HPLC法測定熊膽汁中牛磺熊去氧膽酸含量的研究

李家泉 鄭昆芳

摘要：目的建立熊膽汁中牛磺熊去氧膽酸含量的HPLC測定方法。方法用甲醇前處理熊膽汁；以十八烷基鍵合硅膠為填料；甲醇-磷酸二氫鈉溶液（0.03 mol/L）（68：32）為流動相，并用磷酸調節pH值為4.4；柱溫40℃；流速1.0 mL/min；進檢測波長為210 nm。結果牛磺熊去氧膽酸進樣濃度在0.1045 mg/mL～1.045 mg/mL之間呈良好的線性關系，r=0.9999，回收率在98%～102%之間，回收率RSD<1.5%。結論方法準確、簡便、快速，可為熊膽汁的檢測及監控提供技術依據和支持。

關鍵詞：熊膽汁；HPLC法；牛磺熊去氧膽酸；含量測定

中圖分類號：284文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2016）10-0078-03

Study on Taurocholate Ursodeoxycholic Acid Content in Bear Bile by HPLC

LI Jia-quan， ZHENG Kun-fang

（Dali Ruipin Junge Pharmaceutical Co.， Ltd.， Dali 671099， Yunnan）

【Abstract】Objective： To establish a HPLC method to determine taurocholate ursodeoxycholic acid content in bear bile. Methods： Bear bile was pre-treated with methanol. Octadecyl bonded silica was taken as a filler， methanol-sodium dihydrogen phosphate solution （0.03 mol/L） （68：32） as mobile phase， and phosphoric acid was used to adjust to pH 4.4. The column temperature was 40℃， with 1.0 mL/min of flow rate， 210 nm of detection wavelength. Results： The sample concentration of taurocholate ursodeoxycholic acid showed a good linear relationship between 0.1045 mg/mL and 1.045 mg/mL， r=0.9999， with the recovery rate between 98% to 102% and recovery rate RSD <1.5%. Conclusion： The method is accurate， simple and rapid， and can provide a technical base and support for the detection and monitoring of bear bile.

【Key words】bear bile， HPLC method， taurocholate ursodeoxycholic acid， determination

熊科動物黑熊經膽囊手術引流而得熊膽汁經干燥制成的熊膽粉，已收載于1989年試行、1996年轉為國家正式實行的藥品標準[1]，并收載于2015年版《中國藥典》附錄，作為天然熊膽的替代品入藥。牛磺熊去氧膽酸（TCDCA）是熊膽粉主要有效和特有成分，故熊膽粉藥品標準中規定TUDCA的含量不得低于23%。但熊膽粉藥品標準中未對其原料熊膽汁中TUDCA含量的測定方法作出規定。而熊膽汁和熊膽粉中TUDCA含量的測定方法有一定的差異。熊膽汁原料關乎到所制成熊膽粉的質量，對熊膽汁質量的分析和控制是十分重要的，而其TUDCA含量的測定方法沒有報道。本文建立熊膽汁中牛磺熊去氧膽酸含量的HPLC測定方法。方法準確、簡便、快速，為熊膽汁的檢測及監控提供技術依據和支持。

1儀器與試藥

LC98Ⅰ型、LC99Ⅱ型高效液相色譜儀（北京溫分分析技術有限公司）、7725Ⅰ型手動進樣閥、雙通道色譜軟件工作站（浙大智達）、UV98I可變波長紫外檢測器、C18 5μShodex ID4.6×250mm色譜柱（原裝進口）、BCD-176SQMK型美的電冰箱（合肥美的電冰箱有限公司）、SK3300H型超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司）、微孔濾膜（上海津騰）、色譜甲醇（fisher）、牛磺熊去氧膽酸鈉（中國食品藥品檢定研究院，110816-201208，含量91.7%，牛磺熊去氧膽酸換算因子為0.9578）、分析純磷酸二氫鈉（國藥）、分析純甲醇（國藥）、熊膽汁（云南大理瑞品金閣藥業有限公司）。

2方法與結果

2.1色譜條件 以十八烷基鍵合硅膠為填料；甲醇-磷酸二氫鈉溶液（0.03 mol/L）（68：32）為流動相，并用磷酸調節pH值為4.4，柱溫40℃，流速1.0 mL/min，進樣量5 μL，檢測波長為210 nm。理論板數按牛磺熊去氧膽酸峰計算不低于2500。在上述條件下，TUDCA與樣品中其它成分均能完全分離，分離度大于1.5。對照品與樣品圖譜見圖1A、B。

圖1對照品（A）和樣品（B）色譜圖

2.2樣品制備 取新鮮熊膽汁，過120目標準篩，精密量取續濾液0.5 mL置50 mL量瓶中。第一份加甲醇稀釋至刻度，搖勻；第二份加乙醇，稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液，經0.45μm微孔濾膜法過濾后，進樣5μL測定，圖譜見圖2—A、B。

圖2乙醇為稀釋劑對照品（A）和甲醇為稀釋劑對照品（B）色譜圖

通過實驗結果顯示，利用乙醇作為稀釋劑存在拖尾，n<2000；而甲醇作為稀釋劑，峰型尖銳，無拖尾及前沿現象，n>4500，故選擇甲醇作為稀釋劑。

2.3對照品溶液制備取牛磺熊去氧膽酸鈉對照品適量，精密稱定，加甲醇使溶解并定量稀釋制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.4供試品制備取熊膽汁不少于25 mL，過120目標準篩，精密量取續濾液1 mL置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5線性關系考察精密稱取牛磺熊去氧膽酸鈉對照品28.5 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻。再分別精密吸取上述對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0 mL置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻得系列濃度對照品溶液。取系列濃度對照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，按上述方法測定。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，得回歸方程為：

A=281822.207.C-1614.773r=0.9999

結果表明：TUDCA進樣濃度在0.1045 mg/mL～1.045 mg/mL之間呈良好的線性關系。

2.6準確度考察取新鮮熊膽汁，照供試品制備方法制備并測定樣品中牛磺熊去氧膽酸的含量，作為已知濃度的供試品。精密量取已知濃度的供試品溶液0.5 mL置50 mL量瓶中，分別制作3組，每組3份，第1組每份精密加入對照品溶液（精密稱取牛磺熊去氧膽酸鈉對照品284.6 mg，置250 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻。）10.00 mL；第2組每份精密加對照品溶液15.00 mL；第3組每份精密加入對照品溶液20.00 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取5 μL注入液相色譜儀測定，測得供試品中TUDCA的含量為45.22 mg/mL。回收率結果見下表。

2.7.1重復性取新鮮熊膽汁照供試品制備方法制備6份，進樣檢測，測定結果TUDCA的含量分別為45.88、46.01、45.82、45.20、45.94、45.92 mg/mL。平均值為45.8 mg/mL，測定值的RSD為0.59%。結果表明，該方法重復性良好。

2.7.2中間精密度取同一均質熊膽汁，由兩個分析員分別測定，每人測定6份，TUDCA的含量結果如下。

2.8專屬性考察按照供試品制備方法對空白溶液（甲醇）進行處理作為空白組，照上述方法分別測定對照品組、熊膽汁供試品組與空白溶液組，檢測結果顯示，在該方法下，在供試品主峰保留時間±1.0 min內無干擾峰。結果表明，該方法專屬性良好。圖譜見圖3—A、B、C。

2.9耐用性實驗

2.9.1流動相比例變化±5%照供試品制備方法制備供試品，流動相比例按甲醇：磷酸二氫鈉溶液（0.03mol/L）比例變化為：63：37、68：32、73：27分別進行檢測。檢測結果顯示在不同比例下，主峰保留時間分別為13.9～14.0、8.2～8.3、5.9～6.0 min之間。n均大于4000，R均大于1.5。同一供試品TUDCA的含量測定結果分別為43.4、43.0、43.6 mg/mL，三者RSD為0.69%。結果表明，該方法流動相比例耐用性良好。

2.9.2流動相pH值變化±0.2照供試品制備方法制備供試品，流動相用磷酸調節PH值分別為4.2、4.4、4.6進行檢測。檢測結果顯示在不同PH值下，主峰保留時間分別為9.2～9.3、9.5～9.7、9.3～9.5 min之間。n均大于4000，R均大于1.5。同一供試品TUDCA的含量測定結果分別為39.3、39.1、40.0 mg/mL，三者RSD為1.20%。結果表明，該方法流動相PH值耐用性良好。

2.9.3柱溫變化±5℃照供試品制備方法制備供試品，在柱溫35℃、40℃、45℃下分別測定。檢測結果顯示在不同柱溫下，主峰保留時間分別為10.2～10.3、9.7～9.9、8.4～8.6 min之間。n均大于4000，R均大于1.5。同一供試品TUDCA的含量測定結果分別為45.4、45.6、46.1 mg/mL，三者RSD為0.79%。結果表明，該方法柱溫耐用性良好。

2.9.4流速相對值變化±20%照供試品制備方法制備供試品，，在流速為0.8 mL/min、1.0 mL/min 與1.2 mL/min下分別測定。檢測結果顯示在不同流速下，主峰保留時間分別為11.2～11.4、9.9～10.1、7.8～7.9 min之間。n均大于4000，R均大于1.5。同一供試品TUDCA的含量測定結果分別為44.4、45.0、43.8 mg/mL，三者RSD為1.35%。結果表明，該方法流速耐用性良好。

2.10樣品檢測根據上述方法，對連續10天內產出的10批次熊膽汁TUDCA的含量進行了檢測，其結果如下。

3討論

3.1樣品處理方式的選擇本項研究中，熊膽汁樣品分別用甲醇和乙醇進行處理。經對比實驗，得到用甲醇處理優于乙醇處理的實驗結果。熊膽汁樣品處理沒有明確的方法，有的文獻認為需用某些蛋白沉淀劑處理。本項研究用甲醇處理并獲得較好的結果，操作方便快速，簡化了樣品前處理過程，降低了檢測成本，又提高了檢測效率。

3.2流動相組分比例的選擇流動相采用甲醇-磷酸二氫鈉溶液（0.03 mol/L）的比例為68：32，試驗結果TUDCA與樣品中其它成分均能完全分離，分離度大于1.5，主峰保留時間適中，表明流動相的這一組分比例可用于熊膽汁樣品中TUDCA的含量測定。這一組分比例與熊膽粉檢測流動相組分的比例是有一定差異的，比例差異的原因可能與熊膽汁未經過熱處理而熊膽粉受過熱烘干有關。

參考文獻：

[1]衛生部藥品標準新藥轉正標準，熊膽粉，第十一冊，1996，WS3-09（B-09）-96（Z）.