姜黃精油的抗氧化活性研究

魏　娟,蘇海蘭,張溪桐,畢　陽

(甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

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姜黃精油的抗氧化活性研究

魏娟,蘇海蘭,張溪桐,畢陽*

(甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

姜黃為姜科姜黃屬的多年生草本植物,是一種藥食兩用材料。采用水蒸汽蒸餾法提取了姜黃精油,研究了其對ABTS+自由基、羥自由基的清除率及其抑制亞油酸脂質過氧化的能力,通過MTS法研究了其對HepG2細胞的細胞毒作用,采用流式細胞技術評估了其在細胞水平的抗氧化能力。結果表明:姜黃精油對ABTS+自由基具有良好的清除效果,但其清除能力低于VE;對羥自由基的清除效果非常明顯,與VE的清除能力相當;并且能有效抑制亞油酸脂質過氧化。姜黃精油在0.02%(v/v)濃度范圍內沒有明顯的細胞毒作用,在此濃度范圍內能有效清除HepG2細胞內的活性氧。由此表明,姜黃精油具有開發為安全天然的食品抗氧化劑的潛力。

姜黃,精油,抗氧化

精油是植物的次生代謝產物,分子量小,可隨水蒸汽蒸出,一般由幾十種甚至幾百種化合物組成。由于其成分復雜,具有多種生物學活性,被廣泛應用于食品、化妝品及制藥行業[1]。多種精油具有明顯的抗氧化活性,Goze等發現,1 g/L刺山柑和海茴香精油可以抑制脂質過氧化,其效果與2,6-二叔丁基甲酚(BHT)類似[2]。Mechergui等發現,牛至精油可有效清除DPPH自由基,具有良好的抗氧化活性[3]。另外,異株百里香和擬百里香精油對羥基自由基也具有較好的清除效果[4]。

姜黃(CurcumalongaL.)為姜黃屬的多年生草本植物,在亞洲地區分布廣泛,我國和印度為主產國。姜黃可藥食兩用,作為中藥,具有活血降壓、驅寒消炎、抗癌等功效,另外由于其色澤鮮艷、著色力強、熱穩定性好而在食品工業中被廣泛用作天然著色劑[5]。姜黃的主要活性成分是姜黃素和精油。姜黃精油主要由芳姜黃酮、姜黃酮、姜黃烯、沒藥烯、梓檬烯、倍半水斧烯、莪術醇、莪術二酮及桉油精等成分構成[6]。有報道指出,姜黃精油具有抗腫瘤、抗突變、抑菌的功效。姜黃精油可以有效抑制人急性早幼粒白細胞(HL-60)和肝癌細胞(HepG2)的增殖[7],保護細胞免受損傷又能促使已突變細胞的DNA修復[8],還可抑制黃曲霉的生長及其毒素的產生[9]。但關于姜黃精油的抗氧化活性還未見報道。

本研究以姜黃為原料,采用水蒸汽蒸餾法提取姜黃精油,在生化水平研究姜黃精油對ABTS+自由基、羥自由基的清除效果及其抑制亞油酸脂質過氧化的能力,在細胞水平研究姜黃精油對HepG2細胞的細胞毒作用及其對細胞內活性氧的清除效果,以期為姜黃精油作為一種天然抗氧化劑的開發應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

姜黃2014年7月購自甘肅省蘭州市安寧區黃河藥材市場;人肝癌HepG2細胞株上海拜力生物有限公司;DMEM、FBS、0.25%胰酶(含EDTA,比活力(250 U/mg)Hyclone公司;MTSPromega公司;DPPH、ABTS、TPTZ、DCFH-DA、VESigma-Aldrich公司;其余試劑均為國產分析純。

CN69M/FW80型高效樣品粉碎機北京中西遠大科技有限公司;水蒸汽蒸餾裝置常州普天儀器制造有限公司;15284型iMARK多功能酶標儀美國BIO-RAD公司;UV-2450型可見-紫外分光光度計日本島津公司;移液器德國Eppendorf公司;GC6890N/MS5973N型氣相色譜/質譜聯用儀、HP-5 ms氣相色譜毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)安捷倫科技有限公司;BD FACSCanto II型流式細胞儀美國 BD Biosciences。

1.2實驗方法

1.2.1姜黃精油的提取參照Singh等的方法[10],采用水蒸汽蒸餾法以料液比為1/10對姜黃粉末進行蒸餾,冷凝水冷凝收集精油粗提液后經無水乙醚萃取、無水硫酸鈉干燥,最后用旋轉蒸發儀除去溶劑獲得姜黃精油,避光保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2HepG2細胞培養配制含10%小牛血清的DMEM細胞培養液,將人肝癌HepG2細胞株加入細胞培養液中置于含5% CO2的37 ℃細胞培養箱中培養2～3 d。

1.2.3姜黃精油對ABTS+自由基的清除能力測定參照Chun等的方法[11]。將ABTS+水溶液與過硫酸鉀溶液配制成ABTS+儲備液。使用前將ABTS+儲備液用無水乙醇稀釋得到ABTS+工作液并于室溫避光保存。用無水乙醇分別配制濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL的姜黃精油樣品溶液,以抗氧化劑VE溶液(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL)作為陽性對照溶液。將1.9 mL ABTS+工作液與0.1 mL樣品溶液混合均勻,暗處反應4 min,于734 nm處測定吸光度值A。用無水乙醇替代樣品溶液,于734 nm處測定吸光度值A0。ABTS自由基清除率計算公式為:

清除率(%)=(A0-A)/A0×100

1.2.4姜黃精油對羥自由基的清除能力測定參照劉駿的方法[12]。用無水乙醇分別配制濃度為1.0×10-3mg/mL的姜黃精油溶液和VE溶液作為樣品液。在10 mL比色管中分別加入0.3 mL 0.4 mmol/L 結晶紫溶液、0.6 mL 2.0 mmol/L過氧化氫溶液以及1.2 mL 1.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液。用pH=4.0磷酸檸檬酸緩沖液將上述溶液定容至10 mL,靜置0.5 h后,在580 nm處測其吸光度Ab。在上述體系加過氧化氫之前分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的樣品液,測定其吸光度As,按下式公式計算清除率:

清除率(%)=(As-Ab)/(A0-Ab)×100

其中:A0為上述體系中加入0.3 mL 0.4 mmol/L結晶紫溶液、1.2 mL 1.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液,不加過氧化氫,再用pH=4.0磷酸檸檬酸緩沖液定容至10 mL,測出580 nm處的吸光度值。平行測定三次,取平均值。

1.2.5姜黃精油抑制亞油酸過氧化能力測定參照Zainola等的方法[13]。用無水乙醇分別配制4 mg/mL的姜黃精油溶液、VE溶液作為樣品液。取4 mL樣品液,加入4.1 mL 2.5%亞油酸(v/v),8 mL 磷酸緩沖液(pH=7.0),3.9 mL蒸餾水,放于40 ℃恒溫下培養。取上述培養液1 mL,加入l mL 20%三氯乙酸,靜置20 min。然后加入2 mL 0.3%硫代巴比妥酸(TBA)溶液,在沸水中恒溫10 min,取出室溫下冷卻。3000 r/min離心20 min,取上清液在532 nm下測定吸光度值。平行測定三次,取平均值。以無水乙醇為取代樣品測吸光值作為空白對照組。

1.2.6MTS法檢測姜黃精油對HepG2細胞的毒性取對數生長期的HepG2細胞,制備細胞懸液并以1×105/mL密度接種于96孔培養板中,培養24 h后加入不同濃度的姜黃精油溶液,每組濃度設定6個平行孔,于37 ℃、5% CO2培養箱條件下繼續培養24 h,加入20 μL/100 μL MTS試劑,37 ℃、5% CO2條件下孵化1～4 h后,使用酶標儀在490 nm處測定吸光度值OD1,以單純培養液作為空白孔,測定吸光度值為OD0,以未做任何處理作為對照,測定吸光度值OD。細胞存活率按公式計算:

細胞存活率(%)=(OD1-OD0)/(OD-OD0)×100

1.2.7姜黃精油細胞內抗氧化活性測定DCFH-DA作為一種氧化指示劑,當其被細胞吸收并被細胞酯酶去脂化生成DCFH后,細胞中的ROS能將其氧化成帶有熒光的DCF,通過流式細胞儀進行熒光定量,以熒光強度或陽性細胞率來指示細胞內ROS的水平[14]。參照張紅城等的方法[15],取對數生長期的HepG2細胞制備細胞懸液1×105/mL接種于6孔板中于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h后,加入0.001%、0.005%、0.01%的姜黃精油乙醇溶液處理30 min,再加入25 μmol/L DCFH-DA溶液,37 ℃、5% CO2培養30 min,使探針被完全吸收,棄去培養液后用預冷的D-Hanks清洗三次,以充分洗去未進入的熒光探針,加入10 mmol/L H2O2刺激30 min,用流式細胞儀檢測熒光強度,激發波長為488 nm,發射波長為525 nm。以細胞培養液為空白組(BLANK),以未用DCFH-DA刺激的HepG2細胞為陰性對照組(NTC),以用DCFH-DA刺激、但未用精油處理的HepG2細胞為陽性對照組(PTC),A、B、C分別為0.001%、0.005%、0.01%(v/v)姜黃精油處理組。

1.3數據處理

采用Origin 8.0 處理數據計算標準偏差并作圖,圖中豎線表示標準誤(SD±SE)。

2　結果與分析

2.1姜黃精油對ABTS+自由基的清除能力

圖1顯示姜黃精油對ABTS+自由基具有良好的清除能力,其清除能力隨著精油濃度的升高逐漸增大,當濃度為10.0 mg/mL時可以清除52%的ABTS+自由基。但與陽性對照抗氧化劑VE相比,姜黃精油對ABTS+自由基的清除能力要低于VE,而2 mg/mL的VE對ABTS+自由基的清除率就達到了98%。

圖1　不同濃度VE和姜黃精油對ABTS+自由基的清除能力Fig.1　Scavenging capacity against ·OH radicals of different concentrations of VE and turmeric essential oi

2.2姜黃精油對羥自由基的清除能力

由圖2可知,姜黃精油和VE對由Fenton體系產生的羥自由基均有較好的清除效果,清除能力隨濃度增加逐漸加強。當濃度為3×10-4mg/mL時,姜黃精油和VE對羥自由基的清除效果均顯著增加,清除率接近100%,且姜黃精油與VE的清除能力相當。

圖2　不同濃度VE和姜黃精油對羥自由基的清除能力Fig.2 Scavenging capacity against ·OH radicals of different concentrations of VE and turmeric essential oil

2.3姜黃精油抑制亞油酸脂質過氧化的能力

由圖3可知,姜黃精油和VE均表現出一定的抑制亞油酸脂質過氧化的能力,而且姜黃精油抑制亞油酸脂質過氧化的能力與相同濃度的VE的抑制效果相當。4 mg/mL的姜黃精油和VE對亞油酸過氧化的抑制率均超過了50%。

圖3　VE和姜黃精油對亞油酸脂質過氧化的抑制能力Fig.3　The inhibitory capacity of VE and turmeric essential oil against linoleic acid oxidation

2.4姜黃精油的細胞內抗氧化活性

2.4.1姜黃精油的細胞毒性圖4顯示,姜黃精油在0.02%(v/v)濃度范圍以內時,HepG2細胞的細胞存活率與對照組基本一致,說明當姜黃精油濃度低于0.02%(v/v)時,對細胞沒有細胞毒作用。因此后續實驗選定在0.02%(v/v)濃度以內進行。

圖4　不同濃度姜黃精油對HepG2細胞的細胞毒作用Fig.4　Cytotoxicity of different concentrations of turmeric essential oil on HepG2 cells assayed by MTS test

2.4.2姜黃精油的細胞內抗氧化活性采用流式細胞儀對HepG2細胞內活性氧含量進行分析,分析圖譜見圖5,對分析圖譜進行統計,統計結果見圖6。由圖5、圖6可知,細胞培養液(空白組,BLANK)自身的熒光強度非常弱,未用DCFH-DA刺激的HepG2細胞(陰性對照組,NTC)自發熒光也較弱,其陽性細胞率僅為5.74%,當用DCFH-DA刺激、但未用精油處理后HepG2細胞(陽性對照組,PTC)的陽性細胞率達到了85.34%,而用0.001%,0.005%,0.01%(v/v)濃度的姜黃精油處理后,相比陽性對照組(PTC)其陽性細胞率分別降低到了22.36%、10.64%和14.29%。結果證明了姜黃精油能有效降低HepG2細胞內的DCFH-DA的熒光強度,降低陽性細胞率,清除細胞內的活性氧,具有一定的細胞內抗氧化活性。

圖5　不同濃度姜黃精油處理后HepG2細胞陽性細胞率的流式細胞儀分析圖譜Fig.5　Flow cytometry analysis of different concentrations of turmeric essential oil on positive cell ratio of HepG2 cells注：BLANK為空白，NTC為陰性對照，PTC為陽性對照，A、B、C分別為0.001%、0.005%、0.01%(v/v)姜黃精油處理組。

圖6　不同濃度姜黃精油對HepG2細胞陽性細胞率的影響.Fig.6　Effect of different concentrations of turmeric

3　討論

羥基自由基是活性氧類物質中化學活性最強的物質[11],本研究結果顯示姜黃精油對羥自由基具有很高的清除率,與VE的清除效果相當,在濃度為3×10-4mg/mL時,對羥自由基的清除率就達到了100%。脂質過氧化是導致很多食品酸敗變質的原因[16],本研究結果顯示,姜黃精油可以很好地抑制亞油酸的脂質過氧化,與VE的作用效果相當。姜黃精油具有較好的抗氧化活性,在某些方面與VE的效果相當。

目前ABTS法、羥自由基法、抑制亞油酸脂質過氧化等方法來都是通過化學反應來檢測物質的抗氧化活性,其優點是快速簡便。但是這些方法并不能真實的反應有機體對物質的吸收、運輸、代謝,及其在有機體內有效的作用濃度。因此細胞水平的抗氧化實驗提供了一種更接近生物有機體體內水平的一種抗氧化研究方法[17]。

細胞毒性實驗結果顯示姜黃精油在濃度低于0.02%(v/v)時,其對HepG2細胞沒有明顯的細胞毒作用,證明姜黃精油作為一種食品抗氧化劑是安全的。我們的研究結果顯示不同濃度的姜黃精油均可以有效降低H2O2刺激HepG2產生的細胞內活性氧水平,證明了姜黃精油在細胞內也具有較好的抗氧化能力。

4　結論

4.1姜黃精油對ABTS+自由基具有良好的清除效果,但其清除能力低于VE;對羥自由基的清除效果非常明顯,與VE的清除能力相當;并且能有效抑制亞油酸脂質過氧化。

4.2姜黃精油能有效清除HepG2細胞內的活性氧,并且沒有明顯的細胞毒作用,具有開發為天然安全的食品抗氧化劑的潛力。

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Study on antioxidant activity of turmeric essential oil

WEI Juan,SU Hai-lan,ZHANG Xi-tong,BI Yang*

(College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Turmeric(CurcumalongaL.)is a plant belonging to the family of Zingiberaceae,it has been commonly used in Chinese traditional medicine and food coloring. In this study,the turmeric essential oil was extracted by steam distillation,and its antioxidant capacity was evaluated based on ABTS radical and hydroxyl free radical(·OH)scavenging activities,inhibition of lipid peroxidation in linoleie acid. Its cytotoxic effect on HepG2 cells was evaluated by mitochondrial-respiration-dependent 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium(MTS)assay,the antioxidant effect in cell levels was investigated by flow cytometry. The results indicated that turmeric essential oil exhibited good scavenging activities against ABTS free radicals,but the scavenging rate was lower than that of VE. The essential oil could significantly scavenge ·OH radicals,the scavenging rate was similar with that of VE. And it could inhibit lipid peroxidation in linoleie acid. Within the concentration of 0.02%(v/v),the essential oil had no obvious cytotoxicity on HepG2 cells,and could scavenge the reactive oxygen in them. It is suggested that turmeric essential oil could be developed as a food addictive of natural antioxidants.

turmeric;essential oil;antioxidant

2015-11-09

魏娟(1982-)，女，碩士，講師，研究方向：果蔬采后生物學與技術，天然產物生物學活性，E-mail：weijuan@gsau.edu.cn。

畢陽(1962-)，男，博士，教授，研究方向：果蔬采后生物學與技術，E-mail：biyang@gsau.edu.cn。

甘肅省青年科技基金計劃(1208RJYA095)；國家自然科學基金(31360382)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)10-0141-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.019