芒果果肉抗氧化成分測定及其對自由基清除能力的研究

2016-09-10 05:52:22李曉博胡文忠姜愛麗劉程惠

食品工業科技 2016年10期

李曉博,胡文忠,姜愛麗,劉程惠

(大連民族學院生命科學學院,遼寧大連 116600)

李曉博,胡文忠*,姜愛麗,劉程惠

(大連民族學院生命科學學院,遼寧大連 116600)

芒果,抗氧化劑,含量,自由基,抗氧化能力

芒果(MangiferaindicaLinn)是漆樹科杧果屬植株的果實,其色、香、味俱全且營養豐富,素有“熱帶果王”的美譽。目前已成為繼葡萄、香蕉、柑橙、蘋果后的世界第五大水果。芒果營養價值很高,其果肉中含有豐富的抗氧化劑,如多酚類、黃酮類、維生素C類、胡蘿卜素及還原型谷胱甘肽(GSH)等[1-3]。Soong[4]等通過研究得知芒果中的芒果黃酮是一種具有較強的抗氧化活性的抗氧化劑,同時也有研究表明芒果中其他各類型的抗氧化物質含量均很高,如類黃酮及維生素C等[5]。

廣西、廣東、海南、云南及臺灣等地區均是我國芒果種植較廣的區域,芒果果肉除鮮食外,主要用于制作各種加工產品,如果汁、蜜餞、果醬等,利用率低[6-7]。因此,探究芒果果肉的抗氧化能力對于我國芒果的利用率和居民身體素質及生活質量均有十分重要的意義。本實驗以海南金龍芒果為研究對象,測定其果肉中各類抗氧化物質含量,并在此基礎上對比了芒果果肉提取物與幾種天然抗氧化劑對自由基的清除能力,為芒果果肉的深加工產品及利用前景提供參考。

1　實驗部分

1.1材料與儀器

T-25型勻漿機德國IKA公司;BR4i型臺式高速冷凍離心機法國Jouan公司;PL203精密電子天平梅特勒-托利多儀器上海有限公司;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設備有限公司;SIM-F140型制冰機日本三洋;真空抽濾機SHZ-DⅢ予華牌循環水真空泵。

表1　還原型谷胱甘肽標準曲線的制作所用試劑

1.2實驗方法

1.2.1芒果果肉中抗氧化物含量的測定

1.2.1.1總酚采用顧海峰[8]及羅婭等人的方法[9]并稍作修改。

標準曲線的繪制:精確稱取0.0170 g沒食子酸,用1%鹽酸-甲醇溶液溶解,定容至100 mL,配制成1 mmol/L的母液。經1%鹽酸-甲醇溶液分別稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L,于280 nm處測吸光值,以鹽酸-甲醇溶液作空白參比調零。

稱取2.0 g果肉組織,加入少許經預冷的1% HCl-甲醇溶液,冰浴條件研磨勻漿,轉入20 mL刻度試管中,研缽經1% HCl-甲醇溶液沖洗后一并轉移至試管中,定容至刻度,混勻,于4 ℃避光提取20 min,過濾,收集濾液,測定波長280 nm處吸光值。得線性回歸方程y=8.65x+0.0205,R2=0.9955。

利用鹽酸甲醇溶液從芒果組織中提取總酚物質,根據總酚物質的甲醇提取液的吸收光譜特性,利用紫外可見分光光度計在特定波長下測定吸光值,進而與標準曲線比較,計算含量,此方法簡單易行,重復性好。

1.2.1.2類黃酮蘆丁標準曲線繪制及類黃酮含量測定方法同1.2.1.1,于325 nm處測定吸光值。得線性回歸方程y=3.7786x+0.0192,R2=0.9816。

1.2.1.3維生素C采用2,6-二氯酚靛酚法測定芒果果肉中VC的含量[10],稱取10.0 g芒果樣品,加入少量20 g/L草酸溶液,冰浴條件研磨成漿,用20 g/L草酸溶液清洗定容至1000 mL,靜置10 min,收集濾液。準確吸取10.0 mL濾液,用已標定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴至微紅色、靜置15 s不褪色后即為滴定終點,以10 mL 20 g/L草酸溶液作為空白。每100 g芒果果肉中維生素C含量計算公式如下:

式中:V是樣品提取液總體積,mL;V1為樣品滴定消耗染料體積,mL;V0是空白滴定消耗染料體積;ρ是1 mL染料溶液相當于抗壞血酸的質量,mg/mL;Vs是滴定時所取樣品溶液體積,mL;m為樣品質量,g。

1.2.1.4GSH測定方法采用文獻[11-12]的方法稍加改動。

標準曲線的繪制:取6支試管,編號,按照表1加入各種試劑,混勻,于25 ℃保溫反應10 min,以0號管為參比調零,測定顯色液在波長412 nm處的吸光值。以吸光值為縱坐標,還原型谷胱甘肽的質量濃度(mg/mL)為橫縱標,繪制標準曲線,得線性回歸方程為y=0.0064x-0.0192,R2=0.9982。

稱取5.0 g芒果樣品置于研缽中,加入5.0 mL經4 ℃預冷的50 g/L三氯乙酸溶液(含5 mmol/LEDTA-Na2),冰浴勻漿,于4 ℃、12000 r/min離心20 min,收集上清。取1支試管,依次加入1.0 mL去離子水、1.0 mL 0.1 mol/L、pH7.7磷酸緩沖液及1.5 mL 0.15 mol/L NaOH溶液并搖勻,加入0.5 mL φ=0.03甲醛,搖勻后靜置2 min,加入0.5 mL 4 mmol/L DNTB溶液,混勻,以此溶液作為參比在波長412 nm處對分光光度計進行調零。此方法因甲醛在堿性溶液中可以有效掩蔽半胱氨酸等含巰基化合物,可有效避免其干擾測定結果。

另取2支試管,分別加入1.0 mL上清液、1.0 mL 0.1 mol/L、pH7.7磷酸緩沖液。一支試管中加入0.5 mL 4 mmol/L DNTB溶液,另一支試管中加入0.5 mL 0.1 mol/L、pH6.8磷酸緩沖液,置于25 ℃保溫反應10 min。迅速測定顯色液在波長412 nm處的吸光值,分別記作ODS和ODC,從標準曲線上得出相應的GSH質量濃度。每100 g芒果果肉中GSH含量的計算公式:

式中:ρ為由標準曲線查得的溶液中還原型GSH物質的量,mg/mL;V為樣品提取液總體積,mL;m為樣品質量,g。

1.2.2芒果果肉與天然抗氧化劑抗氧化能力的比較研究

1.2.2.1樣品溶液制備稱取2 g芒果樣品,用HCl-甲醇溶液(含體積比為1%的鹽酸和50%的甲醇)勻漿,定容到40 mL,避光放置2 h后離心,期間晃動震動數次,上清液用甲醇稀釋10倍作為樣品溶液。

根據1.2.1中測定的實驗結果,配制濃度為50、30、80及12 mg/100 g的沒食子酸、蘆丁、VC及GSH待用。

1.2.2.2對·OH清除作用的測定根據文獻[13],利用Fenton反應檢測抗氧化物對羥基自由基的清除作用。按順序分別取l.5 mL pH7.4、0.15 mol/L的磷酸緩沖液、0.2 mL 260μg/mL的番紅溶液,0.7 mL 2 mmol/L的EDTANa2-Fe2+,1 mL樣品溶液,0.8 mL H2O2混勻后于37 ℃水浴保溫30 min,在波長510 nm處測吸光度A。空白組以等體積的去離子水代替樣品溶液;對照組以等體積的3%H2O2代替樣品溶液和EDTANa2-Fe2+溶液,每組三個平行,按下公式計算。

式中:A樣品為樣品組吸光度值;A對照為對照組吸光度值;A空白為空白組吸光度值。

1.2.2.3對O-2·清除作用的測定根據文獻[14]利用鄰苯三酚自氧化體系測定總抗氧化物對超氧陰離子自由基清除作用。取4.5 mL 0.05 mol/L,pH8.25的Tris-HCl緩沖液,加入1 mL樣品液,于25 ℃保溫25 min。加入0.4 mL 25 ℃預溫的3 mmol/L的鄰苯三酚。空白組以等量Tris-HCl代替樣品液,混勻反應4 min后加0.5 mL的濃鹽酸,迅速測定325 nm處吸光值,每組三個平行。

式中:A樣品為樣品的吸光度;A空白為空白組的吸光度。

1.2.2.4對DPPH·清除作用的測定根據文獻[15-16]的方法稍加改動,準確量取DPPH純溶液49 μL,溶解于甲醇,定容于250 mL棕色容量瓶。0.5 mL 5×10-4mol/L DPPH溶液中加入1 mL 樣品溶液及1 mL甲醇溶液,混勻后避光反應30 min,測定517 nm處吸光值。空白組用1 mL甲醇代替樣品溶液,每組三個平行。按下式計算樣品對DPPH·的清除率。

式中:A樣品為樣品的吸光度;A空白為空白組時的吸光度。

1.3數據處理

每個樣品設3個平行,每次測定重復三次。測定結果以平均數±標準誤(x±SD)表示,顯著性檢驗為t檢驗,顯著性水平為p<0.05,方差分析采用SPSS 9.0版本的統計軟件進行統計學分析處理。

2　結果與分析

2.1芒果果肉中抗氧化物的含量

根據上述標準曲線及回歸方程,對芒果果肉中各類抗氧化物含量測定結果如圖1所示:芒果果肉中總酚含量為50 mg/100 g,類黃酮為30 mg/100 g,VC為80 mg/100 g,含量最少的為GSH是12 mg/100 g。由圖1可知,芒果果肉中VC含量顯著高于總酚、類黃酮及GSH(p<0.05),由高到低依次是:VC>總酚類>類黃酮>GSH。

圖1　芒果果肉中各抗氧化成分含量Fig.1　The antioxidant substances content in the pulp of Mango

2.2芒果果肉與抗氧化劑抗氧化能力的比較研究

濃度為50、30、80及12 mg/100 g的沒食子酸、蘆丁、VC及GSH與芒果果肉對三種自由基的清除能力由圖2所示,可知芒果果肉對·OH的清除率為98.36%,顯著高于沒食子酸、蘆丁、VC和GSH這四種抗氧化劑(p<0.05),由于物質結構及有效抗氧化濃度等原因,其他四種抗氧化劑對·OH的清除能力也各不相同,除維生素C外,其他三種抗氧化物對·OH的清除率均在90%以上。且清除能力大小依次為芒果果肉提取物>沒食子酸>蘆丁>GSH>VC。可能原因為芒果提取物中不僅含有對·OH清除能力顯著的總酚、類黃酮、VC及GSH這四類物質,同時也含有VE、類胡蘿卜素、多糖等其他種類的抗氧化物,所以其對·OH自由基的清除能力明顯強于相當于其體內濃度的其它四種抗氧化物。

圖2　芒果果肉與抗氧化劑對自由基的清除能力Fig.2　The scavenging capacity of mango extraction and antioxidant on the free radical

芒果果肉對DPPH·的清除能力12.50%,低于VC,而明顯高于沒食子酸、蘆丁及GSH(p<0.05),清除能力由大到小依次為:VC>芒果提取物>沒食子酸>蘆丁>GSH。其中,VC對DPPH·自由基清除能力較芒果果肉高的原因可能是VC具有破壞DPPH·本身結構穩定性的功能,并且提供電子與DPPH·內部的孤對電子配對,使DPPH·得到有效的清除[17]。由圖也可看出芒果果肉及其他各類抗氧化劑對DPPH·的清除效果不理想,可能原因是DPPH·本身結構穩定,3個苯環形成了空間障礙,使得其中心氮原子上不成對的自由基很難進行電子配對,所以芒果果肉提取物對其清除能力最弱[18],其余抗氧化物不能與DPPH·內部的孤對電子配對,使其不易被抗氧化物破壞,故而不能對其進行有效地清除。

3　結論

經測定,芒果果肉中對自由基具有清除能力的有效抗氧化物質主要有總酚、類黃酮、VC及GSH等,且在本文中,經過測定,實驗所用海南金龍芒果果肉中含量最高的抗氧化物質為VC,為80 mg/100 g;其次為總酚,含量為60 mg/100 g;另外,類黃酮含量為30 mg/100 g;含量最少的為GSH,是12 mg/100 g。

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Study on the antioxidant components and antioxidant capacity of theMangiferaindicaLinn pulp

LI Xiao-bo,HU Wen-zhong*,JIANG Ai-li,LIU Cheng-hui

(College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China)