氣相色譜法測定人胎盤肝細胞生長素中有機溶劑殘留量

霍建富，連建科，申云飛，張慧蘭（山西康寶生物制品股份有限公司技術中心，長治046000；通訊作者，E-mail:hjf19690320@163.com）

氣相色譜法測定人胎盤肝細胞生長素中有機溶劑殘留量

霍建富*，連建科，申云飛，張慧蘭（山西康寶生物制品股份有限公司技術中心，長治046000；*通訊作者，E-mail:hjf19690320@163.com）

目的建立人胎盤肝細胞生長素中乙醇、乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、正己烷有機溶劑殘留量毛細管氣相色譜測定法。方法采用DB-WAX毛細管柱（30m×0.320mm×0.50μm），載氣為氮氣，氫火焰離子化檢測器（FID檢測器），以四氫呋喃為內標檢測人胎盤肝細胞生長素中有機溶劑殘留量。結果乙醇、乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、正己烷5種有機溶劑的含量分別在10.08-201.6μg/ml，9.964-199.28μg/ml，10.012-200.24μg/ml，10.036-200.72μg/ml，0.586-11.72μg/ml的范圍內與峰面積具有較好的線性關系，檢測限分別為1.05μg/ml，0.39μg/ml，0.52μg/ml，0.81μg/ml，0.06μg/ml；平均回收率分別為98.14%，97.81%，98.60%，98.84%，99.64%。精密度實驗相對標準偏差（RSD）均小于2.0%。結論該方法靈敏、準確，可用于人胎盤肝細胞生長素中有機溶劑殘留量的測定。

人胎盤肝細胞生長素；有機溶劑殘留量；毛細管氣相色譜法

健康人胎盤制品的研究和臨床使用已有悠久的歷史［1，2］，但作為靜脈注射藥物治療早期肝硬化和慢性活動性肝炎還不多見。為此，我們研究了作為治療用新生物制品的人胎盤肝細胞生長素（肝復康），由于該藥在提取過程中使用了乙醇、乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、正己烷，而這些殘留溶劑對人體有毒害和致癌作用［3，4］。因此為保證產品的質量，控制產品中有機溶劑的殘留量十分重要，本研究根據溶劑的性質和初步分離的結果，建立了毛細管氣相色譜的方法，測定人胎盤肝細胞生長素中5種有機溶劑的殘留量，方法準確可靠。

1　試劑與儀器

1.1試劑

人胎盤肝細胞生長素（山西康寶生物制品股份有限公司，批號:20140101、20140102、20140103）；乙醚（色譜純，上海阿拉丁化學試劑有限公司）；正己烷（色譜純，天津市北科化學品有限公司）；四氫呋喃、乙醇（色譜純，天津市凱通化學試劑有限公司）；乙酸乙酯、乙酸甲酯、N，N-二甲基甲酰胺（色譜純，上海阿拉丁化學試劑有限公司）；純化水，山西康寶生物制品股份有限公司。

1.2儀器

GC2010 Plus型氣相色譜儀（日本島津公司）；GA-380A型低噪音空氣泵（北京中興江利科技發展有限公司）；GH-300型高純氫發生器（北京中興江利科技發展有限公司）；F-502型頂空進樣器（北京北分瑞利分析儀器有限責任公司）；DB-WAX型（30m×0.320mm×0.50μm）毛細管色譜柱（Agilent technologies）；FID檢測器；AE240電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

2　方法與結果

2.1色譜條件

2.1.1氣相色譜條件DB-WAX毛細管柱（30m ×0.320mm×0.50μm），柱溫:程序升溫35℃保持1min，以3℃/min升溫至50℃，保持2min；以25℃/min升溫至200℃，保持5min；進樣口溫度: 230℃；檢測器溫度:230℃；載氣:高純氮3ml/min；燃氣:氫氣40ml/min；空氣300ml/min。

2.1.2頂空條件參考文獻［5，6］，頂空瓶平衡溫度90℃；平衡時間30min；傳輸線溫度100℃；頂空瓶加壓時間0.2min；進樣時間1min；進樣體積1ml。

2.2溶液配制

2.2.1內標溶液的配制精密稱取四氫呋喃適量，用純化水配制成1ml含四氫呋喃0.1mg的內標溶液。

2.2.2對照品溶液分別精密稱取乙醇、乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、正己烷各適量，參考文獻［3，4］溶媒，用N，N-二甲基甲酰胺稀釋制成每1ml中約含乙醇5mg、乙醚5mg、乙酸甲酯5mg、乙酸乙酯5mg、正己烷0.29mg的溶液，作為貯備溶液。精密量取貯備溶液和內標溶液各5ml到20ml頂空瓶中密封作為對照品溶液。

2.2.3供試品溶液精密量取人胎盤干細胞生長素樣品和內標溶液各5ml到20ml頂空瓶中密封作為供試品溶液。

2.2.4貯備溶液分別精密稱取乙醇、乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、正己烷各適量，參考文獻［3，4］溶媒，用N，N-二甲基甲酰胺稀釋制成每1ml中約含乙醇5.040mg、乙醚4.982mg、乙酸甲酯5.006mg、乙酸乙酯5.018mg、正己烷0.293mg的溶液，作為貯備溶液。

2.3專屬性試驗

取空白溶劑乙醇、乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、正己烷、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺分別進樣。乙醇、乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、正己烷、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺峰的保留時間分別為4.205，0.996，1.842，2.409，0.931，2.141，9.691min。

取空白溶劑乙醇、乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、正己烷及四氫呋喃的混合物進樣，色譜圖見圖1。從圖1可以看出，各溶劑間分離度良好，空白溶劑對測定無干擾。

圖1　五種殘留溶劑分離度氣相色譜圖Figure1　Gas chromatogramgraph ofresoluiton for the fiveresidual solvents

2.4線性關系

精密量取2.2.4項下貯備溶液0.2，0.4，1.0，1.0，1.0，2.0ml，分別置100ml，100ml，200ml，100ml，50ml，50ml，量瓶中，用純化水稀釋，分別制成含不同濃度乙醇（10.08，20.16，25.20，50.40，100.80，201.60μg/ml）、乙醚（9.964，19.928，24.910，49.820，99.640，199.280μg/ml）、乙酸甲酯（10.012，20.024，25.030，50.060，100.120，200.240μg/ml）、乙酸乙酯（10.036，20.072，25.090，50.180，100.360，200.720μg/ml）、正己烷（0.586，1.172，1.465，2.930，5.860，11.720μg/ml）的溶液。按2.1項下的色譜條件頂空進樣，以對照峰面積（A1）與內標峰面積（A2）之比對對照品濃度（C1）與內標濃度（C2）之比進行線性回歸。線性方程及相關系數見表1。結果表明，各溶劑線性關系良好。

2.5檢測限

取各溶劑，精密稱定，用25%N，N-二甲基甲酰胺逐步稀釋，按信噪比為3∶1進行試驗。乙醇、乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、正己烷的檢出限分別為1.05，0.39，0.52，0.81，0.06μg/ml。

2.6精密度試驗

取2.2.1項下對照品溶液重復進樣6次，測得乙醇、乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、正己烷與內標四氫呋喃的峰面積比的RSD值分別為1.02%，0.93%，1.05%，0.98%，1.16%，均小于2.0%，說明該方法精密度好。

2.7回收率試驗

精密量取本品（批號:20140101）5ml，共9份，分別各置于10ml量瓶中，分別加入2.2.3項下貯備溶液0.4，0.5，0.6ml，各3份，用內標溶液定容，搖勻，使其濃度分高、中、低三個檔次，作為供試品溶液。按2.1項下的色譜條件頂空進樣，計算回收率及相對標準偏差，結果見表2-6。

表2　乙醇回收率試驗結果Table2　The ethanolrecovery testresult

表3　乙醚回收率試驗結果Table3　The ethyl etherrecovery testresult

從表2-6實驗結果看出，高、中、低三種不同濃度的加樣回收率乙醇在97.47%-98.74%之間，平均回收率為98.14%；乙醚在97.14%-98.29%之間，平均回收率為97.81%；乙酸甲酯在97.74%-99.33%之間，平均回收率為98.60%；乙酸乙酯在97.41%-99.56%之間，平均回收率為98.84%；正己烷在97.44%-101.36%之間，平均回收率為99.64%；均符合試驗要求，相對標準偏差均小于2.0%，說明該方法的準確度好。

2.8樣品檢測

取三批樣品（20140101，20140102，20140103）按2.1項下的方法測定殘留有機溶劑，結果見表7。

表4　乙酸甲酯回收率試驗結果Table4　Themethyl acetaterecovery testresult

表5　乙酸乙酯回收率試驗結果Table5　The ethyl acetaterecovery testresult

表6　正己烷回收率試驗結果Table6　The n-hexanerecovery testresult

表7　三批樣品中有機溶劑殘留量測定結果Table7　Thedetectionresult ofresidual solvents in three batches of samples

3　討論

在人用藥物注冊技術要求國際協調會（ICH）的有機溶劑殘留量指導原則中，規定正己烷為第二類應該限制使用的溶劑，本文參照中國藥典2010年版二部的指標要求［7］，規定待測溶劑正己烷的限度為0.029%。雖然乙醇、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯均為第三類溶劑，毒副作用很小，但還是應該控制，規定限度為0.5%，從測定結果看，三批樣品中這5種溶劑均未檢出，符合藥典要求。

本試驗應用DB-WAX毛細管色譜柱，采用程序升溫，使5種有機溶劑得到完全分離，35℃保持1min，讓沸點低的溶劑乙醚、正己烷析出，3℃/min升溫至50℃，讓乙酸甲酯、四氫呋喃（內標）、乙酸乙酯、乙醇依次分離，25℃/min升溫至200℃，保持5min，讓沸點高雜質溶劑沖出柱子，以確保試驗準確，選用四氫呋喃做內標不僅可以和待測組分有效分離，又能避免由于進樣體積誤差對測定結果的影響，從而獲得比外標法較好的測定精密度和回收率［8，9］。

頂空時間要確保供試品溶液氣-液相達到平衡，頂空時間不易過長，一般為30-45min，過長時可能導致頂空瓶的氣密性變差，過短達不到平衡效果，經試驗摸索，本試驗選擇30min。

本文采用了內標法對人胎盤干細胞生長素注射劑中乙醇、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、正己烷5種殘留溶劑進行測定，并就該測定方法進行了方法學研究。研究結果表明該方法簡便、靈敏、重現性好，可用于控制本品中殘留溶劑的含量。

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Determ ination ofresidual organic solvents inhuman p lacentalhepatocytegrowth factors bygas chromatography

HUO Jianfu*，LIAN Jianke，SHEN Yunfei，ZHANGhuilan（Technical Centreof ShanxiKangbao Biological ProductCO.Ltd，Changzhi046000，China；*Corresponding author，E-mail:hjf19690320@163.com）

Objective To establish a capillarygas chromatography（GC）method fordetermining the contents of ethanol，ethyl ether，methyl acetate，ethyl acetate，n-hexane inhuman p lacentalhepatocytegrowth factor.MethodsgC was performed todetermine theresidual organic solvents ondB-WAX capillary column（30m×0.320mm×0.50μm）with FIDdetector，nitrogen as carriergas，and tetrahydrofuran as internal standard.Results The calibration curve showed agood linearity in therangesof10.08-201.6μg/ml for ethanol，9.964-199.28μg/ml for ethyl ether，10.012-200.24μg/ml formethyl acetate，10.036-200.72μg/ml for ethyl acetate，and 0.586-11.72μg/ml for n-hexanerespectively.Theminimumdetectable quantity was 1.05μg/ml，0.39μg/ml，0.52μg/ml，0.81μg/ml，0.06μg/ml for ethanol，ethyl ether，methyl acetate，ethyl acetate，n-hexane，respectively，and the averagerecoverywas 98.14%，97.81%，98.60%，98.84%，99.64%.The precisionrSD was less than 2.0%.Conclusion Thismethod is sensitive and accurate for thedetermination ofresidual organic solvents inhuman placentalhepatocytegrowth factor.

human placentalhepatocytegrowth factor；residual organic solvent；capillarygas chromatography

R927.2

A

1007-6611（2016）04-0348-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.04.011

霍建富，女，1969-03生，本科，工程師，E-mail:hjf19690320@163.com

2016-01-04