SD-PMA-ddPCR檢測食品中沙門氏菌的研究

王　靜,張慧敏,魏　瑋,賈俊濤,李春喜,秦　燕

(1.威海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,山東威海 264205; 2.山東出入境檢驗檢疫局,山東青島266500)

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SD-PMA-ddPCR檢測食品中沙門氏菌的研究

王靜1,張慧敏1,魏瑋1,賈俊濤2,李春喜1,秦燕1

(1.威海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,山東威海 264205; 2.山東出入境檢驗檢疫局,山東青島266500)

研究將疊氮溴化丙錠(PMA)與微滴數字PCR(ddPCR)技術相結合,建立一種沙門氏菌活菌的檢測方法。結果表明,PMA不能完全有效抑制108CFU/mL的沙門氏菌死菌DNA的PCR擴增,0.1% 脫氧膽酸鈉(SD)和40.0 μg/mL PMA協同作用,可以有效抑制108CFU/mL的沙門氏菌死菌DNA的PCR擴增,不抑制沙門氏菌活菌DNA擴增的PMA最高濃度是40.0 μg/mL。經過SD和PMA對樣品預處理,在不同死、活菌比例下,PMA-ddPCR可以定量檢測活菌,避免了死菌DNA的干擾。本方法的檢出限為8.0 copy/20 μL。利用PMA-ddPCR檢測人工污染雞肉樣品,最低可檢出102CFU/mL的沙門氏菌。實驗結果證明PMA-ddPCR方法的特異性、精確度、穩定性良好。

疊氮溴化丙錠,脫氧膽酸鈉,數字PCR,活菌

隨著社會的發展和人們對健康的關注,食品安全成為影響廣泛的社會性問題。但食源性疾病暴發事件層出不窮,例如美國多次爆發沙門氏菌污染事件,沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌,可使人發生中毒[1-3],主要癥狀有惡心、嘔吐[4-5],嚴重危害人們的身心健康。因此,定量檢測沙門氏菌引起各國的高度關注。

目前,檢測沙門氏菌的方法有很多,比如實時熒光聚合酶鏈式反應[6]、熒光染色[7]等,雖然這些方法相比于傳統培養法有一些優勢[8-9],但是還存在一些無法克服的缺點,諸如操作繁瑣費時,靈敏度低,不能真實反映樣品的污染水平[10-11]。因此,開發定量檢測活菌的方法很有必要。疊氮溴化丙錠(PMA)是一種能和DNA共價交聯的光敏材料,光照可以使PMA的光敏基團轉化為氮賓自由基,其可以和DNA發生共價交聯,進而阻斷DNA分子的PCR擴增,并且PMA只能選擇性的滲透死菌的細胞膜,因此PMA被用于和PCR技術相結合定量檢測活菌[12-15]。但是有研究發現,PMA不能完全抑制死菌DNA的PCR擴增,可能原因是一些受損細菌細胞碎片阻止PMA滲透進入細胞膜[16]。Wang L J等人[17]利用0.1% 脫氧膽酸鈉(SD)處理受損細菌,促進PMA進入死菌細胞內,達到了完全有效抑制死菌DNA的PCR擴增,并且0.1% SD不會對活菌產生影響。

微滴數字PCR(ddPCR)是近年來發展起來的可以定量檢測DNA的新方法,通過PCR擴增和熒光信號的積累讀取陽性微滴數目,再通過泊松分布計算出樣本的DNA分子數目[18-20]。本文首次將PMA與ddPCR技術相結合,開發了高靈敏、高選擇性的檢測食源性致病菌的新方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株為沙門氏菌Salmonella(ATCC13311)南京便診生物科技有限公司;PMA1 mg,美國Biotium公司,溶解于1.0 mL 20%二甲基亞砜(DMSO)溶液,得到1 mg/mL儲備液,于-20 ℃避光保存;細菌基因組DNA提取試劑盒北京Tiangen公司;引物、探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;熒光定量PCR反應體系有關試劑購自羅氏公司;微滴式數字PCR反應體系有關試劑購自美國伯樂公司。

QX200微滴式數字PCR系統美國伯樂公司;7900HT Fast 實時熒光定量PCR(qPCR)系統美國應用生物系統公司;CF16RXII高速冷凍離心機日本日立公司;鹵鎢燈(500 W)飛利浦燈具(上海)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細菌培養及熱滅活菌的制備用接種環沾取甘油管保存的菌液,在營養瓊脂平板上劃線,于37 ℃下培養24 h。挑取單菌落接種于營養瓊脂液體培養基,37 ℃培養至對數生長期。取500 μL菌液沸水浴10 min后,用0.1% SD處理受損細菌,37 ℃條件下溫育20 min后,用40.0 μg/mL的PMA處理,混合均勻后暗處孵育15 min,將離心管置于500 W鹵鎢燈下20 cm處曝光15 min(管口朝上,置于冰上),期間每隔5 min混勻數次,以使樣品溶液曝光均勻。隨后用試劑盒法提取基因組DNA,進行PCR檢測。

1.2.2最佳PMA濃度的選取取500 μL受損細菌于1.5 mL離心管中,利用0.1% SD處理樣品同1.2.1,分別加入PMA終濃度為0.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、50.0 μg/mL,混合體系振蕩5 s后暗處孵育15 min,使PMA最大限度進入受損細胞內。將離心管置于500 W鹵鎢燈下20 cm處曝光15 min(管口朝上,置于冰上)。隨后用試劑盒法提取基因組DNA,進行PCR檢測。取500 μL沙門氏菌活菌作為對照組,處理同實驗組。

1.2.3最佳曝光時間的選取如1.2.1處理熱滅活菌,分別曝光0.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 min,隨后用試劑盒法提取基因組DNA,進行PCR檢測。

1.2.4細菌DNA提取及qPCR和ddPCR檢測本實驗采取試劑盒法得到基因組DNA。分別利用7900HT Fast 實時熒光定量PCR系統和QX200微滴式數字PCR系統進行檢測。參考SN/T 1870-2007合成引物、探針。上游引物(19bp):5′-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3′,下游引物(21bp):5′-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3′,探針:5′-FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-TAMRA-3′。

qPCR反應體系(25.0 μL):12.5 μL LightCycler? 480 Probes Master;10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL;10 μmol/L探針0.5 μL;模板DNA 2.0 μL;最后用DEPC水補充至25.0 μL。qPCR擴增條件為:95 ℃、3 min;94 ℃、5 s,60 ℃、40 s,40個循環,同時收集FAM熒光。將熒光定量PCR測得CT值代入標準線性方程,即可得到所測菌液濃度值。

ddPCR反應體系(20.0 μL):10.0 μL ddPCRTMSupermix for Probes(No dUTP);10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL;10 μmol/L探針0.5 μL;模板DNA 4.0 μL;最后用DEPC水補充至20.0 μL。ddPCR擴增循環條件為:95 ℃,5 min;94 ℃、10 s,60 ℃、45 s,40個循環;98 ℃,10 min。ddPCR數據處理:ddPCR測得濃度值為20.0 μL反應體系中目標基因濃度x(copy/μL),本文中待測菌液濃度值y=5×50x/0.5,其中5為模板(4.0 μL)在反應體系(20.0 μL)中的稀釋倍數;試劑盒法提取DNA洗脫液體積為50 μL;待測菌液體積為0.5 mL。

1.2.5qPCR、PMA-ddPCR、SD-PMA-ddPCR檢測不同比例活菌的比較配制活菌比例為100%、50%、25%、10%、0%的沙門氏菌菌懸液,分別取500 μL于1.5 mL離心管中,在優化條件下,按照試劑盒法提取基因組DNA,進行qPCR、PMA-ddPCR、SD-PMA-ddPCR檢測。

1.2.6SD-PMA-qPCR、SD-PMA-ddPCR檢測沙門氏菌的靈敏度將105CFU/mL的沙門氏菌菌液依次稀釋10倍制得濃度為105、104、103、102、101CFU/mL菌液。在優化條件下,進行SD-PMA-qPCR、SD-PMA-ddPCR分析實驗。

1.2.7SD-PMA-ddPCR的抗干擾性取非沙門氏菌菌株4株(大腸埃希菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌),經培養后菌落濃度達到108CFU/mL,將上述4株干擾菌和108CFU/mL沙門氏菌混合,在優化條件下,進行SD-PMA-ddPCR檢測,分析抗干擾性。

1.2.8SD-PMA-qPCR、SD-PMA-ddPCR檢測人工污染樣品中沙門氏菌取25 g新鮮雞肉樣品,用均質器制成雞肉勻漿,利用108CFU/mL死菌污染雞肉樣品,然后用101～106CFU/mL的沙門氏菌菌液進行人工污染,在優化條件下,進行SD和PMA處理之后,進行SD-PMA-qPCR、SD-PMA-ddPCR檢測。

2　結果與分析

2.1SD和PMA處理死菌的效果

如圖1所示,108CFU/mL熱損傷細菌經過SD和PMA處理之后,其CT值明顯高于僅用PMA處理的實驗組和對照組,說明SD可以進一步破壞死菌的細胞膜,促進了PMA滲透進入死菌細胞膜,從而和DNA共價交聯,阻止了DNA的PCR擴增。

圖1　SD協助PMA進入死菌細胞的影響Fig.1　The effect of SD for PMA to enter dead cells

2.2最佳PMA濃度的優化

如圖2所示,隨著PMA濃度的增大,死菌DNA qPCR擴增的CT值明顯升高,當PMA濃度超過40.0 μg/mL時,反應體系的CT值幾乎不再發生變化。當PMA濃度為50.0 μg/mL時,相比不加PMA，活菌DNA qPCR擴增的CT值略微增加,可能高濃度PMA影響了活菌DNA的qPCR擴增,本研究選用40.0 μg/mL PMA作為最佳濃度。

圖2　PMA 濃度對死菌和活菌的影響Fig.2　Effect of PMA concentration on dead and live bacteria

2.3最佳曝光時間的優化

如圖3所示,隨著光照時間的增加,體系的CT值迅速升高,光照時間超過15.0 min后,體系的CT值不發生明顯變化,本研究選取15.0 min作為最佳光照時間。

圖3　曝光時間對PMA 處理死細胞的影響Fig.3　Optimization of different light exposure time

圖4　不同沙門氏菌濃度下的CT值Fig.4　CT of different Salmonella cells

2.4qPCR檢測沙門氏菌的線性曲線

在0.1% SD、PMA濃度為40.0 μg/mL的條件下,利用qPCR進行了沙門氏菌的檢測。如圖4所示,隨著沙門氏菌含量的增加,CT值明顯降低,CT值與沙門氏菌的濃度在102～108CFU/mL范圍內呈現良好的線性關系(r=0.9949),其線性回歸方程為:y=43.16-3.65x,方程中y代表DNA qPCR擴增的CT值,x代表沙門氏菌的濃度的對數值。該方法的檢測限是102CFU/mL(S/N=3)。

2.5qPCR、PMA-ddPCR、SD-PMA-ddPCR檢測不同比例活菌的比較

將2.6×108CFU/mL活菌、熱滅活菌按照圖5所示比例混合后,在優化條件下,進行qPCR、PMA-ddPCR、SD-PMA-ddPCR檢測。由圖5可見,qPCR測得CT值代入2.4中線性方程計算得出沙門氏菌含量,不論活菌比例如何變化,結果始終為死、活菌的總量;當活菌比例0%時,未經SD處理的菌液進行PMA-ddPCR檢測,依然可以檢出陽性,說明40.0 μg/mL PMA單獨作用下不能完全抑制108CFU/mL死菌的DNA擴增;隨著活菌比例的增加,PMA-ddPCR和SD-PMA-ddPCR檢出結果也相應增加,但是SD-PMA-ddPCR檢出結果與平板計數(Plate count)結果更加接近。

圖5　不同熱滅活時間下qPCR、PMA-ddPCR、SD-PMA-ddPCR沙門氏菌檢測結果Fig.5　The numbers of survivors from qPCR, PMA-ddPCR,SD-PMA-ddPCR

2.6SD-PMA-ddPCR、SD-PMA-qPCR檢測沙門氏菌的靈敏度

將原菌液濃度為2.6×105CFU/mL的沙門氏菌10倍梯度稀釋,分別標記為S5～S1,進行SD-PMA-ddPCR、SD-PMA-qPCR檢測。由圖6一維散點圖上可以看出S1～S5生成的陽性微滴數分布,陽性微滴數目隨著濃度的升高而逐漸增多。ddPCR測得S5～S2的濃度如圖7所示,S1未檢出,S2測得濃度為0.4 copy/μL,因此該方法檢測沙門氏菌基因組DNA的檢出限為8.0 copy/20 μL。如圖8所示,隨著沙門氏菌濃度的稀釋,CT值逐漸變大,PMA-qPCR最少可檢出102CFU/mL的沙門氏菌。

圖6　ddPCR一維散點圖Fig.6　The 1D scatterplot of ddPCR

圖7　ddPCR反應體系(20 μL)中目標基因濃度Fig.7　Concentration of target genes in reaction system of ddPCR(20 μL)

圖8　SD-PMA-qPCR檢測沙門氏菌靈敏度Fig.8　Sensitivity of Salmonella by SD-PMA-qPCR detection

2.7SD-PMA-ddPCR的抗干擾性

在4株108CFU/mL非沙門氏菌(大腸埃希菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌)存在的情況下,SD-PMA-ddPCR檢測沙門氏菌得到的結果與沙門氏菌實際結果相近。

2.8SD-PMA-ddPCR檢測人工污染樣品中沙門氏菌

圖9　檢測人工污染樣本中沙門氏菌的比較Fig.9　Salmonella detection of different methods

對不同菌量人工污染的雞肉樣品在優化條件下進行SD-PMA-qPCR、SD-PMA-ddPCR檢測,如圖9所示,SD-PMA-ddPCR檢測人工污染雞肉樣品,最低可檢出102CFU/mL沙門氏菌,并且與理論添加值相近;而SD-PMA-qPCR測得CT值代入2.4中線性方程計算得出沙門氏菌含量,與理論添加值偏差較大,說明ddPCR對實際樣品的檢測效果優于qPCR。SD-PMA-ddPCR對樣品檢測的RSD均小于5.0%。人工污染死菌的樣本37 ℃下放置兩周,測得樣本的CT值變化小于1.0%。

3　討論與結論

PMA與ddPCR相結合的方法,可以在死菌存在的條件下定量檢測沙門氏菌活菌,消除了“假陽性”結果的出現,SD對樣品預處理,使得PMA更容易穿過死菌細胞膜。SD-PMA-ddPCR整個過程快速簡便,成功檢測雞肉等樣品中沙門氏菌的含量。與SD-PMA-qPCR方法相比,具有準確度高、不需要建立標準曲線等優點,Wang L J等人[16]應用mPCR方法在107CFU/mL熱滅活沙門氏菌存在的條件下,定量檢測雞肉等樣品中的沙門氏菌。本方法把PMA用量增加了4倍,曝光時間增加了3倍,應用SD-PMA-ddPCR在108CFU/mL熱滅活沙門氏菌存在的條件下,定量檢測雞肉等樣品中的沙門氏菌,說明PMA濃度的增加和曝光時間延長可以促進PMA與DNA共價交聯。SD-PMA-ddPCR方法表現出較好的發展空間,可以進一步應用于其他樣品領域的檢測。

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Detection ofSalmonellacells based on SD-PMA-ddPCR

WANG Jing1,ZHANG Hui-min1,WEI Wei1,JIA Jun-tao2,LI Chun-xi1,QIN Yan1

(1.Weihai Entry-exit Inspection and Quarantine Inspection and Quarantine Technology Center,Weihai 264205,China;2.Shandong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao 266500,China)

In this paper,a method to detect liveSalmonellacells was developed based on propidium monoazide(PMA)and ddPCR. The result showed that PMA could not inhibit the DNA PCR amplification of 108CFU/mL deadSalmonellacells,while the combination of sodium deoxycholate(SD)and 40.0 μg/mL PMA could do it. The maximum concentration against DNA amplification from liveSalmonellacells was 40.0 μg/mL. Only liveSalmonellacells were detected by PMA-ddPCR even in the existence of deadSalmonellacells,and the detection limit was 8.0 copy/20 μL. PMA-ddPCR could detect 102CFU/mLSalmonellacells in the polutted sample made by manual work. Furthermore,PMA-ddPCR showed better specificity,accuracy and stability.

propidium monoazide;sodium deoxycholate;ddPCR;live cells

2015-10-08

王靜(1975-)，女，碩士，高級工程師，研究方向：食品安全，E-mail:15705959793@163.com。

國家質檢總局科技計劃項目(2014IK114)。

TS207.4

A

1002-0306(2016)10-0067-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.004