子癇前期胎盤中差異表達的長鏈非編碼RNA的研究

孫　健，孫慶梅，陳　瑛，朱　芹，汪　云（南京醫科大學附屬蘇州醫院產科，蘇州500；勝利石油管理局錦苑衛生院；南京醫科大學附屬蘇州醫院新生兒科；共同第一作者；通訊作者，E-mail:wangyun_04@6.com）

子癇前期胎盤中差異表達的長鏈非編碼RNA的研究

孫健1，孫慶梅2#，陳瑛3，朱芹1，汪云1*（1南京醫科大學附屬蘇州醫院產科，蘇州215002；2勝利石油管理局錦苑衛生院；3南京醫科大學附屬蘇州醫院新生兒科；#共同第一作者；*通訊作者，E-mail:wangyun_204@126.com）

目的通過篩選及驗證在子癇前期患者胎盤組織中差異表達的長鏈非編碼RNA（lncRNA），探討lncRNA與子癇前期的關系。方法收集18例子癇前期胎盤樣本和同期出生的20例正常妊娠產兒胎盤樣本，采用lncRNA芯片進行研究，篩選出差異表達的lncRNA及基因，采用國際通用的基因本體（GO）功能注釋分析法和KEGG通路分析法，對差異表達基因進行功能注釋與分析，并進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證。結果檢測到顯著差異表達的lncRNA共有14個，其中表達上調的有9個，表達下調的有5個；檢測到顯著差異表達基因212個，表達上調的93個，表達下調的119個。對212個差異表達的基因進行GO功能注釋分析，顯示差異表達基因主要參與染色質結合、γ-谷氨酰轉移酶的活性和SMAD結合等信號途徑；KEGG通路分析結果顯示，差異表達的基因包括細胞周期相關、補體和凝血級聯反應相關、全身性紅斑狼瘡相關等與信號通路相關的作用基因。對顯著差異表達的3個lncRNA:linc-ASCL1-3、linc-KLF6-2和linc-ROBO1-3進行qRT-PCR驗證，其結果與lncRNA芯片檢測結果相符。結論子癇前期的胎盤組織與正常胎盤組織相比，lncRNA表達譜發生了顯著變化，可能與子癇前期的發生有關。

子癇前期；長鏈非編碼RNA；芯片

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期常見的嚴重并發癥，通常發生在妊娠20周以后，以高血壓和蛋白尿癥狀為主要特征，全世界的發病率約為2%-8%，到目前為止最有效的治療仍是終止妊娠［1-3］。胎盤是子癇前期發病的中心環節，PE患者癥狀及其并發癥在分娩結束后往往能夠得到明顯的緩解［4］。前期研究表明，子癇前期患者及正常妊娠者胎盤組織的基因表達和表觀遺傳有明顯差異［5］，然而子癇前期相關的表觀遺傳機制仍未完全闡明。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是在真核生物中新發現的一類長度大于200個核苷酸、由RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成、沒有長閱讀框架、但往往具有mRNA結構特征的RNA［6］。lncRNA可在表觀遺傳學、轉錄水平和轉錄后水平等多個層面調控基因表達，目前lncRNA在子癇前期中的表達和功能還鮮有報道。為此，本研究應用lncRNA芯片技術檢測子癇前期患者胎盤及正常孕產婦胎盤組織lncRNA和mRNA表達譜的差異，并初步篩選出與子癇前期相關的lncRNA，旨在探討lncRNA在子癇前期發生中的作用。

1　資料與方法

1.1資料來源與分組

選擇2014-02～2015-03在南京醫科大學附屬蘇州醫院產科常規產前檢查并確診為子癇前期的孕婦18例為病例組，參照樂杰主編的第7版《婦產科學》子癇前期的診斷標準。選取同期18-45歲的單胎健康孕婦20例為對照組。兩組均為單胎妊娠，年齡18-45歲的初產婦或經產婦，排除原發性高血壓、腎病、糖尿病、心臟病、前置胎盤等內外科疾病及其他產科并發癥，兩組孕婦詳細情況見表1。所有孕婦均已簽署知情同意書，課題的研究方案通過南京醫科大學附屬蘇州醫院倫理委員會批準。

表1　兩組孕婦及其新生兒一般情況比較（ˉx±s）Table1　Com parison ofgeneraldata of pregnan twomen and neonates between twogroups（ˉx±s）

1.2胎盤樣本采集

標本采集于胎盤娩出后5min內迅速完成。于胎盤母體面，避開鈣化點，在胎盤的不同區域剪取數塊胎盤組織，每塊約1cm×1cm，經DEPC（焦碳酸二乙酯）處理過的PBS漂洗2次，在濾紙上去除水分后分裝于凍存管內，標記清楚后迅速置于液氮中速凍，轉入-70℃冰箱保存備用。

1.3芯片的選擇

采用GeneChip?Humangene 2.0 STArray（Affymetrix）lncRNA芯片，芯片覆蓋目前所有權威數據庫的lncRNA，包含了11 086個lncRNA信息和30 654 個mRNA信息。

1.4總RNA的提取

采用總RNA抽提試劑盒（QIAGEN'srNeasy），參照生產商的步驟提取胎盤組織總RNA。用Nanodrop ND-1000測定RNA的濃度和純度，通過瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測RNA質量，RNA中無DNA、無蛋白質污染、無明顯降解，可用于基因芯片檢測及實時熒光定量PCR（qRT-PCR）實驗。

1.5芯片操作方法

病例組中隨機選取2例，對照組中隨機選取3例進行基因芯片分析，采用SuperScriptⅡRT試劑盒（Invitrogen）進行逆轉錄，合成雙鏈互補DNA，BioArrayhigh YieldrNA Transcript Labeling試劑盒（Enzo）合成生物素標記的cRNA，使用分光光度計檢測cRNA的濃度和質量；片斷化cRNA后進行雜交洗脫、染色，然后通過GeneChip?Scanner 3000 （Affymetrix）掃描儀對芯片的熒光強度進行掃描，用Command Console Software 3.1（Affymetrix）讀取原始數據，質控合格的數據采用Gene Spring Software 11.0（Agilent）進行分析。

1.6qRT-PCR驗證

從芯片篩選到的差異表達的基因中，選擇可能具有一定臨床意義的基因在所有的樣本中進行qRT-PCR驗證。提取的總RNA通過HiScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit（Vazyme）逆轉錄成cDNA，應用AceQ qPCR SYBR?GreenmAstermix（Vazyme）在ABI7500熒光定量PCR儀上進行qRT-PCR。以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參，采用2-ΔΔCt法比較病例組及對照組mRNA的水平。

1.7統計學分析

qRT-PCR實驗每組樣品均設3個復孔，至少重復3遍。采用統計軟件SPSS 11.7進行分析。計量資料以ˉx±s表示，組間差異采用t檢驗（雙側），P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1lncRNA芯片結果

根據該芯片的結果，將子癇前期組和對照組的lncRNA表達譜進行對比，其中1.5倍以上變化，并且差異有統計學意義的lncRNA共有14個，其中表達上調的9個，表達下調的5個（見圖1）。linc-ASCL1-3是上調倍數最多的lncRNA，而linc-EMP1-1則為下調倍數最多的lncRNA（見表2）。

圖1　3例對照胎盤組織和2例病例胎盤組織差異表達的lncRNA聚類分析圖Figure1　Cluster analysis of 14differentially expressedgenes in placentas from 3 control placentas and 2 preeclampsia placentas

表2　基因芯片檢測到的人子癇前期胎盤差異表達lncRNATable2differentially expressed lncRNA in p lacental tissues of the preecalm psia neonatesdetected bym icroarray

2.2mRNA表達譜的芯片結果

將子癇前期組和對照組的芯片結果進行對比，1.5倍以上變化，并且差異有統計學意義的mRNA共有212個，其中表達上調的有93個，表達下調的有119個，其中GPR32是上調倍數最多的mRNA，而FAM26D則為下調倍數最多的mRNA（見表3）。對212個差異表達基因分別進行國際通用的基因本體（GO）功能注釋分析以及KEGG通路富集分析。

2.2.1GO功能注釋分析結果差異表達基因主要染色質結合、γ-谷氨酰轉移酶的活性和SMAD結合的調節等信號途徑，篩選出的GO功能注釋名稱及其基因數見表4。

2.2.2KEGG通路分析結果將差異顯著基因在KEGG數據庫中進行查詢，設定P＜0.05為顯著性標準，差異表達基因中有細胞周期相關、補體和凝血級聯反應相關和全身性紅斑狼瘡相關等信號通路相關作用的基因，篩選出的生物學通路名稱及其基因數見表5。

表3　基因芯片檢測到的人子癇前期胎盤差異表達mRNATable3　differentially expressedmRNA in placental tissuesof the preecalmpsia neonatesdetected bym icroarray

表4　差異表達基因的GO功能注釋結果Table4　gO enrichm ent analysis ofdifferentially expressedgenes

表5　差異表達基因的KEGG通路及其基因數Table5　KEGG pathways andgenes number ofdifferentially expressedgenes

2.3qRT-PCR驗證差異表達基因的結果

選取芯片中表達有差異的3個lncRNA:linc-ROBO1-3、linc-KLF6-2和linc-ASCL1-3進行qRTPCR驗證，以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參，應用qRT-PCR技術在18例病例組胎盤和20例對照組胎盤中進行驗證。結果表明，linc-ASCL1-3在病例組胎盤組織中的表達水平顯著高于對照組，與對照組相比表達上調2.72倍；而linc-ROBO1-3和linc-KLF6-2在病例組中的表達水平低于對照組，與對照組相比分別表達下調2.21倍和11.25倍，其結果與基因芯片技術檢測結果基本相符（見表6）。

表6　差異表達的qRT-PCR驗證結果（ˉx±s）Table6　Confirmation ofdifferentially expressed lncRNA byrT-PCR（ˉx±s）

3　討論

子癇前期是妊娠期特有的嚴重并發癥，可引起全身多器官功能損害以及功能的衰竭，如循環系統、神經系統、內分泌系統和泌尿系統等，是導致孕產婦以及圍產兒死亡的主要原因，一直是產科研究的重點［7］。對于子癇前期的病因有多重學說，涉及母體、胎盤和胎兒等多種因素，包括滋養細胞侵襲異常、內皮細胞損傷、炎癥反應、免疫調節功能異常、遺傳因素和營養因素等［8-10］，然而至今發病機制不明。近年來，非編碼RNA（noncodingrNA，ncRNA）的功能研究越來越引起人們的重視，許多研究表明這些非編碼RNA在調控基因表達的轉錄和翻譯過程中扮演了關鍵的角色［11］。其中microRNA在子癇前期中的作用已經被廣泛研究，已經發現miR-155、miR-210和miR-34a等在子癇前期的發生中有重要作用［12-14］。近年來的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的調控過程。哺乳動物基因組序列中4%-9%的序列產生的轉錄本是lncRNA，而相應的參與蛋白編碼RNA的比例是1%。lncRNA的異常可以導致多種疾病，越來越多的證據顯示lncRNA在子癇前期的發生中也發揮了重要作用，然而對子癇前期中lncRNA的研究很少，僅有一篇關于子癇前期胎盤lncRNA表達譜的報道［15］，其中LOC391533，LOC284100，CEACAMP8在子癇前期樣本中高表達。另外Zou等［16］報道，lncRNA SPRY4-IT1在子癇前期胎盤中表達顯著降低，并且在胎盤滋養層HTR-8/SVneo細胞系中SPRY4-IT1的過表達顯著降低了細胞的遷移和增殖，同時促進了細胞的凋亡，首次在細胞水平中證明了lncRNA在子癇前期的作用。又有文章闡明lncRNAmALAT-1在子癇前期胎盤中表達顯著降低，在JEG-3細胞中促進了細胞的凋亡［17］，下調lncRNAmEG3的表達可以抑制滋養層細胞的遷移，并且引起細胞的凋亡［18］。

本研究通過lncRNA芯片技術，發現子癇前期胎盤中差異表達的lncRNA共14個，其中表達上調的9個，表達下調的5個；差異表達的mRNA 212個，其中表達上調的有93個，表達下調的有119個。擴大樣本量對linc-ASCL1-3、linc-KLF6-2和linc-ROBO1-3進行了qRT-PCR檢測，其結果與基因芯片技術檢測結果相符。linc-KLF6-2全長43 129bp，位于10號染色體（4242829-4285957，“-”鏈）包含2個外顯子；linc-ASCL1-3全長2 586bp，位于12號染色體（102707354-102709939；“+”鏈）包含2個外顯子；linc-ROBO1-3全長9 169bp，位于3號染色體（80810391-80819559，“-”鏈）包含3個外顯子，但是關于它們的功能以及在子癇前期中的作用還需要進一步的研究。

子癇前期胎盤中差異表達的mRNA共212個，其中GPR32是上調倍數最多的mRNA，而FAM26D則為下調倍數最多的mRNA。GO功能注釋結果表明，染色質結合相關的基因差異表達最明顯，主要有CENPA，SOX2，CDCA5，TOP2A，SUV39H2。KEGG通路分析結果表明，細胞周期相關基因差異表達最明顯，主要有CCNB1，CCNB2，PLK1，DBF4，CHEK1，CDC20。lncRNA在轉錄后基因調節的多個水平發揮作用，有研究證實lncRNA通過與特異性靶點mRNA的堿基配對可以促進mRNA的降解，從而改變mRNA的水平［19］。而在子癇前期中lncRNA的差異表達如何影響相關的mRNA水平，從而導致子癇前期的發生還需要進一步的研究。

綜上所述，本研究認為子癇前期患者的胎盤組織與正常孕婦胎盤組織相比，lncRNA表達譜發生了顯著變化，這些lncRNAs可能與子癇前期的發生發展有關。而這些lncRNAs是否可以成為預測的標記物或者治療的靶點，還需要進一步功能的研究。

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Investigation on thedifferentially expressed long non-codingrNAs in preeclampsia placenta

SUN Jian1，SUN Qingmei2#，CHEN Ying3，ZHUQin1，WANGYun1*（1department ofObstetrics，Nanjingmedical University Affiliated Suzhouhospital，Suzhou 215002，China；2Jinhuahealth-center of Shengli Petroleum Administration；3department of Neonatology，Nanjingmedical University Affiliated Suzhouhospital；#Co-first author；*Corresponding author，E-mail:wangyun_204@126.com）

Objective Toexplore therelationship between lncRNAs and preeclampsia through screening andValidating thedifferentially expressed long non-codingrNA（lncRNA）in preeclampsia placenta.Methods The lncRNA andgene expression profilesweredetected in 18 preeclampsia placentas and 20 normal placentas by Affymetrixmicroarray.Gene ontology（GO）enrichment analysis and KEGG pathway analysiswere carried out to screen thegenes and pathwaysrelated to preeclampsia.Differentially expressed lncRNAs were further confirmed by quantitativereal-time PCR（qRT-PCR）.Results A total of 14 lncRNAs weredifferentially expressed，of which 9 were up-regulated and 5 weredown-regulated.And 212genesweredifferentially expressed，ofwhich 93 were up-regulated and 119 weredown-regulated.GO enrichment analysis of the 212genes indicated that thedifferentially expressedgenes wererelated to chromatin binding，gamma-glutamyltransferaseactivity and SMAD binding，etc，and KEGG pathway analysisshowed that thedifferentially expressedgeneswere involved in cell cycle，comp lement and coagulation cascades and systemic lupus erythematosus pathway，etc. Significantlydifferentially expressed lncRNAs，linc-ASCL1-3，linc-KLF6-2 and linc-ROBO1-3 were chosen for further confirmation by qRT-PCR，and theresultswere consistentwith that ofmicroarray.Conclusion Compared with normal controls，lncRNAs profiles in preeclampsia placenta aredifferentially expressed，which indicate that thesedifferentially expressed lncRNAsmight play arole in thedevelopment of preeclampsia.

preeclampsia；long non-codingrNA；microarray

R714.24

A

1007-6611（2016）04-0333-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.04.008

江蘇省自然科學基金資助項目（BK20131151）；蘇州市臨床診療技術專項基金資助項目（LCZX201308）；蘇州市臨床醫學中心（SZZX201505）；蘇州市產業技術創新專項基金資助項目（SYS2015104，SYS201568）；蘇州市科教興衛資助項目（KJXW2015022）

孫健，男，1983-10生，碩士，助理研究員，E-mail:sunjiangoal@163.com

2016-01-20