自建HBV-DNA實時熒光定量PCR檢測系統性能驗證方法及結果分析

辛　娜，楊　超，白跳艷，王永鋒，康　煒（西安醫學院第一附屬醫院檢驗科，西安710077）

自建HBV-DNA實時熒光定量PCR檢測系統性能驗證方法及結果分析

辛娜，楊超，白跳艷，王永鋒，康煒（西安醫學院第一附屬醫院檢驗科，西安710077）

目的探討自建乙型肝炎病毒核酸（HBV-DNA）實時熒光定量PCR檢測系統性能驗證的方法和程序，充分了解其檢測性能，評估并確認分析性能是否符合預期用途。方法參考美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）頒布的EP系列文件及中國合格評定國家認可委員會（CNAS）對實驗室檢測系統評估的要求，對實驗室自建的HBV-DNA實時熒光定量PCR檢測系統進行精密度、正確度、線性范圍、檢測下限等性能參數的驗證和評價。結果HBV-DNA定量檢測低值和高值的批內精密度CV分別為3.4%和1.8%，總精密度CV分別為3.8%和1.8%。正確度初次驗證有兩項不符合要求，經廠家校準后重新驗證符合要求。線性回歸方程為Y=0.997X+0.012，R2=0.999，線性范圍為500-108IU/ml。檢測下限為500IU/ml。結論自建HBV-DNA實時熒光定量PCR檢測系統的性能符合要求，能夠應用于臨床檢測。

HBV-DNA；實時熒光定量PCR；檢測系統；性能驗證

近年來，臨床實驗室質量保證的概念逐步地進入我們的臨床檢驗實踐，臨床檢驗已經進入到一個規范化和標準化的時代，ISO15189和CAP認可要求中明確指出臨床實驗室在開展某一檢測項目前需進行方法學認證，充分了解其檢測性能，評估并確認分析性能是否符合預期用途。有專家指出不同的檢測項目和檢測系統需選擇不同的方法學驗證程序［1］。實時熒光定量PCR檢測涉及多個環節，程序繁瑣，手工操作步驟多，性能評價的實驗設計及數據分析相比生化、免疫、臨檢等領域尚無權威機構發布的成熟方法。本研究參考美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）頒布的EP系列文件及中國合格評定國家認可委員會（CNAS）《醫學實驗室質量和能力認可準則在基因擴增檢驗領域的應用說明》，對實驗室自建的HBV-DNA實時熒光定量PCR檢測系統進行精密度、正確度、線性范圍、檢測下限等性能參數的驗證和評價，現報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

HBV-DNA工作標準品來自配套試劑盒，HBVDNA高值和低值標本來自本科室收集的臨床標本，陰性血清為臨床乙肝三系全陰性標本。所有標本均為無溶血、脂血等富含大量PCR抑制物的標本，分離血清后當天收集并于-20℃保存備用。

1.2儀器

Roche LightCycler1.5熒光定量PCR儀，科大創新HC-2518高速離心機，杭州奧盛K30B干式恒溫金屬浴，上海FINNPIPITTE 0.2-10μl，5-50μl，20-200μl移液器。所有分析設備和輔助設備均在校準效期內。

1.3試劑

采用上海科華生物工程股份有限公司提供的有效期內乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（批號: 15010112）。

1.4人員

由具有檢驗醫學職業資質且取得PCR上崗證的操作人員嚴格按照SOP文件操作。

1.5方法

1.5.1精密度評價參照EP15-A2文件［2］，取HBV-DNA低值和高值2個水平樣本，每天分析一個批次，每個水平重復測定4次，連續檢測5d，每個水平累計得到20個數據，參照文獻［3］計算批內精密度變異系數（CV批內）和總精密度（CV總）。以能力驗證/室間質評評價界限（靶值±0.4對數值）作為允許總誤差（TEa），重復性精密度＜3/5 TEa，中間精密度小于＜4/5 TEa為符合要求。

1.5.2正確度評價測定試劑盒配套標準品（批號:15010112）共4個濃度水平，分別測3次取均值，分別計算偏倚，根據ISO15189對性能參數的相關要求，以允許偏倚≤1/3室間質評允許總誤差為判斷標準。1.5.3線性范圍驗證參照EP6-A文件［4］，取臨床高濃度標本用陰性血清進行系列梯度稀釋（1∶10，1∶100，1∶1 000，1∶10 000，1∶100 000）至廠家聲明的線性范圍下限，每個濃度標本檢測3次取均值，與預期值比較，計算線性相關系數和線性范圍，R2＞0.95為符合要求。

1.5.4定量檢測下限驗證取試劑盒配套標準品（3.0×104）進行系列梯度稀釋，稀釋至低于試劑說明書聲明的檢測下限，每個稀釋標本重復檢測10次，至少有9次檢出為符合要求。

1.5.5質控每次實驗均做室內質控，根據Westgard多規則質控方法，當質控結果在控時，實驗數據才能采用，否則應重新檢測。

1.5.6統計學處理所有數據均將初始濃度值進行對數轉化后計算，使用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析。線性范圍驗證時，對實測值與理論值進行線性回歸分析。

2　結果

2.1精密度評價

HBV-DNA低值和高值的批內精密度CV （CV批內）分別為3.4%和1.8%，總精密度CV（CV總）分別為3.8%和1.8%，小于廠家聲明的10%。同時以能力驗證/室間質評評價界限（靶值±0.4對數值）作為允許總誤差（TEa），重復性精密度＜3/5 TEa，中間精密度小于＜4/5 TEa分別計算允許的CV，均在允許范圍內（見表1），驗證通過。

表1　HBV-DNA精密度評價結果Table1　The precision ofhBV-DNA

2.2正確度評價

以4個不同水平標準品的濃度為理論值，自建系統檢測結果與其相對偏倚（見表2）。以允許偏倚≤1/3室間質評允許總誤差為判斷標準。初次正確度評價有兩項結果不符合要求，分析原因并對儀器校準后重新進行正確度評價，結果符合要求（見表3）。

表2　HBV-DNA正確度評價結果Table2　The correctness ofhBV-DNA

表3　校準后HBV-DNA正確度評價結果Table　3 The correctness ofhBV-DNA after calibration

2.3線性范圍驗證

本研究收集到的最高濃度的標本為5.19×107IU/ml，對其連續10倍稀釋進行線性范圍的驗證，樣本梯度稀釋檢測結果見表4，梯度稀釋結果線性分析見圖1。線性回歸方程為Y=0.997X+0.011，R2=0.999，證實檢測系統在5.19×102-5.19×107IU/ml范圍呈線性，在廠家聲明的線性范圍500-108IU/ml內。

表4　樣本梯度稀釋檢測結果Table4　Thegradientdilutionresults ofhBV-DNA

圖1　線性范圍驗證回歸曲線Figure1　Theregression curve of linearrangeVerification

2.4定量檢測下限驗證

試劑說明書聲明的檢測下限為500IU/ml，結果顯示在500IU/ml時10個標本全部檢出，符合廠家聲明，結果見表5。

3　討論

HBV-DNA實時熒光定量PCR檢測是慢性HBV感染診斷、治療適應證選擇及抗病毒療效判斷的重要指標。目前大多數臨床基因擴增實驗室均開展該檢測項目，但所用儀器、試劑不盡相同，且多為自建檢測系統，除了常規開展室內質量控制、室間質量評價外，并未對其分析性能進行深入研究，對相關性能參數不了解，無法保證實驗結果的準確性。

臨床基因擴增檢測的實驗步驟較多，包括標本的分離保存、處理、檢測，手工程度較高，相比傳統的生化、免疫項目，整個過程自動化程度普遍偏低，較多依賴手工，不同的實驗室條件和操作者等因素對實驗結果的影響較大，尚未建立公認的質量管理標準等。方法學驗證一直是國內分子檢驗行業比較薄弱的部分，臨床分子檢驗從業人員對驗證的概念和具體實施不甚明了。2013版《醫學實驗室質量和能力認可準則在基因擴增檢驗領域的應用說明》（CNAS-CL36）中首次規定實驗室內部程序檢測項目（如自建檢測系統）應有方法學驗證過程，也首次對商業檢測試劑（包括定量和定性部分）的方法學性能參數做出了規定［5］。13版應用說明的要求與CAP對臨床分子診斷方法學驗證的要求基本一致［6］，為基因擴增檢驗的方法學驗證指明了方向，有助于從業人員正確理解方法學驗證。然而在性能驗證的實驗設計、具體實施及數據分析方面，并未給出具體的方案。縱觀近年來相關文獻報道，其分析性能驗證的方式和判斷依據也存在很多爭議和不統一［7，8］。本研究參考美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）頒布的EP系列文件及2014年修訂的《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》，結合相關文獻報道［9］，對本實驗室自建的HBV-DNA實時熒光定量PCR檢測系統進行性能驗證，是對本實驗室質量控制體系的進一步完善，為臨床基因檢測的規范化應用提供了質量保證，也為其他臨床基因擴增實驗室自建檢測系統性能驗證的常規開展和普及提供了參考。

表5　HBV-DNA定量檢測下限結果Table5　The lowlimit ofdetectionresults of　hBV-DNA

精密度反映檢測結果的一致性，本實驗精密度評價方案參照CLIS的EP15-A2文件給出的簡易方法，得出HBV-DNA定量檢測低值和高值的批內精密度CV分別為3.4%和1.8%，總精密度CV分別為3.8%和1.8%，低于廠家聲明的10%。按照CNAS-CL36文件附錄A基因擴增檢驗項目分析性能標準，重復性精密度＜3/5 TEa，中間精密度小于＜4/5 TEa，說明該檢測系統具有良好的精密度。與相關文獻［10］報道相比，批內精密度和總精密度CV較低。由于PCR實驗涉及大量的手工操作，操作者對實驗結果的影響因素較大，保證良好的精密度存在一定難度。但本實驗工作人員固定，操作嫻熟、規范，人員影響因素相對較小，故而保證了良好的精密度。

正確度性能是檢測系統重要的分析性能之一，根據EP15-A2文件，基本方法是采用試驗方法與參考方法進行比對，評估偏倚。簡易方法是檢測定值參考物。目前PCR檢測項目大都沒有國際公認的試驗方法，選擇參考方法或標準方法進行比對難以操作。本實驗采用試劑盒廠家提供的具有定值的標準物質進行檢測，分別測定4個水平，將檢測結果與說明書定值進行比對，計算偏倚。對于CLIA88中有明確總誤差要求的項目，通常偏倚小于1/2或1/ 3CLIA'88總誤差為最低標準，認為檢測系統的偏倚為臨床可接受水平，檢測系統或方法可應用于臨床。但CLIA'88中對于定量PCR檢測項目的允許總誤差無明確規定，缺少通用的國際標準，本研究以國家衛計委能力驗證/室間質評評價界限（靶值±0.4對數值）作為允許總誤差（TEa），以偏倚小于1/3允許總誤差為評價標準。初次正確度驗證有2個水平超出允許偏倚，結合最近幾次室間質評回饋結果，分析原因為目前使用的Roche LightCycler1.5熒光定量PCR儀使用年限已久，儀器的光學部分和溫控部分可能需要校準。聯系廠家工程師對儀器進行校準后重新對正確度進行驗證，結果合格。

用于線性范圍驗證的標本應覆蓋整個線性范圍［11］，廠家聲明的線性范圍為500-108IU/ml，本研究收集臨床檢測高濃度標本，將該標本用陰性血清連續10倍稀釋，得到涵蓋線性范圍的6個濃度，將實測均值與理論值進行相關分析，回歸方程為Y =0.997X+0.012，R2=0.999，線性關系良好。

定量檢出限的驗證對于PCR檢測項目非常重要。廠家聲明的檢測下限為500 IU/ml，取試劑盒配套標準品（3.0×104）進行系列梯度稀釋，稀釋至低于試劑說明書聲明的檢測下限，每個稀釋標本重復測定10次。結果顯示在500 IU/ml時10個標本全部檢出，250 IU/ml僅檢出7份標本，100 IU/ml、50 IU/ml 10份標本均未檢出，檢測下限符合設定的判斷標準，與廠家聲明的檢測下限一致。

總之，檢測系統性能驗證或評價不僅是相關文件法規的要求，也是質量管理體系的要求，更是檢測指標有良好臨床應用的要求。有關專家對54家醫學實驗室評審結果的不符合項進行分析匯總后指出，實驗室應建立文件化的性能驗證程序，應注意方法學驗證的時機，還應充分考慮驗證方案的科學性［12］。因此，實驗室應加強檢測系統性能驗證的程序化、規范化，保證實驗結果的準確，使開展的檢測項目發揮臨床應有的作用。

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Methods andresults analysis of the perform anceVerification of a self-built PCRdetection system forreal-time fluorescence quantification ofhBV-DNA

XIN Na，YANG Chao，BAITiaoyan，WANG Yongfeng，KANGWei（Department of Clinical Laboratory，First Affiliatedhospital of Xi'anmedical University，Xi'an 710077，China）

Objective To explore themethods and procedures of performanceVerification of a self-built PCRdetection system forrealtime fluorescence quantification ofhBV-DNA for fully understanding the testing performance and Confirming the clinical application.methods According to the EP series ofdocument issued by the National Committee for Clinical Laboratory Standards（NCCLS）andrequirements for the assessment of laboratory testing systems issued by China National Accreditation Service for Conformity Assessment （CNAS），the precision，correctness，linearrange and lowerdetection limit of thedetection system were performed and evaluated.Results The within-batch precision CV of lowvalue andhighValue ofhBV-DNA was3.4%and 1.8%，respectively，and the total precision CV was3.8%and 1.8%，respectively.The correctnesswas within acceptablerange after calibration.The linearregression equation was Y=0.997X+0.012（R2=0.999）.The linearityrange was 500-108IU/ml，and the lowlimit ofdetection was 500 IU/ml.

Conclusion The performance ofreal-time fluorescentquantitative PCRdetection system ofhBV-DNA conforms to therequirements，and can be applied to the clinicaldetection.

hepatitis BVirusdNA（HBV-DNA）；real-time fluorescence quantitative PCR；detection system；performanceVerification

R446

A

1007-6611（2016）04-0365-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.04.015

辛娜，女，1981-09生，碩士，主管檢驗師，E-mail:xnr0919@163.com

2016-01-15