M IF降低子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液巨噬細(xì)胞的運動速度

李　建，胡玉紅，張　燕（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，佳木斯154000；通訊作者，E-mail:liam jiam@gmail. com）

M IF降低子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液巨噬細(xì)胞的運動速度

李建，胡玉紅*，張燕（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，佳木斯154000；*通訊作者，E-mail:liam jiam@gmail. com）

目的探討巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）對子宮內(nèi)膜異位癥（EMT）患者腹腔液中巨噬細(xì)胞運動的影響。方法選取2015-03～2015-10在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科行腹腔鏡手術(shù)治療的EMT和子宮肌瘤患者（對照組）各30例。采用腹腔鏡囊腫穿刺針于手術(shù)操作前抽取腹腔液5ml。運用光學(xué)顯微鏡觀察4h內(nèi)巨噬細(xì)胞的運動情況，使用Cell Sense Standard軟件每2min對運動情況進(jìn)行圖像記錄。Image J軟件計算巨噬細(xì)胞的運動速率。ELISA法測定腹腔液中MIF的濃度。結(jié)果與子宮肌瘤患者相比，EMT患者腹腔液中巨噬細(xì)胞的運動速率顯著降低（P＜0.05），其在月經(jīng)周期增殖期的運動速率低于分泌期，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。EMT患者腹腔液中MIF的濃度顯著高于對照組（P＜0.001），其在增殖期的水平高于分泌期，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。EMT患者腹腔液中MIF濃度與巨噬細(xì)胞的運動速率呈負(fù)性相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。結(jié)論EMT患者腹腔液中MIF的異常表達(dá)使巨噬細(xì)胞的遷移運動受抑制，間接參與EMT患者腹腔液巨噬細(xì)胞的增加過程，巨噬細(xì)胞被MIF滯留于盆腔并活化，與MIF共同參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病。

子宮內(nèi)膜異位癥；腹腔液；巨噬細(xì)胞移動抑制因子；速度

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMT）在育齡期女性的發(fā)病率約10%，臨床主要表現(xiàn)為慢性進(jìn)行性加重盆腔痛、不孕，合并不孕的幾率可高達(dá)50%［1］。EMT雖為良性病變，卻表現(xiàn)出惡性腫瘤的生物學(xué)行為，如浸潤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等［2］，EMT發(fā)病涉及激素、基因、免疫調(diào)控等多種因素［3］。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體腹腔免疫系統(tǒng)最為關(guān)鍵的細(xì)胞成分被發(fā)現(xiàn)在EMT患者的腹腔液中顯著增加［4］。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）被認(rèn)為是引起EMT患者腹腔液巨噬細(xì)胞聚集的重要因子之一，而一種與細(xì)胞遷移運動密切相關(guān)的因子—巨噬細(xì)胞移動抑制因子（macrophagemigration inhibitory factor，MIF）在EMT患者腹腔液也顯著增加［5］。MIF是一種主要由活化T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，最初被發(fā)現(xiàn)可抑制體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的遷移，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)其在血管生成、腫瘤形成和許多炎性、自身免疫性疾病中也發(fā)揮作用，是一種多功能細(xì)胞因子，許多研究表明MIF在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過程中扮演著重要角色［6-8］。對于MIF是否會通過降低腹腔液中巨噬細(xì)胞的運動速率，從而使巨噬細(xì)胞滯留于腹腔，間接參與EMT患者腹腔中巨噬細(xì)胞的聚集過程，目前尚缺乏相關(guān)研究，故本實驗通過測定腹腔液中巨噬細(xì)胞的運動速率及MIF的濃度，分析腹MIF對巨噬細(xì)胞運動速率的影響，為MIF間接增加EMT患者腹腔液巨噬細(xì)胞數(shù)目提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1一般資料

選取2015-03～2015-10于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科行腹腔鏡手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜異位癥患者41例，以其中術(shù)后病理證實為卵巢巧克力囊腫患者30例為實驗組，平均年齡（34.5±8.1）歲，處于月經(jīng)周期增殖期者17例，分泌期13例。另選取同期我科收治的子宮肌瘤患者50例，以其中行腹腔鏡手術(shù)治療者30例為對照組，平均年齡（32.5± 9.6）歲，處于月經(jīng)周期增殖期者18例，分泌期12例。兩組患者年齡、身高、體重等一般情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn):所有患者均未絕經(jīng)，既往月經(jīng)規(guī)律；無婦科內(nèi)分泌、生殖道炎癥、免疫系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤史；術(shù)前6個月未使用任何激素類、抗生素及Gn-RH類似物治療；子宮內(nèi)膜無其他病理改變；無前次內(nèi)異癥手術(shù)史。研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1腹腔液采集及處理采用腹腔鏡囊腫穿刺套針，術(shù)中進(jìn)入腹腔后未進(jìn)行任何操作時采集腹腔液5ml，剔除穿刺過程中被血液污染標(biāo)本。將采集的標(biāo)本置于冰盒轉(zhuǎn)移至實驗室。將1.0ml轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌EP管中，以5 000r/min速度4°C下離心10min，取上清液分裝置-80℃冰箱保存?zhèn)錅y。余下腹腔液轉(zhuǎn)移至15ml無菌管，以1 200r/min于4℃下離心5min，取2ml上清液置于培養(yǎng)皿，立即在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2觀察巨噬細(xì)胞運動使用萊卡光學(xué)倒置顯微鏡（LEICAdMI 4000B）在10×40倍視野（視野中包含3個及以上巨噬細(xì)胞）下觀察單細(xì)胞懸液中巨噬細(xì)胞的運動，使用Cellsens Standard軟件控制圖像采集儀器，使其每2min自動采集1幀圖像，觀察時間共4h。

1.2.3計算巨噬細(xì)胞運動速率使用Image J圖像分析軟件對圖像進(jìn)行分析處理，通過Manual-Tracking插件對巨噬細(xì)胞的運動軌跡進(jìn)行追蹤并計算出其運動速率，取所有巨噬細(xì)胞運動速率的均值作為腹腔液巨噬細(xì)胞的運動速率。

1.2.4測定MIF濃度腹腔液中MIF蛋白的濃度采用ELISA法測定，試劑盒購自美國Cloud-Clone Corp公司，操作嚴(yán)格遵循說明書進(jìn)行，在450nm處測吸光值，取2次測量結(jié)果的均值作為MIF蛋白的濃度。1.2.5數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析使用SPSS17.0軟件包進(jìn)行，腹腔液中巨噬細(xì)胞運動速率和MIF蛋白濃度測定結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢驗后符合正態(tài)性分布，結(jié)果采用ˉx±s表示，獨立樣本間比較采用t檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1巨噬細(xì)胞的運動速率

與對照組相比，EMT患者腹腔液中巨噬細(xì)胞的運動速率顯著降低（P＜0.05，見圖1），隨月經(jīng)周期改變略有變化，在月經(jīng)周期的增殖期，巨噬細(xì)胞的運動速率要略低于分泌期，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1　兩組患者腹腔液中巨噬細(xì)胞運動的速率Figure1　ThemigrationVelocities ofmAcrophages in peritoneal fluid in twogroups

2.2MIF蛋白濃度

與肌瘤患者相比，EMT患者腹腔液中MIF蛋白的濃度顯著增加（P＜0.005，見表1）。MIF蛋白濃度在增殖期略高分泌期，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1　兩組患者腹腔液中MIF 水平比較Table1　Comparison of levels of MIF in peritoneal fluid between two groups

表1　兩組患者腹腔液中MIF 水平比較Table1　Comparison of levels of MIF in peritoneal fluid between two groups

與對照組比較，*P＜0.005

分組n 增殖期分泌期對照組30 3.53±0.47*3.17±0.89*EMT組30 8.79±0.92 7.46±1.31

2.3MIF蛋白濃度與巨噬細(xì)胞運動速率的關(guān)系

MIF蛋白濃度與巨噬細(xì)胞運動速率的相關(guān)性分析采用Pearson法，統(tǒng)計結(jié)果顯示EMT患者腹腔液中MIF蛋白濃度和巨噬細(xì)胞的運動速率之間呈現(xiàn)負(fù)性相關(guān)（r=-0.785，P＜0.01），對照組患者二者間的相關(guān)性分析顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義（r= -0.146，P＞0.05，見圖2）。

圖2　兩組患者腹腔液MIF蛋白濃度和巨噬細(xì)胞運動速率間的線性關(guān)系Figure2　Correlation between the level ofmIF and themigrationVelocity ofmacrophage in eachgroup

2.4單細(xì)胞懸液中巨噬細(xì)胞的運動圖像

單細(xì)胞懸液中巨噬細(xì)胞的運動圖像見圖3，EMT組中的巨噬細(xì)胞，多處于輕微晃動狀態(tài)，細(xì)胞突起少或無，胞體缺乏極性，胞膜未見明顯偽足伸出，而子宮肌瘤組中的巨噬細(xì)胞則處于游走狀態(tài)，細(xì)胞突起多，極性明顯，胞膜可見明顯的偽足伸出。

圖3　巨噬細(xì)胞分別在0，20，40，60min時的運動圖像（×1000）Figure3　Macrophagemigration photos at 0，20，40，60min（×1 000）

3　討論

細(xì)胞遷移是多種生理病理過程的前提，傷口愈合、免疫、炎癥反應(yīng)、感染和癌癥轉(zhuǎn)移等生理現(xiàn)象均涉及細(xì)胞遷移。細(xì)胞的遷移受到細(xì)胞骨架重構(gòu)、黏著斑、胞外信號通路等多種過程的精細(xì)調(diào)控，其中Rho家族GTP酶（Rho family ofgTPases）在細(xì)胞遷移信號傳導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要的協(xié)調(diào)作用［9，10］。MIF是目前發(fā)現(xiàn)可抑制巨噬細(xì)胞遷移的重要因子，Hoover等［11］研究發(fā)現(xiàn)MIF可通過失活Rho-GTP酶介導(dǎo)細(xì)胞遷移抑制，MIF可先激活隨后失活RhoA、Rac1、CDc42等分子，在缺乏MIF經(jīng)典受體CD74的情況下，MIF也可與替代受體CXCR4結(jié)合介導(dǎo)遷移抑制效應(yīng)［12］。CDC42屬于Rho家族小分子GTP酶，在細(xì)胞遷移過程中主要起確定方向和協(xié)調(diào)胞質(zhì)前部肌動蛋白聚合的作用，CDC42受抑制后可導(dǎo)致細(xì)胞突起、胞體極性形成受阻，進(jìn)而影響細(xì)胞的遷移。這些均與我們實驗過程中所觀察到的EMT組巨噬細(xì)胞缺乏突起和極性，胞膜未見明顯偽足等結(jié)果一致。

MIF通過失活巨噬細(xì)胞胞膜上的Rho-GTP酶，從而介導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移抑制，使腹腔液中巨噬細(xì)胞的運動速率顯著降低，巨噬細(xì)胞被滯留，是MIF參與EMT腹腔液巨噬細(xì)胞數(shù)目增加的間接證據(jù)，與MCP-1共同作用使巨噬細(xì)胞在腹腔液中聚集。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示MIF濃度與巨噬細(xì)胞運動速率間呈負(fù)相關(guān)，表明MIF濃度越高，巨噬細(xì)胞遷移被抑制越顯著，其被滯留的機(jī)率越高。MIF的濃度在月經(jīng)周期增殖期高于分泌期，故巨噬細(xì)胞的運動速率在增殖期要略低于分泌期。既往研究表明腹腔液中巨噬細(xì)胞的數(shù)目隨月經(jīng)周期的改變會發(fā)生相應(yīng)的變化［5］，經(jīng)期過后其數(shù)目上升，也就是說增殖期時腹腔液中的巨噬細(xì)胞數(shù)目要高于分泌期，與巨噬細(xì)胞運動速率變化的時間呈一致性。這些結(jié)果間接表明MIF抑制巨噬細(xì)胞的遷移，共同參與腹腔液巨噬細(xì)胞的聚集，在EMT的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果顯示在月經(jīng)周期的增殖期腹腔液中MIF的濃度略高于分泌期，而美國學(xué)者M(jìn)ahutte等［13］研究結(jié)果顯示MIF的濃度在分泌期會略高于增殖期。除試劑用品差異外，二者在實驗方法、標(biāo)本采集上基本一致，故可除外實驗方法學(xué)差異。2010 年Lin等［14］采用FQ-PCR法定量MIF在內(nèi)膜組織mRNA的表達(dá)及免疫組化法測定MIF蛋白，結(jié)果表明MIF蛋白和mRNA的表達(dá)在增殖期高于分泌期，此外MIF的mRNA在不同月經(jīng)周期的表達(dá)存在統(tǒng)計學(xué)差異。近來研究也表明MIF基因表達(dá)的多態(tài)性是東、西方人群某些疾病患病率及發(fā)病風(fēng)險差異的原因之一［15］，這提示EMT患者的MIF基因表達(dá)也可能存在東、西方差異，這可能是本研究結(jié)果與Mahutte等［13］結(jié)論矛盾的主要原因。此外，研究表明MIF可活化子宮內(nèi)膜異位病灶處的芳香化酶促進(jìn)雌激素高表達(dá)，而雌激素也可促進(jìn)MIF表達(dá)，二者間形成一個正反饋通路。在增殖期雌激素水平增加，在雌激素的作用下MIF表達(dá)增加，也可能使其在增殖期的濃度高于分泌期。此外，MIF還具有促血管生成、活化巨噬細(xì)胞特性，EMT患者腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞的聚集及活化在EMT發(fā)病過程中起重要作用，活化的巨噬細(xì)胞分泌功能增強，其分泌的大量促炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子（VEGF、TNF、IL、MIF等）均被發(fā)現(xiàn)在EMT發(fā)病中扮演不同的角色，這些因子和MIF及其介導(dǎo)的信號通路在EMs的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用［16］。關(guān)于MIF在EMT發(fā)病中的作用及其臨床意義仍有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，MIF可能通過介導(dǎo)Rho家族GTP酶失活進(jìn)而發(fā)揮巨噬細(xì)胞遷移抑制作用，間接參與EMT盆腔巨噬細(xì)胞的聚集。MIF還可活化滯留的巨噬細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞與MIF共同參與EMT發(fā)病的病理生理過程。

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M acrophagem igration inhibitor factordecreases themacrophagem igrationVelocity in peritoneal fluid of patients with endometriosis

LIJian，HU Yuhong*，ZHANG Yan（Departmentofgynecology and Obstetrics，F(xiàn)irst Affiliatedhospital of JiamusiUniversity，Jiamusi 154000，China；*Corresponding author，E-mail:liam jiam@gmail.com）

Objective To explore the effectofmacrophagemigration inhibitor factor（MIF）onmacrophagemotion in peritoneal fluid of patientswith endometriosis.Methods Thirty patientswith endometriosis and thirty patientswith uterinemyoma（controlgroup）were enrolled in First Affiliatedhospital of JiamusiUniversity frommArch to October2015.Cell sense standard softwarewas used to observemAcrophagemovement，and the cellmigration image wasrecorded every 2m in for 4h in total.MacrophagemotionVelocity was calculated using Image Jsoftware.ELISA was used tomeasure the peritoneal fluidmIF.Results ThemigrationVelocities ofmacrophages in peritoneal fluid of patientswith endometriosisweremarkedlydecreased compared with patientswith uterinemyoma（P＜0.05）.MigrationVelocities were alsohigher in secretory phase patients than in proliferative phase patients，but thedifference was not statisticallydifferent（P＞0.05）.The concentration ofmIF in the peritoneal fluid washigher in patientswith endometriosis than that in women with uterinemyoma（P＜0.001）.ThemigrationVelocity ofmacrophagewas negatively correlated with the level ofMIF in peritoneal fluid of patientswith endometriosis（P＜0.01）.Conclusion Theresult suggestsmIF abnormal expressionmAy inhibit themAcrophagemigration，which is indirectly involved in themAcrophages accumulation in peritoneal fluid of patients with EMT.Macrophages areretained and activated bymIF，andmIF and the activatedmAcrophages contribute to thedevelopment of endometriosis.

endometriosis；peritoneal fluid；macrophagemigration inhibitory factor；velocity

R711.71

A

1007-6611（2016）04-0373-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.04.017

佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新資助項目（LM-2015-020；佳木斯大學(xué)重點項目（SZ-2014-008）

李建，男，1987-10生，在讀碩士，E-mail:451061134@qq.com

2016-01-28