氣相色譜結合主成分分析和聚類分析用于裸燕麥脂肪酸標準指紋圖譜的建立

王超群,張　暉,錢海峰,王　立,齊希光

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

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氣相色譜結合主成分分析和聚類分析用于裸燕麥脂肪酸標準指紋圖譜的建立

王超群,張暉*,錢海峰,王立,齊希光

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

采用氣相色譜(GC)技術結合主成分分析(PCA)對62個不同產地及不同品種的燕麥樣品脂肪酸進行分析鑒定。以PCA得分散點圖區分出14個皮燕麥樣品。對其余48個裸燕麥樣品通過聚類分析優選46個樣品,采用共有模式法篩選出它們含有的11種共有特征峰,并構建裸燕麥脂肪酸標準指紋圖譜。通過方法學考察,11種共有脂肪酸精密度、重復性和穩定性的RSD分別小于3.069%、4.249%和4.900%,符合指紋圖譜的檢測要求。相似度分析得出46個樣品的相似度均大于0.99,表明所建立的標準指紋圖譜具有高度的特征性、唯一性和準確性。本研究彌補了裸燕麥指紋圖譜信息的空白,進一步完善了谷物脂肪酸數據庫,為谷物營養性脂質體鑒別技術體系構建奠定了基礎。

氣相色譜,主成分分析,聚類分析,燕麥,脂肪酸,指紋圖譜

燕麥(AvenasativaL.)是世界第六大糧食作物,一般分為帶稃型和裸粒型兩種,即皮燕麥(A.sativaL.)和裸燕麥(A.nudaL.)[1]。在我國裸燕麥種植廣泛,品種繁多,一般作食用,皮燕麥則主要用作牲口飼料[2]。燕麥被譽為藥食同源的糧食作物,脂肪、蛋白質、維生素和礦物質含量居谷物之首,并且其中富含的膳食纖維和多種抗氧化活性類物質賦予了燕麥更多的醫療價值、保健作用和美容功效[3]。

市場上以裸燕麥為原料的產品層出不窮,包括燕麥面條、燕麥面包、燕麥飲料、燕麥膨化食品等[4]。在經濟利益的驅使下,市場上的摻雜摻假及品質劣變現象不僅會影響消費者的身心健康和經濟利益,也會對整個食品產業鏈產生很大的影響[5]。但是目前尚沒有對燕麥及燕麥產品品質評價的質量標準,因此建立燕麥的品質鑒定和質量控制方法迫在眉睫。

指紋圖譜技術是國際上公認的中藥質量控制的最有效手段,現已被廣泛應用于食品分析領域,并且所建立的食品中一些成分的指紋圖譜對食品摻假和質量控制都具有重大的意義[6],但其在谷物特別是燕麥中的應用尚未可見。目前僅有翟旭光等[7]研究了燕麥麥谷蛋白SDS-PAGE電泳圖譜作為燕麥指紋圖譜,但分析方法復雜且結果僅可用來輔助鑒定燕麥屬植物,應用范圍較窄。研究報道駱姍等[8]建立了花生GC指紋圖譜并應用于花生油的品質評價中;Tian H等[9]采用GC-MS構建小白杏仁脂肪酸指紋圖譜并成功應用于小白杏仁油的鑒定與質量控制中;吳衛國等[10]也成功構建了5類食用植物油的標準指紋圖譜以用于相應產品的質量控制和摻假檢測。借鑒中藥指紋圖譜的研究理念及上述研究成果,結合燕麥中脂肪酸含量豐富[11],且氣相色譜分析技術成熟簡便的客觀基礎,本文采用氣相色譜技術分析多個產地及品種燕麥中的脂肪酸,利用PCA分析判別皮燕麥和裸燕麥,通過聚類分析、共有模式法結合相似度分析構建裸燕麥脂肪酸標準指紋圖譜,并對現有的燕麥品種資源進行脂肪酸的研究與分析,為進一步了解燕麥品種品質特性,篩選優良品種以及后期燕麥產品摻雜鑒定、品質監測及生產研究提供技術參考。

表1　所有燕麥原料信息

注:*為皮燕麥品種,其余為裸燕麥品種。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

燕麥原料來自2014年全國燕麥10個產地共62份樣品,其中皮燕麥14種,裸燕麥48種，來源詳見表1，其中各地名分別代表河北張家口農業科學院燕麥研究所、山西農科院品質所、甘肅省定西市旱農中心、青海畜牧獸醫科學院草原研究所、新疆農科院作物所、云南昭通農科所、吉林白城農科院、寧夏固原農科所、內蒙古農科院園藝所、四川涼山州西昌農業研究所;正己烷國藥集團化學試劑有限公司,色譜純;無水乙醚、三氟化硼乙醚、氫氧化鈉、無水甲醇、氯化鈉、無水硫酸鈉國藥集團化學試劑有限公司,均為分析純;Supelco37種脂肪酸甲酯混標(10 mg/mL),十九烷酸標準品(純度≥99%)美國Sigma-Aldrich公司。

GC-2014氣相色譜儀日本島津公司;PEG-20M毛細管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm)北京泰克美科技有限公司;FW100旋風式粉碎機天津泰斯特儀器有限公司;TM05C實驗用碾米機日本佐竹機械有限公司;SOX406自動索式抽提儀濟南海能儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品前處理裸燕麥籽粒經除雜后粉碎,過40目篩,標號,置于陰涼處密封保存;皮燕麥籽粒用脫殼機去殼后進行與上述相同的方法處理。

1.2.2純油樣品的提取采用索式抽提法,參照GB/T5512--2008。

1.2.3脂肪酸甲酯化處理[12]準確稱取1.2.2中提取所得的油樣20 mg,置于10 mL試管中,加入2 mL濃度為0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液,于65 ℃水浴中加熱皂化至油珠完全溶解(約30 min,其間取出振蕩2～3次),靜置冷卻,加入25%的BF3-CH3OH溶液2 mL,同樣在65 ℃水浴條件下酯化20 min,靜置冷卻,加入2.0 mL正己烷,充分振搖后加入2 mL飽和NaCl溶液,然后在3000 r/min的轉速下離心15 min,取上層有機相于干燥樣品瓶中,加入少量無水Na2SO4以除去微量的水,取上清液供氣相色譜分析使用。

1.2.4氣相色譜分析條件PEG-20M毛細管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm);載氣:高純N2,吹掃流量:3 mL/min;進樣量:1 μL;分流比100∶1;進樣口溫度250 ℃;升溫程序:初始溫度80 ℃,保持3 min,升溫速率15 ℃/min升溫至215 ℃,保持16 min,溶劑延遲時間1.5 min。

1.2.5脂肪酸測定采用Sigma 37種脂肪酸甲酯混標對樣品中脂肪酸進行定性分析;以十九烷酸為內標對樣品中脂肪酸進行定量分析[13]。

1.2.6數據分析采用SPSS19.0軟件進行聚類分析和PCA分析。所有數據均進行三次平行實驗。

表2　各主成分的特征值及方差貢獻率

2結果與討論

2.1主成分分析區分皮燕麥和裸燕麥品種

經氣相色譜分析得到62個燕麥樣品中所含脂肪酸共有26種,平均每種燕麥含有15種脂肪酸,其中棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、二十碳烯酸為6種平均含量高于1.00%且含量之和占總FFA含量97.35%的主要脂肪酸,這與王燕等[14]和戚向陽等[11]關于燕麥油脂中脂肪酸組成和含量的研究結果一致。

對62個樣品中這6種脂肪酸進行PCA主成分分析。原始數據經標準化處理后,由相關矩陣出發,計算相關矩陣的特征值和特征向量,得到特征值和方差貢獻率(見表2)。表2中每個主成分的方差特征值對應成分包含原有信息的多少。

通過具有Kaiser標準化的正交旋轉后得到主成分載荷矩陣,即以每個載荷量來表示主成分與對應變量的相關關系,通過計算得到主成分表達式:

F1=0.061X1-0.218X2-0.843X3+0.944X4+0.803X5+0.107X6;

F2=-0.088X1-0.670X2-0.147X3+0.047X4+0.208X5+0.926X6;

F3=0.936X1+0.448X2-0.418X3-0.111X4-0.049X5+0.057X6。

從以上主成分表達式及表2可以看出,前3個主成分累計得分為82.659%(>80%),代表62種燕麥樣品中脂肪酸含量82.659%的信息。其中,第一主成分F1的貢獻率最高為38.482%,在變量油酸、亞油酸和亞麻酸具有較高的載荷系數,說明它們與F1有高的相關;同理,第二主成分F2的貢獻率為23.033%,硬脂酸和二十碳烯酸與F2有高的相關;第三主成分F3的貢獻率為21.143%,棕櫚酸、硬脂酸和油酸與F3有高的相關。F1、F2和F3代表了燕麥脂肪酸的足夠信息。

在SPSS19.0中根據62個燕麥樣品中6種脂肪酸含量、表2中前兩個主成分的特征值和6種脂肪酸的載荷值計算出62個燕麥樣品的第一、第二主成分值。以第一主成分值為橫坐標,第二主成分值為縱坐標作散點圖[15]。散點圖中每個點分別代表一個樣品,點與點之間的距離代表各個樣品之間的特征差異程度。由圖1可知,62個燕麥樣品根據距離遠近及聚集程度基本可分為兩個部分,圖中區域內集中的散點代表裸燕麥樣品,區域外散點(1、2、4、6、7、15、17、18、23、38、45、47、48、49、51)代表皮燕麥樣品。

圖1　62種裸燕麥樣品的主成分散點圖Fig.1　PCA biplot for sixty-two oat varieties

由表1可知,實際皮燕麥樣品編號為1、2、3、4、5、6、7、15、17、18、45、47、48、49,因此PCA散點圖中區分與實際基本相符,但皮燕麥樣品中3和5未被區分開來,從圖1中可以看出兩者均在靠近區域外側邊緣部分,可能3和5的脂肪酸信息與裸燕麥樣品較接近,因而未能分開;而區域外側散點中23、38和51本是裸燕麥樣品,同樣也處在靠近區域邊緣處,可能是這三個品種中的脂肪酸信息與其他裸燕麥稍有差異,因而未能聚集。由于種植燕麥的地區間氣候條件和農業條件相差較大,加之基因及品種差異,各地種植的品種經長期栽培和適應,結果形成了各自的特征特性,在生態學和品質特性方面亦存在較大不同[16]。林偉靜等[17]研究同樣發現產地不同對燕麥樣品中的脂肪酸含量也有相應的影響。因此產生上述現象的原因可能是所采集到的這5個樣品的個體差異、基因及種植區域的影響。

2.248個裸燕麥品種脂肪酸聚類分析

由2.1可知,62個燕麥樣品中裸燕麥因6種主要脂肪酸信息的高度相似性而在PCA散點圖中聚集。根據這一相似性初步判斷可以建立一種用以代表燕麥脂肪酸信息的標準指紋圖譜。相對而言,裸燕麥在食品加工中的利用程度遠遠高于皮燕麥,因此本研究僅針對裸燕麥品種建立其標準指紋圖譜。

由于產地、品種及不同批次樣本的影響,不同樣品中脂肪酸組成及含量存在一定的差異,這將會影響最終標準指紋圖譜的構建效果。為了降低差異較大的樣本的干擾,得到更為標準化的指紋圖譜信息,對這48個裸燕麥樣品進行了聚類分析[9]。采用組間聯接法,以歐式距離(Euclidean distance)為度量標準,對原始變量采用Z得分法進行標準化的預處理,得到裸燕麥脂肪酸的聚類譜系圖。譜系圖中同一組內的數據對象具有較高的相似度,而不同組中的數據對象是不相同的。

圖2　48個裸燕麥樣品脂肪酸聚類譜系圖Fig.2　Cluster pedigree diagram of fatty acid of 48 oat varieties注：縱坐標Case+數字代表表1中的產品編碼。本圖使用平均聯接(組間)的樹狀圖重新調整距離聚類合并。

由圖2可知,case38和case51即38和51號樣品與其他46個樣品之間存在較大的差異,當取閾值為14.2時,樣品閾值分割后可分為3類,即G1(38)、G2(51)、G3(其他)。這與2.1 PCA圖中二者得分散點與其他裸燕麥樣品距離較遠的結果一致,但PCA圖中區分出的23號樣品在聚類分析圖上與G3中其它樣品有差異但未完全分開,這是由于23號樣品的脂肪酸信息本就與裸燕麥信息相近,加之PCA和聚類分析方式及度量標準的不同而產生的。對于差異較大的樣品38和51,若將它們引入指紋圖譜的構建,可能會無形中將燕麥脂肪酸特征峰選取的盲目性隨機放大,同時降低各譜圖與共有模式的相似度,最終影響標準指紋圖譜信息的準確性和可靠性[18]。因此選取G3中46個裸燕麥樣品進一步實施指紋圖譜分析。

2.3裸燕麥脂肪酸標準指紋圖譜的建立

色譜指紋是通過對所有分析樣本中大多數共有的化合物通過特定的信息化處理后建立的一種共有模式體系,該體系能夠反映樣品特有的品質,且對樣品信息反饋存在唯一性和針對性,可用于樣品真假的識別和產品質量優劣的判別[19]。對聚類分析優選的46個裸燕麥樣品進行標準指紋圖譜的構建。典型的裸燕麥脂肪酸指紋圖譜見圖3,圖3中從上至下依次為:白燕2號(新疆)、白燕2號(吉林)、白燕2號(寧夏固原)、內燕5號(內蒙古)、青燕1號(青海)、定莜9號(山西)、9628-3(甘肅)、S20-171-9(河北)。

圖3　裸燕麥脂肪酸氣相色譜指紋圖譜Fig.3　GC fingerprint of fatty acids of naked oats

本文以37種脂肪酸甲酯混標定性燕麥中的脂肪酸組成,并以十九烷酸為內標測定各脂肪酸含量。計算各峰所代表的脂肪酸的保留時間和相對含量(相對總脂肪酸含量的百分比)來對各脂肪酸進行分析。結果得出46個裸燕麥樣品中所含脂肪酸共有26種,其中所有樣本中同時存在的共有特征峰為11種。將這些共有脂肪酸信息取平均值,作為裸燕麥脂肪酸的標準特征信息(見表3),并構建其共有模式圖,見圖4。

圖4　裸燕麥脂肪酸共有模式圖Fig.4　The common pattern fingerprint of fatty acids of naked oats

2.4方法學考察

2.4.1精密度實驗取同一燕麥樣品,按1.2.3方法處理后,在1.2.4中的色譜條件下連續進樣6次。結果得出,特征峰的保留時間RSD均小于0.892%,峰面積RSD均小于3.069%。表明氣相色譜法分析精確度較高,符合指紋圖譜的檢測要求。

2.4.2重復性實驗取同一燕麥樣品6份,按1.2.3方法處理制成6份供試樣品溶液后,在1.2.4中的色譜條件下進樣分析。結果得出,特征峰的保留時間RSD均小于0.756%,峰面積RSD均小于4.249%。表明氣相色譜法分析具有較好的重復性,符合指紋圖譜的檢測要求。

表4　不同產地品種裸燕麥脂肪酸信息及相似度分析

續表

注:0號為標準指紋圖譜脂肪酸信息。

2.4.3穩定性實驗取同一燕麥樣品,按1.2.3方法處理后,密封于室溫條件下保存,分別在供試樣品制備完成后第0、4、8、12、16、20、24 h在1.2.4中的色譜條件進樣分析。結果表明,特征峰的保留時間RSD均小于1.119%,峰面積RSD均小于4.900%。表明氣相色譜法分析穩定性良好,符合指紋圖譜的檢測要求。

2.5裸燕麥樣品的相似度分析

指紋圖譜的相似度是指紋圖譜的整體相關性,計算樣品的相似度可以復核樣品及建立樣品的評定標準。常用的評價方法有歐氏距離、相關系數、向量夾角余弦等[20]。本實驗以根據46個裸燕麥樣品通過共有模式法建立的標準指紋圖譜信息為對照,采用夾角余弦法計算出各圖譜與標準指紋圖譜的相似度。由表4可知,用以建立標準指紋圖譜的46個燕麥樣品與標準指紋圖譜的相似度為0.9958～0.9999,均大于0.9958,而23、38和51號樣品的相似度分別為0.9922、0.9952和0.9944,均小于0.9958,與其他樣本有明顯的差別,而且這與2.1PCA散點圖和2.2聚類分析中的區分結果一致,說明利用主成分分析和聚類分析優選的樣本構建的標準指紋圖譜能夠有效地反映樣品的整體性,具有較高的準確度。

3　結論

本文采用氣相色譜技術結合主成分分析和聚類分析構建裸燕麥脂肪酸標準指紋圖譜,篩選出裸燕麥中11種共有特征脂肪酸信息,方法學考察及相似度評價表明所建立的標準指紋圖譜能從化學成分的整體特征面代表裸燕麥的脂肪酸信息,精密度、重復性、穩定性良好,準確度較高。本文首次將指紋圖譜理念應用于谷物中,但僅是針對燕麥復雜營養成分中的脂肪酸信息進行分析,并且基于各不同產地及品種的燕麥樣品中脂肪酸信息的相似性而建立的脂肪酸標準指紋圖譜,因此所建立的指紋圖譜并不能用來鑒別燕麥產地及品種。但研究結果可為燕麥及燕麥產品品質評價及質量監控提供有力的理論依據,具有實際應用價值。

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Establishment of fatty acids standard fingerprints of naked oats by GC combined with cluster analysis and principal component analysis

WANG Chao-qun,ZHANG Hui*,QIAN Hai-feng,WANG Li,QI Xi-guang

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Fatty acids profile of 62 oat samples from different locations and species were analyzed through gas chromatography(GC)combined with principal component analysis(PCA). 14 leather oat varieties were distinguished through PCA scores scatterplot. Then 46 naked oat varieties were selected from the remaining 48 naked oat varieties by cluster analysis and 11 characteristic peaks in these naked oats were identified by total pattern method. Then characteristic and accuracy fatty acids standard fingerprint of naked oats was constructed and the similarities of the 46 samples were more than 0.99. Results of methodological study showed that RSD of precision,reproducibility and stability of the 11 kinds of fatty acids were good,respectively less than 3.069%,4.249% and 4.900%. It was in line with fingerprint testing requirements. This study filled the vacancy of naked oat fingerprint information,replenished grain fatty acid database,and laid the foundation of building a grain nutritional liposome identification technology system.

gas chromatography;principal component analysis;cluster analysis;oat;fatty acids;fingerprint

2015-09-14

王超群(1990-),女,碩士研究生,主要從事糧食深加工方面的研究，E-mail:125643657@qq.com。

張暉(1966-),女,博士,教授,主要從事糧食深加工方面的研究,E-mail:zhanghui@jiangnan.edu.cn。

國家“十二五”科技支撐計劃(2012BAD37B08)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)10-0082-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.007