LEF1在卵巢上皮癌中的表達及意義

郭玉霞，馬利國，陳遞林，李明娥，石麗云，葉芷芬，鄭繪霞，梁　鋼（深圳市人民醫院婦科，深圳58000；山西醫科大學第一臨床醫學院病理科）

LEF1在卵巢上皮癌中的表達及意義

郭玉霞1，馬利國1，陳遞林1，李明娥1，石麗云1，葉芷芬1，鄭繪霞2，梁鋼2（1深圳市人民醫院婦科，深圳518000；2山西醫科大學第一臨床醫學院病理科）

目的研究淋巴增強因子1（LEF1）在卵巢上皮癌腫瘤組織中的表達情況，分析其表達與臨床病理特征之間的關系。方法收集手術切除的卵巢上皮腫瘤新鮮標本:卵巢良性上皮腫瘤24例，交界性上皮腫瘤17例，惡性上皮腫瘤35例；另選取因子宮肌腺瘤、乳腺癌、宮頸癌疾病切除的正常卵巢組織13例作為對照。提取組織蛋白，采用Western blot檢測不同組織LEF1的表達情況，分析惡性上皮腫瘤組織中LEF1的表達與患者年齡、組織學類型、分化程度等臨床病理特征之間的關系。結果與子宮良性疾病、良性、交界性卵巢上皮腫瘤相比，惡性上皮腫瘤中LEF1的表達顯著增高（P＜0.05），良性及交界性腫瘤與對照組相比無統計學差異（P＞0.05）。在卵巢惡性上皮腫瘤中，LEF1在子宮內膜樣腺癌組織中的表達高于漿液性癌及黏液性癌（P＜0.05），漿液性癌與黏液性癌組織中LEF1的表達無顯著差異（P＞0.05）；在有淋巴結轉移病例腫瘤組織中的表達高于無淋巴結轉移病例（P＜0.05）；在FIGO分期Ⅲ期+Ⅳ期病例腫瘤組織中的表達高于Ⅰ期+Ⅱ期病例（P＜0.05）；LEF1在不同年齡及不同分化程度腫瘤組織中的表達無顯著差異（P＞0.05）。與原發灶相比，LEF1在轉移性淋巴結組織中的表達顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論LEF1在卵巢上皮癌組織中表達上調，與組織類型、淋巴結轉移及臨床分期相關，可能參與卵巢癌侵襲、轉移的病理過程。

卵巢上皮腫瘤；淋巴增強因子1；蛋白印跡法

卵巢上皮性腫瘤是最常見的卵巢腫瘤，約占所有卵巢腫瘤的90%，從生物學行為上分為良性、交界性及惡性（卵巢癌）三類。卵巢癌惡性程度高，早期起病隱匿，死亡率居婦科惡性腫瘤之首［1］。淋巴增強因子1（lymphoid enhancer factor-1，LEF1）屬T細胞因子轉錄家族，是Wnt/β-catenin信號通路下游的重要效應分子［2］，近年來研究表明，LEF1在多種腫瘤中異常表達，與腫瘤的發生發展密切相關［3-5］。本實驗初步觀察LEF1在卵巢良性、交界性及惡性上皮性腫瘤中的表達情況，為卵巢上皮腫瘤的研究提供新的思路和實驗依據。

1　對象與方法

1.1臨床資料

收集深圳市人民醫院及山西醫科大學第一臨床醫學院2014-05～2015-05間手術切除的卵巢上皮腫瘤組織新鮮標本，對于大體取材所見高度可疑的盆/腹腔播散病灶或可疑轉移的淋巴結，在不影響病理診斷的前提下，留取少許播散病灶及淋巴結組織（同一塊組織如病理診斷證實非轉移灶或無淋巴結轉移，則放棄留存，全部用于病理診斷，以免影響臨床分期），所有標本置于低溫冰箱保存。所有患者均為初發，術前未經任何放化療，術后經病理診斷確診。其中:卵巢良性上皮腫瘤24例，平均年齡（43.3±9.9）歲；交界性上皮腫瘤17例，平均年齡（46.4±12.2）歲；惡性上皮腫瘤35例（漿液性囊腺癌、黏液性囊腺癌、子宮內膜樣腺癌），平均年齡（45.2±11.8）歲；另選取因子宮肌腺瘤、乳腺癌、宮頸癌切除的正常卵巢組織13例作為對照，平均年齡（47.8±9.7）歲。該研究方案經倫理審查通過。

1.2方法

采用Western blot檢測良性、交界性、惡性卵巢腫瘤組織，轉移性淋巴結組織，盆/腹腔轉移灶及正常對照組織中LEF1的表達情況，分析惡性上皮腫瘤組織中LEF1的表達與患者年齡、組織學類型、分化程度等臨床病理特征之間的關系。

1.3主要試劑

WIP組織裂解液（北京賽馳生物科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo公司）；彩色預染中分子蛋白及硝酸纖維素薄膜（武漢博士德生物工程有限公司）；LEF1兔抗鼠抗體（武漢AB-clonal公司）；GAPDH抗體及鼠抗兔IgG-HRP（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.4實驗步驟

①提取組織總蛋白:稱取200mg各組織，剪碎后加入WIP組織裂解液，于冰上提取總蛋白后檢測595nm波長的吸光度A值，計算蛋白含量:蛋白濃度=測定管吸光度A1/標準管吸光度A2×標準管濃度。②SDS-PAGE凝膠電泳:配制10%分離膠及8%濃縮膠，加入各組蛋白樣品及蛋白分子量marker。預電泳65V，30min后120V電泳60min。③轉膜:制備轉膜用“三明治”，正極、纖維墊、濾紙、凝膠、NC膜、濾紙、纖維墊、負極，加入轉移緩沖液，電壓100V，電流350mA，轉膜時間約30min。④封閉:將裁好的膜置于5%蛋白干粉封閉液中，室溫輕搖1h。⑤顯色:滴加LEF1一抗（ABclonal公司，濃度1∶500）中，4℃冰箱過夜反應。滴加二抗（濃度1∶3 000）中，室溫輕搖1h。采用ECL電化學發光法顯色，成像儀下曝光攝片。

1.5統計學方法

實驗數據采用SPSS18.0軟件進行分析，數據以均數±標準差表示，多組數據間比較采用方差分析法，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準a=0.05。

2　結果

2.1LEF1在對照組、良性、交界性及惡性卵巢上皮腫瘤中的表達

Western blot結果顯示，LEF1在37 kD處出現顯影條帶，GAPDH在36 kD處出現顯影條帶（見圖1），經灰度分析:LEF1在對照組、良性、交界性及惡性卵巢上皮腫瘤中的差異具有統計學意義（F=10.773，P=0.000，見表1）。與對照組相比，良性、交界性及惡性卵巢上皮腫瘤中LEF1的表達逐漸增高，其中惡性卵巢上皮腫瘤組織中LEF1的表達顯著增高（P=0.000），良性及交界性腫瘤與對照組相比無顯著差異（對照組vs良性組，P=0.427；對照組vs交界性組，P=0.099）。與良性及交界性腫瘤相比，惡性上皮腫瘤組織中LEF1的表達顯著增高（惡性組vs良性組，P=0.000；惡性組vs交界性組，P=0.004）。

2.2LEF1與惡性卵巢上皮腫瘤臨床病理特征之間的關系

在卵巢惡性上皮腫瘤中，LEF1在子宮內膜樣腺癌組織中的表達高于漿液性癌及黏液性癌（F= 7.648，P=0.005），漿液性癌與黏液性癌組織中LEF1的表達無顯著差異（P=0.502）；LEF1在有淋巴結轉移病例腫瘤組織中的表達高于無淋巴結轉移病例（P=0.011），在FIGO分期Ⅲ期+Ⅳ期病例腫瘤組織中的表達達高于Ⅰ期+Ⅱ期病例（P=0.002）；LEF1在不同年齡（P=0.896）及分化程度（P=0.128）腫瘤組織中的表達無顯著差異。

2.3LEF1在轉移性淋巴結組織、盆/腹腔轉移灶及原發灶中的表達

LEF1在轉移性淋巴結組織、腹腔轉移灶及原發灶中的相對表達量依次為0.715 6±0.084 9，0.585 0 ±0.0802，0.5245±0.0728。與原發灶相比，LEF1在轉移性淋巴結組織中的表達顯著增高，差異有統計學意義（P=0.003），腹腔轉移灶組織中LEF1的表達略有增高，但差異不明顯（P=0.202，見圖2）。

圖1　LEF1在對照、良性、交界性及惡性卵巢上皮腫瘤中的表達Figure1　Expression of LEF1 in benign ovarian epithelial tumor tissues，borderline epithelial tumor tissues，malignant epithelial tumor tissues and benign control tissues by Western blot

表1　LEF1在對照、良性、交界性及惡性卵巢上皮腫瘤中的表達Table1　Expression of LEF1 in benign ovarian epithelial tumor tissues，borderline epithelial tumor tissues，malignant epithelial tumor tissues and benign control tissues

表2　LEF1與惡性卵巢上皮腫瘤臨床病理特征之間的關系Table2　relationship between LEF1 expression and clinicopathological features inmAlignant epithelial tumor

圖2　LEF1在轉移性淋巴結組織、盆腔轉移灶及原發灶中的表達Figure2　Expression of LEF1 in lymph nodemetastasis，pelvicmetastasis，primary tumor

3　討論

Wnt/β-catenin信號通路的異常激活將導致細胞的惡性轉變和人類多種腫瘤的發生［6，7］。LEF1是一個具有雙向調節功能的轉錄因子，主要參與Wnt/β-catenin下游相關分子信號轉導，它一方面能夠與β-catenin結合，形成β-catenin/LEF復合物，從而促進Wnt信號通路下游靶基因c-myc、Cyclind1等的表達，另一方面它能夠募集Groucho家族的協同抑制因子，抑制轉錄執行，具有Wnt信號通路的負向調控作用［8，9］。LEF-1蛋白在多種組織的發生中具有重要的調節作用，其表達和功能異?？蓪е陆M織的發育失常。正常情況下，LEF-1在許多動物細胞的胚胎組織中是高表達的，隨著個體出生，其表達量會迅速下降，研究報道顯示，LEF1在多種腫瘤中高表達［10，11］，在這些腫瘤中，Wnt信號是亢進和失控的，Wnt信號通路中胞質集β-catenin進入細胞核與LEF/TCF結合而促進基因轉錄是惡性腫瘤最重要的特征［12，13］。

本實驗研究了LEF1在正常卵巢、良性、交界性及惡性上皮腫瘤中的表達情況，蛋白印跡定量分析結果顯示:LEF1的表達水平在卵巢癌組織中顯著增高，雖然在正常卵巢組織、良性病變及交界性病變之間的差異不明顯，但從整體水平上而言呈逐漸增高的趨勢，提示LEF1可能參與了從正常卵巢組織到卵巢癌發生發展的過程。進一步，我們分析了在卵巢癌組織中LEF1的表達與臨床病理特征之間的關系，LEF1在不同年齡及不同分化程度腫瘤組織中的表達無明顯差異，但在子宮內膜樣腺癌組織中的表達明顯高于漿液性癌及黏液性癌，這提示我們:①不同分化方向的卵巢上皮惡性腫瘤其發生的分子機制不同。②LEF1參與的分子生物事件在卵巢子宮內膜樣腺癌中可能更容易發生，或者作用更為顯著。淋巴結轉移和FIGO分期是影響卵巢癌患者預后的重要因素，本研究發現，與無淋巴結轉移及FIGO分期Ⅰ期+Ⅱ期病例相比，LEF1在淋巴結轉移及Ⅲ期+Ⅳ期病例腫瘤組織中的表達明顯增高。為了進一步驗證上述結論，我們分析了LEF1在轉移性淋巴結組織、盆/腹腔轉移灶及原發灶中的表達情況，結果發現LEF1在轉移性淋巴結組織中的表達比原發灶顯著增高，說明LEF1可能參與了卵巢癌侵襲、轉移等疾病進展過程。盆/腹腔轉移灶組織中的表達雖然略有增高，但差異不明顯，可能是由于:①盆/腹腔轉移灶來源于脫落播散的腫瘤細胞，而非直接侵襲所致；②入組樣本量較少，差異不明顯。

綜上，LEF1在卵巢上皮癌組織中表達上調，與組織類型、淋巴結轉移及臨床分期相關，可能參與卵巢癌侵襲、轉移的病理過程。LEF1在卵巢癌中作用的具體分子機制尚待功能性研究進一步證實。

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Expression and significance of LEF1 in epithelial ovarian carcinoma

GUO Yuxia1，MA Liguo1，CHENdilin1，LIMinge1，SHI Liyun1，YE Zhifen1，ZHENGhuixia2，LIANGgang2（1department ofgynecology，Shenzhen People'sHospital，Shenzhen 518000，China；2Department of Pathology，First Clinicalmedical College，Shanximedical University）

Objective To explore the expression and significance of lymphoid enhancer factor-1（LEF1）in tissues ofhuman epithelial ovarian carcinoma.Methods The expression of LEF1 in 24 cases of benign ovarian epithelial tumor tissues，17 cases of borderline epithelial tumor tissues，35 cases ofmalignantepithelial tumor tissues and 13 control tissueswasdetected byWestern blot.The correlation between LEF1 and clinicopathologicaldata was analyzed inmalignant epithelial tumor patients.Results The expression of LEF1 inmAlignant epithelial tumors was significantlyhigher than that in control tissues and benign ovarian epithelial tumor tissues and borderline ovarian tumor tissues（P＜0.05），but therewas no statisticaldifference between control tissues and benign ovarian epithelial tumor tissues，borderline ovarian tumor tissues（P＞0.05）.LEF1 expression in endometrial adenocarcinomawashigher than that in serous andmucinous carcinoma（P＜0.05），higher in lymph nodemetastasis tumor tissues than that in non-lymph nodemetastasis tissues（P＜0.05），higher in FIGO stageⅢ+Ⅳcases than that of stageⅠ+Ⅱ（P＜0.05），but the expression of LEF1 indifferent age anddifferentdegree ofdifferentiation of tumor tissues showed no significantdifference（P＞0.05）.Compared with the primary tumor，LEF1 expression inmetastatic lymph node tissuewas significantly increased（P＜0.05）.Conclusion LEF1 is up-regulated inmalignant ovarian epithelial tumor，andrelated withhistological type，lymph nodemetastasis and clinical stage，which indicates that itmay be involved in the pathological processes of invasion andmetastasis.

ovarian epithelial tumor；lymphoid enhancer factor 1；Western blot

R737.31

A

1007-6611（2016）04-0325-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.04.006

深圳市科技計劃項目（基礎研究）（JCYJ20140416122812029）

郭玉霞，女，1962-12生，本科，副主任醫師，E-mail:gyx_szsrmyy@sina.com

2016-01-15