCl、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉。

1.1.3儀器設(shè)備。電子天平、冷凍離心機(jī)、水浴鍋、4 ℃冰箱、723N可見分光光度計、PHS-3C酸度計、微量移液器、離心管、容量瓶、量筒、燒杯等。

1.2方法

1.2.1提取與純化。采摘費(fèi)菜鮮葉，洗凈，吸干水分，稱取1 g鮮葉，置于預(yù)冷研缽中，加入5 mL 磷酸緩沖液充分研磨，提取SOD粗酶液。將所得粗酶液加入等體積預(yù)冷的丙酮，混勻，靜置15 min，冷凍離心20 min，棄上清，用磷酸緩沖液溶解沉淀，得SOD酶液[7-8]。

1.2.2含量測定。取1 mL SOD酶液與5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液混合，染色5 min，595 nm波長測OD值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白含量[9]。

1.2.3酶活測定。利用鄰苯三酚自氧化法測SOD活性[10]。

1.2.4試驗(yàn)設(shè)計。首先進(jìn)行單因素的優(yōu)化試驗(yàn)，確定單因素的最優(yōu)水平，利用Design expert8.0.5軟件設(shè)計試驗(yàn)方案[11]。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1提取時間。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，抽提時間小于1 h，所得酶液的蛋白濃度隨抽提時間的增加而上升，1 h時蛋白濃度達(dá)最大值(為4.275 μg/mL)；1 h后，隨時間的增加蛋白濃度逐漸變小。得出最適抽提時間為1 h。

2.1.2pH。7.27.8時，隨著pH的增高蛋白濃度呈下降趨勢。得出最適pH值為7.8。2.1.3料液比。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，得到最優(yōu)料液比為1∶15 g/mL。2.2各因素間的交互作用

2.2.1設(shè)計方案與試驗(yàn)結(jié)果。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面法核心對稱策劃理論[12]，運(yùn)用3因素3水平的響應(yīng)曲面分析方法，共設(shè)計試驗(yàn)方案17個，見表1。

表1Design exerpt8.0.5軟件設(shè)計方案及試驗(yàn)結(jié)果

Table 1Design exerpt8.0.5 software design scheme and experimental results

試驗(yàn)號TestNo.A時間TimehBpHC料液比Solid-to-liquidratio∥g/mLY蛋白得率Proteinyield∥μg/g10.2507.6001∶1516.24320.2507.8001∶519.77431.0008.0001∶519.06841.7507.6001∶1517.65550.2508.0001∶1519.77461.0007.6001∶517.65571.7508.0001∶157.76881.7507.8001∶514.12491.0007.8001∶1529.661101.0007.8001∶1529.661111.0008.0001∶2516.243121.7507.8001∶257.062131.0007.8001∶1529.661141.0007.6001∶2515.537151.0007.8001∶1529.661160.2507.8001∶2516.949171.0007.8001∶1529.661

2.2.2回歸方程的建立與方差分析。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，利用Design exerpt8.0.5軟件，得到蛋白得率(Y)對時間(A)、pH(B)、料液比(C)的二次多項(xiàng)方程：

Y=29.66-3.27A-0.53B-1.85C-3.35AB-1.06AC-0.18BC-8.47A2-5.83B2-6.71C2

R2= 0.961 1，擬合程度良好。

方差分析結(jié)果見表2。

由表2可看出，模型顯著性水平為極顯著，擬合度好，能較好地描述時間、pH、料液比3因素及其交互作用對蛋白得率的影響。根據(jù)F數(shù)值判斷3因素對響應(yīng)面的影響為：時間 > 料液比 >pH。

2.2.3響應(yīng)面分析。

(1)時間與pH的交互作用。由圖1可看出，蛋白得率對時間與pH交互作用的響應(yīng)呈開口向下的凸面，響應(yīng)值約在1h、pH7.8處存在最高值。

(2)時間與料液比的交互作用。由圖2可看出，蛋白得率對時間與料液比交互作用的響應(yīng)呈開口向下的凸面，響應(yīng)值約在1h、料液比為1∶15g/mL處存在最高值。從左圖看出等高線顏色變化不太明顯，表明時間與料液比交互作用對蛋白得率的影響不顯著(與方差分析結(jié)果一致)。

表2　方差分析結(jié)果

注：**差異極顯著(P<0.01)；*差異顯著(P<0.05)。

Note: **. Extremely significant difference(P<0.01); *. Significant difference(P<0.05).

(3)pH與液料比的交互作用。由圖3可知，pH與液料比交互作用的響應(yīng)面也呈開口向下的凸面，響應(yīng)值約在pH 7.8、液料比為1∶15 g/mL附近存在最高值。等高線顏色變化不明顯，pH與料液比交互作用對蛋白得率的影響不顯著(與方差分析結(jié)果一致)。

2.2.4最適提取方案。由Design expert8.0.5軟件得到了費(fèi)菜SOD提取最佳提取方案：時間0.98 h，pH 7.79，料液比為1∶13.71 g/mL，蛋白得率為29.88 μg/g。

2.3酶活力測定利用鄰苯三酚自氧法測定所提取的SOD酶活力，酶液濃度為2.372 μg/mL時，酶活力為12 U/g。

3　討論

目前SOD提取方法主要有熱變性法、硫酸銨分級鹽析法、超聲波破碎提取法、丙酮沉淀法。其中丙酮沉淀法試驗(yàn)方法簡單，成本低廉。響應(yīng)面法是一種較為簡單的尋找最佳試驗(yàn)方案的科學(xué)方法，考慮了試驗(yàn)的隨機(jī)誤差，簡單的多項(xiàng)式擬合模型，適用于試驗(yàn)方案的設(shè)計與優(yōu)化，具有用時短、精確度高、顯著性強(qiáng)的特點(diǎn)。該試驗(yàn)選擇兼具食用、藥用及園林觀賞價值的景天科植物費(fèi)菜為試驗(yàn)材料，采取丙酮沉淀法提取其超氧化物歧化酶，利用響應(yīng)面法設(shè)計并優(yōu)化提取方案，試驗(yàn)結(jié)果可為費(fèi)菜資源的進(jìn)一步利用與研究提供參考。

圖1　時間與pH交互作用對蛋白得率的影響Fig.1　Effects of time and pH interaction on protein yield

圖2　時間與料液比交互作用對蛋白得率的影響Fig.2　Effects of time and solid-liquid ratio interaction on protein yield

圖3　pH與液料比交互作用對蛋白得率的影響Fig.3　Effects of pH and solid-liquid ratio interaction on protein yield

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Study on Optimizing Extracting Conditions of SOD inSedumaizoonby the Response Surface Method

WANG Mei1, WU Ji-ru1, LIU Yan-fang1, WANG Wen-dou1,2*

(1. School of Life Science, Shanxi Normal University, Linfen, Shanxi 041000; 2. Moden College of Arts and Sciences, Shanxi Normal University, Linfen, Shanxi 041000)

[Objective] The aim was to optimize extracting conditions of SOD inSedumaizoonby response surface method. [Method] First, the single factor optimization tests were carried out. Three single factors are time, pH and solid-to-liquid ratio respectively. By Design expert 8.0.5 software, 17 kinds of test scheme were designed. The protein yield of each scheme was obtained, Design expert 8.0.5 software was used to conduct variance analysis, interactive analysis among factors, corresponding mathematical model was obtained. [Result] The results showed that in single factor experiments, the optimal time is 1 hour, pH is 7.8, and solid-to-liquid ratio is 1∶15 g/mL. Factors interactive analysis indicated that the optimal scheme for extracting SOD inSedumaizoonis time 0.98 h, pH 7.79, solid-to-liquid ratio 1∶13.71 g/mL. By the method of pyrogallol autoxidation, the extracted SOD enzyme activity was measured, that is 12 U/g. [Conclusion] The results can provide reference for further utilization and research ofSedumaizoonresources.

Sedumaizoon; FSOD; Response surface method

王美(1991- )，女，山西朔州人，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。*通訊作者，農(nóng)業(yè)推廣碩士，副教授，從事園林植物、園林設(shè)計研究。

2016-06-06

S 567.23

A

0517-6611(2016)20-063-03