Rab1A siRNA對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其分子機(jī)制

段　釗，公丕軍，杜　娟，付麗麗（西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安710004；通訊作者，E-mail:duanzhao8 @163.com）

Rab1A siRNA對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其分子機(jī)制

段釗*，公丕軍，杜娟，付麗麗（西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安710004；*通訊作者，E-mail:duanzhao8 @163.com）

目的觀察Rab1A對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響并探討其分子機(jī)制。方法應(yīng)用siRNA干擾Rab1A基因表達(dá)，將HeLa細(xì)胞分為空白對照組、陰性對照組和Rab1A siRNA組，空白對照組不做處理，陰性對照組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA。Rab1A siRNA組轉(zhuǎn)染Rab1A特異性siRNA。MTT比色法分析Rab1A對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響；采用流式細(xì)胞儀分析對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響；Western blot觀察Rab1A siRNA對Cyclind1、GRP78、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響。結(jié)果與陰性對照組相比，Rab1A siRNA組HeLa細(xì)胞的Rab1AmRNA和蛋白的表達(dá)均顯著下調(diào)；Rab1A siRNA抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖；與陰性對照組相比，Rab1A siRNA組HeLa細(xì)胞的S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05），G1/G0期細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P ＜0.05），Rab1A siRNA組HeLa細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡顯著增加（P＜0.01）；Rab1A siRNA組與陰性對照組相比，Cyclind1和Bcl-2在蛋白水平的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），GRP78和Bax在蛋白水平的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。結(jié)論Rab1A通過調(diào)控Cyclind1的表達(dá)促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖，通過調(diào)控GRP78、Bcl-2和Bax表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。

Rab1A；宮頸癌；HeLa細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

宮頸癌是世界范圍內(nèi)最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果，涉及細(xì)胞生長發(fā)育、分化、衰老、凋亡、以及基因改變等復(fù)雜過程［1］。目前，傳統(tǒng)治療方法如手術(shù)切除、化學(xué)治療、放射治療等的治療效果仍不盡人意。宮頸癌的發(fā)生涉及癌基因/抑癌基因的異常激活/雜合性丟失、免疫改變、表觀遺傳學(xué)改變等，是一個復(fù)雜的多因素、多階段網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程。因此，從分子水平闡述宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，將為宮頸癌的治療提供理論依據(jù)和新的分子靶標(biāo)。

癌變細(xì)胞的功能障礙在一定程度上可能與囊泡運輸系統(tǒng)失常、蛋白質(zhì)無法到達(dá)目的地有關(guān)。因此，囊泡運輸調(diào)節(jié)者Rab家族在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演著非常重要的角色。Culine等［2］研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)實體腫瘤患者的血液中Rab2蛋白過量表達(dá)，并且隨著治療過程的進(jìn)展，這種過量表達(dá)逐步得到改變。這為Rab蛋白參與腫瘤疾病的免疫提供了證據(jù)。劉芳莉等［3］研究發(fā)現(xiàn)，Rab5A在具有高轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973中高表達(dá)，在低轉(zhuǎn)移潛能的母系A(chǔ)GZY83-a中低表達(dá)，且在非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移過程中涉及到RabsA基因的調(diào)控改變。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Rab1A與直腸癌等腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)［4，5］。然而Rab1A與宮頸癌的關(guān)系尚未報道。本研究應(yīng)用siRNA沉默Rab1A基因表達(dá)，分析對人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響，觀察細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclind1表達(dá)的變化，探討Rab1A促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株及主要試劑

人宮頸癌細(xì)胞系HeLa由西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究實驗中心保存。新生小牛血清與RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibico公司；MTT、RnaseA、胰蛋白酶、碘化丙啶（PI）購于美國Sigma公司；AnnexinⅤ-FITC凋亡試劑盒購于美國BD Bio-Science公司；Lipofectamine2000和Trizol購自美國Invitogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；兔抗人Rab1A單克隆抗體、兔抗人GRP78單克隆抗體、兔抗人Cyclind1多克隆抗體、兔抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Bax單克隆抗體、小鼠抗人β-Actin單克隆抗體均購于美國Cell Signaling公司；RIPA裂解液購于碧云天公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購于美國Pierce公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.3siRNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞

Rab1A siRNA sense:5'-GGAAACCAGUGCUAAGAAUTT-3'，antisense:5'-AUUCUUAGCACUGGUUUCCTT-3'；negative siRNA（NC-siRNA，sense:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，antisense:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；由上海吉瑪公司設(shè)計、合成。將HeLa細(xì)胞分為空白對照組、陰性對照組和Rab1A siRNA組，空白對照組不做處理，陰性對照組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA，Rab1A siRNA組轉(zhuǎn)染Rab1A特異性siRNA。根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，將HeLa細(xì)胞用無抗生素含血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸，接種于96或6孔板中，置37℃孵箱中培養(yǎng)。將siRNA瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，在無血清、無抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)4-6h，換新鮮的含10%血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72h分別檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡。

1.4MTT比色法檢測Rab1A siRNA對HeLa細(xì)胞增殖的影響

HeLa細(xì)胞以1×105個/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μl，次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實驗分為陰性對照組（NC-siRNA 60nmol/L）和MeCP2 siRNA（60nmol/L）組。每組均為5個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后再培養(yǎng)24，48，72h，每孔加入5mg/mlmTT溶液20μl，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入150μldMSO，震蕩5min，在POLARstar+OPTIMA微板測試儀上檢測光吸收值，檢測波長為492nm。

尿素市場依舊高報低走，下游成交跟進(jìn)氛圍較差，商家謹(jǐn)慎采銷。局部裝置依舊處于輪流檢修或轉(zhuǎn)產(chǎn)液氨，現(xiàn)貨供應(yīng)量微降。農(nóng)業(yè)剛需清淡，下游工業(yè)隨行就市。預(yù)計近期市場震蕩微調(diào)為主，重點關(guān)注新單采購流向及裝置變化。

1.5流式細(xì)胞儀檢測Rab1A siRNA對HeLa細(xì)胞周期的影響

轉(zhuǎn)染48h時收集HeLa細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌2次。用250μl PBS重懸細(xì)胞，緩慢加入750μl無水乙醇，其終濃度為75%，4℃過夜固定；用PBS洗滌1次；再加入0.3ml濃度為100μg/ml的RnaseA（無DNase）重懸細(xì)胞；加入0.3ml濃度為100μg/ml PI染液，混合均勻，室溫避光孵育15min；用流式細(xì)胞儀（FACS）檢測，其激發(fā)波長為488nm，PI的紅色熒光通過630nm的濾光片收集，用BD FACSort Cellquect軟件獲取數(shù)據(jù)，用Modfit LT軟件來分析DNA含量。

1.6流式細(xì)胞儀檢測Rab1A siRNA對HeLa細(xì)胞凋亡的影響

收集轉(zhuǎn)染48h的HeLa細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌2次。用300μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞。加100μl的細(xì)胞懸液入5ml流式管中，分別加入5μ1 AnnexinⅤ/FITC和5μl 20μg/ml的碘化丙錠，混合均勻，室溫避光孵育15min。在流式管中加入400μl PBS。用流式細(xì)胞儀檢測，光源為488nm氬離子激光器，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光，PI發(fā)紅色熒光，結(jié)果用隨機(jī)軟件進(jìn)行分析。

1.7real time PCR檢測轉(zhuǎn)染Rab1A siRNA時HeLa細(xì)胞中Rab1AmRNA變化

在轉(zhuǎn)染48h的細(xì)胞中加入適當(dāng)Trizol裂解細(xì)胞。用氯仿、異丙醇、75%的乙醇提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄，用總RNA 2.0μg，oligo（dT）18 1μl（0.5μg），5×Buffer 4μl，10mmol/LdNTP 2μl，RNasin 0.5 μl，補(bǔ)去離子水至18μl，M-MuLV 2μl。37℃，90min；70℃，10min；終止反應(yīng)。依據(jù)人HeLa細(xì)胞MeCP2序列，設(shè)計real time PCR引物。Rab1A上游引物:5'-GGGAAAACAATCAAGCTTCAAA-3'，Rab1A下游引物:5'-CTGGAGGTGATTGTTCGAAAT-3'；β-actin上游引物:5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，β-actin下游引物:5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。real time PCR擴(kuò)增條件:94℃變性2min，按94℃30 s，60℃30 s，72℃60 s×30個循環(huán)，于72℃延伸10min。用2-ΔΔCt法對real time PCR的結(jié)果相對定量分析，2-ΔΔCt表示干擾組相對于陰性對照組的擴(kuò)增倍數(shù)。

1.8免疫蛋白印跡分析沉默Rab1A對Cyclind1、GRP78表達(dá)和Bcl-2/Bax凋亡通路的影響

收集轉(zhuǎn)染48h的細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。變性后取50μg蛋白，在10%十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，按照分子量大小切取條帶，用10%脫脂奶粉室溫震蕩封閉1h，分別加入Rab1A兔單克隆抗體（1∶1 000稀釋）、GRP78兔單克隆抗體（1∶1 000稀釋）、Cyclind1兔多克隆抗體（1∶1 000稀釋）、Bcl-2兔單克隆抗體（1∶1 000稀釋）、Bax兔單克隆抗體（1∶1 000稀釋）、β-actin鼠單克隆抗體（1∶3 000稀釋），在4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，10min/次。用HRP標(biāo)記的羊抗兔/羊抗鼠二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育4h，TBST洗膜3次，10min/次。加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光劑，在Syngeneg Box凝膠成像儀中拍照。應(yīng)用英國SYNGENE公司的GeneTools軟件分析，計算條帶的積分光密度（opticdensity，OD）值，進(jìn)行半定量分析。

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件繪圖。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗均重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染Rab1A siRNA后HeLa細(xì)胞中Rab1A表達(dá)下調(diào)

在宮頸癌HeLa細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Rab1A siRNA后，與陰性對照組相比，siRNA干擾組Rab1AmRNA表達(dá)量減少為（28.2±4.1）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見圖1A），而陰性對照組與空白對照組相比無顯著性差異；同時，siRNA干擾組Rab1A蛋白表達(dá)與陰性對照組相比也顯著下調(diào)（P ＜0.01，見圖1B，C）。說明siRNA有效的沉默了Rab1A表達(dá)。

圖1　轉(zhuǎn)染Rab1A siRNA后HeLa細(xì)胞中Rab1A表達(dá)的變化Figure1　The changes ofrab1A expression inheLa cells after transfected withrab1A siRNA

2.2沉默Rab1A對HeLa細(xì)胞增殖的影響

應(yīng)用MTT比色法分析了沉默Rab1A表達(dá)24，48，72h對宮頸癌時對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖活力的影響。與陰性對照相比，沉默Rab1A 48，72h均顯著降低了HeLa細(xì)胞的增殖活力（P＜0.01）；沉默Rab1A 24h與陰性對照組之間無顯著差異（見圖2）；陰性對照組與空白對照組相比無顯著差異；提示沉默Rab1A表達(dá)可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖。

2.3沉默Rab1A對HeLa細(xì)胞周期的影響

對培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染Rab1A siRNA 48h，消化分散為單細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。沉默Rab1A組與陰性對照組相比，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.05），S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05），G2/M期細(xì)胞數(shù)量也有減少（見圖3）；而陰性對照組與空白對照組無顯著性差異，表明沉默Rab1A將宮頸癌HeLa細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制。

圖2　MTT比色分析沉默Rab1A對HeLa細(xì)胞增殖的影響Figure2　Effectofrab1A silencing onheLa cell proliferation bymTT assay

圖3　沉默Rab1A對HeLa細(xì)胞周期的影響Figure3　Effectofrab1A silencing on cell cycle ofhe-La cells

2.4沉默Rab1A對HeLa細(xì)胞凋亡的影響

在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Rab1A siRNA 48h，將其消化分散為單細(xì)胞懸液，應(yīng)用AnnexinⅤ+PI試劑盒染色，流式細(xì)胞儀檢測分析。陰性對照組早期凋亡細(xì)胞為（5.54±2.21）%；晚期凋亡細(xì)胞為（3.55± 1.84）%。與陰性對照組相比，沉默Rab1A組早期凋亡細(xì)胞顯著增加（P＜0.01），為（22.56±3.07）%；晚期凋亡細(xì)胞也明顯增加（P＜0.01），為（14.88± 2.62）%，陰性對照組與空白對照組相比無顯著性差異（見圖4）。

圖4　沉默Rab1A對HeLa細(xì)胞凋亡的影響Figure4　Effect ofrab1A silencing on apoptosis ofheLa cells

2.5沉默Rab1A對HeLa細(xì)胞Cyclind1、GRP78表達(dá)和Bcl-2/Bax凋亡通路的影響

應(yīng)用Western blot分析沉默Rab1A對宮頸癌HeLa細(xì)胞內(nèi)Cyclind1表達(dá)和Bcl-2/Bax凋亡通路的影響。應(yīng)用Cyclind1、GRP78、Bcl-2和Bax的光密度積分值分別與內(nèi)參β-actin的光密度積分值相比來表示其表達(dá)變化，達(dá)到了半定量分析的目的。結(jié)果顯示，沉默Rab1A后Cyclind1和Bcl-2表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.01，見圖5A，B，D），而GRP78和Bax表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.01，見圖5A，C，E），陰性對照組與空白對照組相比各蛋白無顯著變化。

3　討論

Rab1A屬于Rab家族成員，Rab家族是與蛋白囊泡運輸有關(guān)的重要效應(yīng)分子，自從1983年首次發(fā)現(xiàn)Rab蛋白以來，目前已發(fā)現(xiàn)的人類Rab蛋白約70個，其主要作用和蛋白的運輸密切相關(guān)［6-8］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Rab蛋白與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9］，例如在舌癌中的Rab1A的表達(dá)增加［10］，甲狀腺腺癌中Rab5a與Rab7的表達(dá)增加［11］，乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、以及侵襲性乳腺腫瘤的Rab25的表達(dá)增加［12-14］。體外研究發(fā)現(xiàn)，Rab25的高表達(dá)可致使乳腺癌細(xì)胞與卵巢癌細(xì)胞的增殖活性、對外界環(huán)境的抵抗力以及抗腫瘤藥物的能力均增加，當(dāng)采用siRNA沉默Rab25的表達(dá)后，上述兩種腫瘤細(xì)胞的增殖活性均明顯下降，并且凋亡增加［15］。本研究結(jié)果顯示，采用siRNA沉默Rab1A表達(dá)后，宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖活力顯著下降，說明了Rab1A可促進(jìn)HeLa細(xì)胞增殖。

細(xì)胞周期中從G1到S期的轉(zhuǎn)換是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的主要節(jié)點，在細(xì)胞跨越G1/S節(jié)點后，將依照細(xì)胞周期內(nèi)部的程序進(jìn)行，逐漸回到G1期前［16］。M期細(xì)胞的比例大小，則表明處于增殖分裂期細(xì)胞的多少。S期細(xì)胞所占比例大小，表明開始新一輪DNA復(fù)制合成的細(xì)胞數(shù)量的多少。本研究表明，當(dāng)Rab1A siRNA處理HeLa細(xì)胞后，細(xì)胞的DNA復(fù)制合成與細(xì)胞分裂顯著的減少。Cyclind1為細(xì)胞周期中G1/S轉(zhuǎn)換過程中重要的調(diào)節(jié)因子，能夠和Cdk4、Cdk6結(jié)合形成蛋白激酶復(fù)合體調(diào)控細(xì)胞跨越G1/S期節(jié)點，進(jìn)入S期。本研究發(fā)現(xiàn)，siRNA沉默Rab1A表達(dá)后，Cyclind1的表達(dá)顯著下調(diào)。這說明Rab1A能夠調(diào)控Cyclind1的表達(dá)，使細(xì)胞跨越G1/ S期節(jié)點，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated proteins -78，GRP78）屬于熱休克蛋白70家族成員，其在促進(jìn)蛋白質(zhì)加工、成熟以及維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［17］。多種擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的刺激均能夠誘導(dǎo)GRP78表達(dá)。在未折疊蛋白反應(yīng)過程中，GRP78的誘導(dǎo)表達(dá)對應(yīng)激細(xì)胞抵抗凋亡和恢復(fù)正常功能具有重要的意義。本研究的結(jié)果顯示，沉默Rab1A表達(dá)，能夠促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞中GRP78表達(dá)維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激穩(wěn)定。Rab25可通過調(diào)節(jié)影響B(tài)cl-2與磷脂酰激醇3-激酶（PI-3-K）的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生抗凋亡現(xiàn)象［18］。在卵巢癌上皮細(xì)胞中Rab25的過表達(dá)不僅可減少Bax蛋白和Bak蛋白的表達(dá)（它們可誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞的凋亡），Rab25表達(dá)的減少則使Bax蛋白和Bak蛋白表達(dá)增加［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌中沉默Rab1A表達(dá)，則Bcl-2的表達(dá)顯著下調(diào)，而Bax的表達(dá)顯著上調(diào)，細(xì)胞凋亡增加。說明Rab1A可通過調(diào)控Bcl-2/Bax表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞凋亡。

總之，Rab1A可通過上調(diào)Cyclind1的表達(dá)促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞的DNA復(fù)制與合成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖；同時抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡發(fā)生。這將有助于對宮頸癌發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步了解，為宮頸癌的治療提供了新的分子靶點。

圖5　沉默Rab1A對Cyclind1、GRP78表達(dá)和Bcl-2/Bax凋亡通路的影響Figure5　Effect ofrab1A silencing on Cyclind1 andgRP78 expression and the Bcl-2/Bax apoptosis pathway

［1］Shi JF，Canfell K，LewJB，et al.The burden of cervical cancer in China:synthesis of the evidence［J］.Int J Cancer，2012，130 （3）:641-652.

［2］Culine S，Honore N，ClossonV，et al.A smallgTP-binding protein is fTequently overexpressed in peripHeral bloodmononuclear cells from patients with solid turnouts［J］.Eur JCancer，1994，30A（5）:670-674.

［3］劉芳莉，高凌寒，李鈺，等.RAB5A正義表達(dá)載體對兩種人肺腺癌細(xì)胞系黏附基底膜成分能力的影響［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001，35:327-329.

［4］Thomas JD，Zhang YJ，Wei YH，etal.Rab1A isanmTORC1 activator and a colorectal oncogene［J］.Cancer Cell，2014，26（5）: 754-769.

［5］Sun T，Wang X，HehH，et al.MiR-221 promotes thedevelopment of androgen independence in prostate cancer cellsViadownregulation ofhECTD2 andrAB1A［J］.Oncogene，2014，33 （21）:2790-2800.

［6］Hutagalung AH，Novick PJ.Role ofrabgTPases inmembrane traffic and cell physiology［J］.Physiolrev，2011，91（1）:119-149.

［7］Takai Y，Sasaki T，Matozakin T.SmallgTP-binding proteins［J］. Physiolrev，2001，81（1）:153-208.

［8］Stenmarkh.RabgTPases as coordinators ofVesicle traffic［J］. Natrevmol Cell Biol，2009，10（8）:513-525.

［9］Chia W，Tang B.Emergingroles forrab familygTPases inhuman cancer［J］.Biochem Biophys Acta，2009，1795（2）:110-116.

［10］Shimadal K，Uzawa K，Katom，et al.Aberrant expression ofrAB1A inhuman tongue cancer［J］.Br JCancer，2005，92（10）:1915-1921.

［11］Calvo A，Xiao N，Kang J，et al.Alterations ingene expression profilesduring prostate cancer progression:functional correlations to tumorigenicity anddownregulation of selenoprotein-P inmouse andhuman tumors［J］.Cancerres，2002，62（18）:5325-5335.

［12］Croizet-Berger K，Daumerie C，Couvreurm，et al.The endocytic catalysts，Rab5a andrab7，are tandemregulators of thyroidhormone production［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（12）: 8277-8282.

［13］Mor O，Nativ O，Stein A，et al.Molecular analysis of transitional cell carcinoma using cDNAmicroarray［J］.Oncogene，2003，22 （48）:7702-7710.

［14］Sorlie T，Tibshiranir，Parker J，et al.Repeated observation of breast tumor subtypes in independentgene expressiondata sets ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（14）:8418-8123.

［15］Liu J，Yangg，Thompson-Lanza JA，et al.Ageneticallydefinedmodel forhuman ovarian cancer［J］.Cancerres，2004，64（5）: 1655-1663.

［16］Liu KJ，Hoopes PJ，Rolett EL，et al.Effect of anesthesia on cerebral tissue oxygen and cardiopulmonary parameters inrats［J］. Adv Expmed Biol，1997，411:33-39.

［17］Lee AS.Theglucose-regulated proteins:stress induction and clinical applications［J］.Trends Biochem Sci，2001，26（8）:504-510.

［18］MillsgB，Lu Y，F(xiàn)ang X，etal.Therole ofgenetic abnormalities of PTEN and the phosphatidylinositol 3-kinase pathway in breast and ovarian tumorigenesis，prognosis，and therapy［J］.Semin Oncol，2001，28（5 Suppl16）:125-141.

［19］WeiMC，ZongWX，Cheng EH，et al.Proapoptotic BAX and BAK: Arequisitegateway tomitochondrialdysfunction anddeath［J］. Science，2001，292（5517）: 727-730.

Effects ofrab1A siRNA on proliferation and apoptosis of cervical cancerheLa cell line and itsmolecularmechanism

DUAN Zhao*，GONG Pijun，DU Juan，F(xiàn)U Lili（Department of Obstetrics andgynecology，Second Affiliatedhospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China；*Corresponding author，E-mail:duanzhao8@163.com）

Objective To investigate the effects ofrab1A on the proliferation and apoptosis of cervical cancerheLa cell line and itsmolecularmechanism.Methods The siRNA interference was used to knockdownrab1A.HeLa cells weredivided into threegroups:blankgroup，negative controlgroup andrab1A siRNAgroup.ControlsiRNA andrab1A-targeted siRNA were transfected intoheLa cells in negative controlgroup andrab1A siRNAgroup，respectively.MTT assay was used to analyze the effects ofrab1A on proliferation of cervical cancerheLa cells.The effects ofrab1A on the cell cycle and apoptosis of cervical cancerheLa cellswere observed by flowcytometry.The effects ofrab1A siRNA on the expression of Cyclind1，GRP78，Bcl-2 and Baxwere analyzed by Western blot.Resultsrab1AmRNA and protein expression significantlydecreased inrab1A siRNAgroup compared to negative controlgroup（P＜0.01）.Rab1A siRNA inhibited the proliferation of cervical cancerheLa cells.The number of S phase cells significantlydecreased inrab1A siRNAgroup compared to negative controlgroup（P＜0.05），meanwhile the number ofg1/G0phase cells significantly increased（P＜0.05）.The number of early apoptotic cells and late apoptotic cells significantly increased inrab1A siRNAgroup compared to negative controlgroup（P＜0.01）.Cyclind1 and Bcl-2 protein expression significantlydecreased inrab1A siRNAgroup compared to negative controlgroup（P＜0.01），whilegRP78 and Bax protein expressionremarkably increased（P＜0.01）.Conclusionrab1AmAy promote the proliferation of cervical cancerheLa cells throughregulating Cyclind1 expression，and inhibit the apoptosis bygRP78，Bcl-2 and Bax expression.

Rab1A；cervical cancer；Hela cell line；proliferation；cell cycle；apoptosis

R737.33

A

1007-6611（2016）04-0319-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.04.005

陜西省自然科學(xué)基金資助項目（2013JM4012）

段釗，男，1973-04生，博士，副主任醫(yī)師，E-mail:duanzhao8@163.com

2016-02-01