玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的克隆及序列分析

王 重，樊哲儒，張躍強*，李劍峰，高 新

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，新疆烏魯木齊 830091；2.農(nóng)業(yè)部荒漠綠洲作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，新疆烏魯木齊 830091)

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玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的克隆及序列分析

王 重1，2，樊哲儒1，2，張躍強1，2*，李劍峰1，2，高 新1，2

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，新疆烏魯木齊 830091；2.農(nóng)業(yè)部荒漠綠洲作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，新疆烏魯木齊 830091)

[目的]獲得玉米的PEPC基因，并對其生物信息學進行分析。[方法]使用RT-PCR方法由玉米中獲得PEPC全長cDNA，構(gòu)建克隆載體后進行測序，并對其序列進行生物信息學分析。[結(jié)果]獲得的玉米PEPC基因CDS全長2 913 bp，編碼的多肽鏈包含970個氨基酸，為疏水性氨基酸，由α-螺旋(61.44%)、無規(guī)則卷曲(34.43%)和延伸鏈(4.12%)組成，定位于細胞質(zhì)，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，其175～970位氨基酸組成了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能結(jié)構(gòu)域，在173～184、597～609位具有2個磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性位點。[結(jié)論]該研究克隆了玉米C4型丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)基因，它所編碼的氨基酸序列具備PPDK蛋白的保守序列和催化活性中心區(qū)域。

C4植物；光合作用效率；PEPC；生物信息學分析

光合作用是作物產(chǎn)量最重要的決定因素之一，作物中90%以上的干重直接來源于光合作用。光合作用效率的高低與作物的產(chǎn)量具有直接的相關(guān)性[1]。但由于光呼吸普遍存在于C3植物，其消耗的光合同化碳素為30%左右，甚至可達50%～60%[2]，C3植物的光合作用效率相對較低。Matsuoka 等[3]研究表明，C3植物中光呼吸作用使光合作用效率降低了40%。但陸生植物中95%以上，尤其是水稻和小麥等世界主要糧食作物均為C3植物[4]，利用C4植物中的高效光合基因?qū)3植物的光合效率進行改良具有廣闊的應(yīng)用前景。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是C4光合途徑的關(guān)鍵酶，主要分布于C4植物葉肉細胞的葉綠體內(nèi)，通過濃縮CO2提高CO2濃度從而為維管束鞘細胞的C4途徑提供充足的CO2，起到CO2“泵”的作用。研究表明，向C3植物中導(dǎo)入C4途徑關(guān)鍵酶基因能夠使C3植物的光合效率提高[5]。

玉米屬于典型的C4植物，光合作用效率較高。由玉米中克隆PEPC基因并對其序列進行生物信息學分析，能夠為今后利用該基因提高C3植物的光合作用效率提供參考。筆者通過RT-PCR方法由玉米中克隆得到PEPC基因，構(gòu)建克隆載體后進行測序并對該序列進行生物信息學分析。

1　材料與方法

1.1材料供試材料為玉米(Zeamays)品種SC704，種植于新疆農(nóng)業(yè)科學院核技術(shù)生物技術(shù)研究所。

1.2試劑Trizol、大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α感受態(tài)購自TIANGEN公司，M-MLV RTase cDNA試劑盒、ExTaq均購自TaKaRa公司，T4DNA連接酶、TA克隆載體pGEM-T Easy購自promega公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司，其余試劑為進口或國產(chǎn)分析純。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，測序服務(wù)由北京華大提供。

1.3方法

1.3.1玉米總RNA提取。在光照充足的中午，取玉米葉片迅速置于液氮中研磨，使用Trizol提取總RNA。提取完成后，參照M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit程序合成cDNA。

1.3.2PEPC基因擴增。根據(jù)GenBank的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的cDNA序列，設(shè)計一對引物，即P1：5′-AGATCTGCAGATCTGCTCCAACCATCTCGCTTCCGTG-3′，P2：5′-CTTAAGGGCACGTGGCCGCCTAGCCAGTGTT-CTGCAT-3′。PCR反應(yīng)程序:98 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.3.3PEPC基因克隆測序。PCR產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將得到的目的條帶切下，使用凝膠回收試劑盒回收DNA，然后連接到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞進行藍白斑篩選，經(jīng)菌液PCR與酶切鑒定，送北京華大測序。

1.3.4PEPC序列生物信息學分析。測序結(jié)果通過NCBI ORF Finder、BLAST及ProParam程序進行在線比對，確定序列完整編碼框，并對蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)進行預(yù)測；使用TMHMM和SPORT分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域并預(yù)測其亞細胞定位；采用ProtScale分析蛋白的疏水性/親水性；利用在線工具 PHD預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；Smart分析該酶的功能結(jié)構(gòu)域；ProtFun分析蛋白質(zhì)功能；最后使用PROSITE分析多肽鏈的催化位點。

2　結(jié)果與分析

2.1玉米PEPC基因的克隆以玉米總RNA為模板進行RT-PCR，將擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在3 kb左右處有特異性條帶(圖1)，與已知PEPC基因的cDNA全長接近，回收目的片段并構(gòu)建克隆載體進行測序。

圖1　玉米PEPC RT-PCRFig.1　RT-PCR product of Zea mays PEPC cDNA

2.2玉米PEPC基因的核酸與蛋白質(zhì)序列測序結(jié)果使用Contig Express進行拼接，然后在NCBI 上使用ORF Finder查找其開放閱讀框并進行BLAST，再利用ProtParam[6]軟件分析其氨基酸序列的理化性質(zhì)。玉米PEPC開放閱讀框的長度為2 913 bp，GC含量為62.1%；BLAST結(jié)果顯示，核酸序列與玉米PEPC(NM_001111948)最大相似性達99%；氨基酸序列與玉米PEPC(NP_001105418.1)最大相似性為99%；其編碼的多肽大小為109.31 ku；理論等電點為5.73；含量最高的氨基酸為Leu、Glu和Ala，不含有Pyl和Sec；負電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為137個，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為119個；不穩(wěn)定指數(shù)約為44.65，推測其為不穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為89.48；親水性系數(shù)為-0.337，推測玉米PEPC為親水性蛋白質(zhì)。

2.3玉米PEPC跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測和分析TMHMM2.0 Server程序分析表明，玉米PEPC整條肽鏈都位于膜外，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。使用PSORT對其亞細胞定位進行預(yù)測，結(jié)果顯示，其可能定位于細胞質(zhì)。

2.4玉米PEPC的疏水性/親水性預(yù)測和分析通過Protscal程序?qū)τ衩譖EPC序列的疏水性/親水性進行分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，PEPC整條多肽鏈中親水性氨基酸均勻分布，且多于疏水性氨基酸，絕大多數(shù)氨基酸分值<0。整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，即PEPC屬于親水性蛋白，這與其基本理化性質(zhì)的預(yù)測結(jié)果一致。表明玉米PEPC中并無明顯的疏水區(qū)，推測其中可能不存在跨膜蛋白，這也與跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測和分析結(jié)果一致。

圖2　玉米PEPC Protscal分析Fig.2　Analysis of Zea mays PEPC hydropathicity by Protscal

2.5玉米PEPC二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析通過PHD軟件預(yù)測和分析玉米PEPC氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)[7-9]，結(jié)果見圖3。由圖3可知，玉米PEPC二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(61.44%)、無規(guī)則卷曲(34.43%)和延伸鏈(4.12%)組成，α-螺旋和無規(guī)則卷曲均勻分布于整條肽鏈，而延伸鏈則較為集中地分布于多肽鏈中段。

圖3　玉米PEPC二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.3　Forecast of Zea mays PEPC secondary structure by PHD

2.6玉米PEPC功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測與分析使用SMART[10-11]序列分析軟件對玉米PEPC氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果見圖4[7-9]。由圖4可知，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能結(jié)構(gòu)域由位于175～970位的796個氨基酸組成。使用ProtFun[12]預(yù)測玉米PEPC的功能，結(jié)果表明，其最主要的功能是參與氨基酸生物合成，此外，還可能參與脂肪酸代謝、蛋白質(zhì)翻譯、輔因子的生物合成以及其他中間代謝過程。

圖4　玉米PEPC功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.4　Analysis of Zea mays PEPC functional domain

2.7玉米PEPCMotifs預(yù)測和分析利用ScanProsite[6]對玉米PEPC氨基酸序列進行預(yù)測和分析，結(jié)果表明，其在173～184、597～609位氨基酸處具有2個磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性位點。此外，該多肽鏈還具有13個蛋白激酶C磷酸化位點(Protein kinase C phosphorylation site)，12個酪蛋白激酶II磷酸化位點(Casein kinase II phosphorylation site)，14個N-豆蔻酰化位點(N-myristoylation site)，1個cAMP和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點(cAMP-and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site)，3個N-糖基化位點(N-glycosylation site)，1個酰胺化位點(Amidation site)(表1)。

表1　玉米PEPC Motifs預(yù)測

3　討論

與主要糧食作物小麥、水稻等C3植物相比，玉米等C4植物具有CO2補償點低、幾乎無光呼吸等優(yōu)點，尤其是在高溫、干旱、強光等條件下，C4植物具有明顯的生長優(yōu)勢及水分利用率[13-14]，同時兼具較高的水分和氮素利用率以及光合作用效率，干物質(zhì)產(chǎn)量較高[1]。因此，人們一直努力通過各種方式使C3植物具備C4植物的光合特性，以提高其光合作用效率，從而達到大幅增加產(chǎn)量的目的。以前人們通過C3、C4植物雜交，希望C3植物能夠獲得C4植物同化CO2的高效特性，但效果并未達到預(yù)期[15]。近幾年隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，將C4光合途徑轉(zhuǎn)入C3植物取得了較大突破，在小麥中高粱PEPC基因能夠高效表達[16]，高粱、玉米的PEPC基因顯著提高了水稻的光合效率[17-18]。但在雙子葉植物煙草中甘蔗和玉米的PEPC基因不能高效表達[19]，表明C4基因在C3植物中的表達受種系發(fā)生距離的影響。

在C4光合作用途徑的所有酶中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是最重要的酶之一[20]。在Mn2+或Mg2+存在的情況下，它催化磷酸烯醇式丙酮酸羧化為草酰乙酸，然后草酰乙酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸，同時釋放出CO2和丙酮酸，丙酮酸再轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸。該研究克隆的玉米PEPC基因所編碼的蛋白包含970個氨基酸，通過SMART對其編碼的氨基酸序列進行功能域分析，結(jié)果表明，該序列175～970位氨基酸組成了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能結(jié)構(gòu)域，且在173～184、597～609位具有2個磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性位點，推測其具備磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的催化活性。

人們在Hydrillaverticillata[21-22]和Bienertiacycloptera(Chenopodiaceae)[23]中進一步研究證實C4循環(huán)和C3循環(huán)能夠在單細胞內(nèi)完成，表明植物的光合代謝存在多種類型。研究發(fā)現(xiàn)，逆境條件(如鹽害[24]、干旱[25-27]、低溫[28-30]及營養(yǎng)脅迫[30]等)會改變不同類型光合酶在不同作物或不同器官的表達模式。因此，推斷PEPC除與光合作用直接相關(guān)外，還可能在抗逆生理上發(fā)揮作用。PEPC的功能多效性對于提高作物光合作用以及抗逆性具有重要意義，有待于進一步研究。

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Cloning and Bioinformatics Analysis of Phosphoenolpyruvate Carboxylase(PEPC) in Maize

WANG Zhong1,2, FAN Zhe-ru1,2, ZHANG yue-qiang1,2et al

(1. Institute of Nuclear and Biological Technologies, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Urumqi, Xinjiang 830091; 2. Key Laboratory of Crop Ecophysiology and Farming System in Desert Oasis Region, Ministry of Agriculture, Urumqi, Xinjiang 830091)

[Objective] To clone the phosphoenolpyruvate carboxylase(PEPC) gene obtained fromZeamaysand analyze it by bioinformatics. [Method] Primarily, the cDNA clone was constructed by RT-PCR amplified with the gene specific primers, then positive clones were sequenced and analyzed by bioinformatics. [Result] The electrophoresis showed that the coding sequence(CDS) ofPEPCgene inZeamayswas 2 913 bp and the polypeptide chains coded byPEPCincluded 926 amino acids, which were hydrophobic amino acids consists of-helix (61.44%), random coil (34.43%) and extended strand (4.12%), with located in the cytoplasm. There was no transmembrane domain. The 175-970 amino acid composition the functional domains of phosphoenolpyruvate carboxylase, in 173-184; 597-609 bits had two phosphoenolpyruvate carboxylase active site with pyruvate orthophosphate dikinase basing on amino acids sequences comparison. [Conclusion] The PEPC gene in Zea mays has been obtained and the amino acids sequence coded by the gene was conserved and contained active catalyst central site of PEPC.

C4plant; Photosynthetic efficiency;PEPC; Bioinformatics analysis

新疆農(nóng)業(yè)科學院青年基金項目(xjnkq-2013025)。

王重(1982- )，男，陜西長安人，助理研究員，碩士，從事小麥遺傳育種工作。*通訊作者，副研究員，博士，從事小麥遺傳育種工作。

2016-06-14

S 188

A

0517-6611(2016)20-114-04