西藏羊八井地區牦牛酸乳中乳酸菌菌種鑒定

劉珊春,趙　欣,騫　宇,李　鍵,陳煉紅,陳　娟,索化夷,*

(1.西南大學食品科學學院,重慶 400715; 2.西南大學 重慶市特色食品工程技術研究中心,重慶 400715; 3.重慶第二師范學院生物與化學工程系,重慶 400067; 4.西南民族大學青藏高原研究院,四川成都 610041; 5.西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041)

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西藏羊八井地區牦牛酸乳中乳酸菌菌種鑒定

劉珊春1,2,趙欣3,騫宇3,李鍵4,5,陳煉紅4,5,陳娟5,索化夷1,2,*

(1.西南大學食品科學學院,重慶 400715; 2.西南大學 重慶市特色食品工程技術研究中心,重慶 400715; 3.重慶第二師范學院生物與化學工程系,重慶 400067; 4.西南民族大學青藏高原研究院,四川成都 610041; 5.西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041)

26株分離自西藏羊八井地區傳統發酵牦牛酸乳的菌株,經形態學、分子生物學鑒定,其中18株為腸球菌屬(Enterococcus)、6株為乳桿菌屬(Lactobacillus)、2株為明串珠菌屬(Leuconostoc)。構建系統發育進化樹分析乳酸菌的遺傳多樣性,并與其它地區牦牛酸乳中分離到的乳酸菌進行比較,發現西藏羊八井地區傳統發酵牦牛酸乳中乳酸菌多樣性豐富,其優勢乳酸菌株為腸球菌屬(Enterococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)。

乳酸菌,牦牛酸乳,菌種鑒定,16S rDNA

牦牛主要分布于青藏高原及其毗鄰高山地區,西藏地區共有牦牛390萬頭,占全世界牦?？倲档?0%[1-2]。牦牛為藏區牧民提供乳、肉、皮毛等畜產品,是當地重要的經濟來源[3]。與普通牛乳相比,牦牛乳富含蛋白質、必需氨基酸、脂肪、乳糖和礦物質等[4],深受當地牧民和游客喜愛。傳統發酵牦牛酸乳是一種以新鮮牦牛乳為原料,經多種乳酸菌和酵母菌等微生物共同發酵而成的一種低酒精含量風味乳品,其中有許多具有優良特性的乳酸菌,是一個復雜的微生物體系。冶成君[5]研究發現,青海玉樹牧區凝固型牦牛酸乳中有德氏乳桿菌、乳球菌、芽孢桿菌、腸球菌等多種乳酸菌;蔣厚陽[6]應用PCR-DGGE法分析西藏傳統發酵奶酪(奶渣)中乳酸菌,發現了副干酪乳桿菌、發酵乳桿菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌等12種乳酸菌,其中德氏乳桿菌為優勢菌種。

乳酸菌的鑒定方法主要分為表型特征鑒定法和基因型鑒定法。利用16S rDNA序列分析、變性梯度凝膠電泳標記技術(DGGE)等分子生物學技術對乳酸菌進行分類鑒定的優勢日益明顯。夏雪娟等[7]采用屬特異性PCR、16S rDNA序列同源性分析、種特異性PCR與NEBcutter分析相結合的方法,對西藏地區傳統乳制品中乳酸菌進行鑒定。董曉婉[8]等采用傳統的生理生化實驗和16S rDNA基因序列分析相結合的方法,對新疆蒙古族和哈薩克族酸奶中乳酸菌進行鑒定。Yu[9]等研究發現PCR-RFLP分析和16S rDNA相結合的方法能快速、簡便、有效的鑒定乳酸菌。

本實驗以實驗室保存的分離純化自羊八井地區傳統發酵牦牛酸乳中的26株菌為研究對象,采用16S rDNA基因序列分析進行種屬鑒定,構建系統發育進化樹確定乳酸種屬,并與其他地區牦牛酸乳中分離到的乳酸菌進行比較,為牦牛酸乳中乳酸菌資源的開發利用提供基礎信息。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

26株菌株來源于本實驗室保存的,從西藏羊八井地區牧民家庭的自然發酵牦牛酸乳中分離純化的菌種;MRS肉湯青島高科園海博生物技術公司;碳酸鈣(分析純)成都市科龍化工試劑廠;通用基因組DNA提取試劑盒、RNase A、蛋白酶K、DNA Lodaing Buffer、TAE緩沖溶液、瓊脂糖、Pfu DNA Polymerase、Pfu Buffer(含Mg2+)、dNTPs Mixture北京索萊寶科技有限公司;λDNA/HindⅢ、100 bp DNA Ladder天根生化(北京)科技有限公司;GelRed TM核酸染料Biotium中國總代理;引物1495R、27F上海生工生物工程公司。

Elix10純水系統、Biocel超純水系統美國Millipore公司;OLYMPUS-BX43生物顯微鏡日本奧林巴斯公司;S1000 Thermal Cycler梯度PCR儀、Mini-Sub Cell GT Cel小型水平電泳槽美國Bio-Rad公司;Gene Genius凝膠成像系統英國SynGene公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌株的活化鏡檢本實驗樣本原保存于含碳酸鈣的MRS固體培養基中,無菌條件下,從培養基表面挑取有溶鈣圈的單菌落接種于MRS液體培養基中,置于搖床中30 ℃振蕩培養24～48 h。將培養后的MRS液體培養基振蕩搖勻,劃線接種于MRS固體培養基中,置于恒溫培養箱中30 ℃培養48～72 h,觀察并記錄菌落形態。重復以上步驟連續純化兩代,挑取單菌落于載玻片上,進行革蘭氏染色[10]、鏡檢。

1.2.2菌株基因組DNA提取確定無雜菌后,再次挑取單菌落于MRS液體培養基中,置于搖床中30 ℃振蕩培養24 h,取培養液按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明對菌株進行DNA提取,并儲存于-20 ℃備用。

1.2.3PCR擴增

1.2.3.1PCR引物PCR擴增對象為菌株的16S rDNA基因。PCR所用引物為生工生物技術公司合成的16S rDNA基因通用引物27F及1495R。

上游引物27F序列:5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′

下游引物1495R序列:5′-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3′

1.2.3.2PCR擴增體系(25 μL反應體系)模板DNA1 μL,上游引物27F 0.5 μL,下游引物1495R 0.5 μL,10×Taq plus Buffer(含Mg2+)2.5 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)2.0 μL,Taq plus(2.5 μ/μL)1.0 μL,ddH2O 17.5 μL。

1.2.3.3 PCR擴增條件94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1.5 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,共30個循環;72 ℃延伸10 min。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物,電壓80 V,電泳時間40 min,經GelRed核酸染料染色后,在凝膠成像系統中觀察拍照。

1.2.516S rDNA PCR擴增產物測序、鑒定由北京華大基因公司對26株菌16S rDNA進行測序。用DNAStar 7.1中的SeqMan軟件進行序列拼接和校準,然后在Gene Bank數據庫中進行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)比對,利用其中的檢索庫進行序列的同源性分析并確定其種屬,根據樣本編號保存檢索結果,并按照種屬關系對樣本進行分類。

1.2.6系統發育進化樹的構建調取GenBank數據庫中收錄的16株乳酸菌的相同區段基因序列,利用ClustalX1.83軟件將測序菌株與標準菌株的16S rDNA基因序列進行多序列匹配比對,使用MEGA5.05軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)[11]計算,構建乳酸菌的系統進化樹,采用自舉分析進行置信度檢測,自舉數據集為1000次。

2　結果與分析

2.1菌株形態結構

如圖1、圖2所示,菌株劃線接種于MRS固體培養基培養后,有單菌落出現,菌落形態呈圓形,顏色呈乳白色,表面光滑,邊緣整齊,不透明。

圖1　Y13菌落形態Fig.1　Colony morphology of Y13

圖2　Y4菌落形態Fig.2　Colony morphology of Y4

如圖3、圖4所示,顯微鏡下細胞染色為藍紫色,為革蘭氏陽性菌;形態為球形、橢圓、短桿狀、長桿狀等,細胞形態符合乳酸菌特征。

圖3　Y13革蘭氏染色結果(1000×)Fig.3　Gram staining results of Y13(1000×)

圖4　Y4革蘭氏染色結果(1000×)Fig.4　Gram staining results of Y4(1000×)

2.2乳酸菌16S rDNA序列PCR擴增結果

擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖5所示,陰性對照無條帶,說明擴增未出現污染;1～26泳道均得到長度約1500 bp的特異性擴增片段,符合預期擴增片段長度。

圖5　乳酸菌PCR擴增產物16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.5　Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA-PCR products from lactobacillus注:M.100 bp DNA Ladder;0.空白組;1～26.編號為1～26的菌株。

2.3PCR擴增產物測序與GeneBank鑒定種屬

委托北京華大基因公司對擴增成功菌株的PCR產物進行雙向測序,獲得序列經SeqMan軟件拼接后,通過BLAST在GeneBank核酸序列數據庫中進行同源性比對,有效(同源率98%以上)結果如表1所示。

表1　16S rDNA序列鑒定26株菌結果

表2　26株乳酸菌的16S rDNA序列鑒定結果

結果表明,26株菌均鑒定成功,其中有2株乳酸菌與GeneBank數據庫中已知乳酸菌具有高達100%的同源性;22株有99%的同源性;2株有98%的同源性?？偨Y26株乳酸菌的分子生物學鑒定結果,如表2所示。

這26株乳酸菌經鑒定屬于3個屬,5個種。結果表明,西藏羊八井地區牦牛酸乳中球菌和桿菌分別以腸球菌屬(69.23%)和乳桿菌屬(23.07%)為優勢菌屬。

2.4系統發育分析結果

由該進化樹可知,從總體上可將這26株乳酸菌分為3個大群。即菌株Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y9、Y10、Y11、Y12、Y14、Y15、Y18、Y19、Y20、Y21、Y23、Y24、Y25和耐久腸球菌為第一群;菌株Y6、Y7、Y8、Y13、Y16、Y17、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌為第二群;菌株Y22、Y26、乳明串珠菌、腸系膜明串珠菌為第三群。同時,系統發育進化樹也表明腸球菌屬和明串珠菌屬之間的親緣關系較近,而與乳桿菌屬之間的親緣關系較遠。另外,第3、4、16、21株在各自進化枝內與其他菌株距離較遠,表明在種內也有較高的遺傳多樣性。綜合看來,西藏羊八井地區傳統發酵牦牛酸乳中含有豐富的乳酸菌菌種,反映出乳酸菌的生物多樣性。其優勢菌種為耐久腸球菌和干酪乳桿菌。這與其他研究者對西藏地區牦牛酸乳中乳酸菌的研究結果不同。例如,Yu等[9]采用16S rRNA-RFLP技術對西藏地區牦牛酸乳的乳酸菌多樣性進行了研究,發現發酵乳桿菌和瑞士乳桿菌是這一地區牦牛酸乳中的主要乳酸菌。楊俊俊[12]研究西藏牦牛奶渣中的乳酸菌,指出耐久腸球菌、類干酪乳桿菌干酪亞種、屎腸球菌和植物乳桿菌為主要乳酸菌;陳芝蘭等[13]對西藏地區傳統發酵乳中乳酸菌進行分離、鑒定,發現其中的優勢菌株為干酪乳桿菌、植物乳桿菌和類布氏乳桿菌。由此可見,西藏不同地區傳統發酵乳制品中乳酸菌菌種含量豐富,不同地區、甚至相同地區不同作坊的發酵乳、菌種也會有較大差異,發映出乳酸菌的生物多樣性。

圖6　26株乳酸菌系統發育進化樹Fig.6　Phylogenetic tree of the 26 lactobacillus strains

雷霞[14]和旭日花[15]對內蒙古不同地區的酸牛奶為研究對象進行了乳酸菌的分離鑒定,均分離得到了干酪乳桿菌、耐久腸球菌,同時,雷霞還分離到了乳明串珠菌,說明干酪乳桿菌、耐久腸球菌、乳明串珠菌是酸乳中常見的乳酸菌。Ao[16]等對四川紅原地區牦牛酸乳的研究發現,耐久腸球菌、發酵乳桿菌和副干酪乳桿菌是其中的優勢乳酸菌。楊俊俊[12]發現耐久腸球菌是西藏牦牛奶渣中的主要乳酸菌。不同地區的傳統發酵乳制品中都發現了耐久腸球菌,有些甚至發現耐久腸球菌為優勢乳酸菌。乳制品中出現腸球菌大多數是由于生產過程中受到糞便的污染,但許多傳統發酵乳制品中都分離出了耐久腸球菌和屎腸球菌,且有研究發現,腸球菌能促進干酪成熟,改善奶酪的風味和口感[17],耐久腸球菌可以改善傳統發酵酸乳的外觀和質地[16]。

3　結論

對西藏羊八井地區傳統發酵牦牛酸乳中26株菌進行鑒定,發現有2株乳酸菌與GeneBank數據庫中已知乳酸菌具有高達100%的同源性;22株有99%的同源性;2株有98%的同源性。采用16S rDNA序列分析對傳統發酵牦牛酸乳中的乳酸菌進行分子生物學鑒定,準確度高、結果可靠。經鑒定,實驗中26株乳酸菌包括腸球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬等3個屬,耐久腸球菌(69.23%)、干酪乳桿菌(15.38%)、副干酪乳桿菌(7.69%)、腸系膜明串珠菌(3.85%)、乳明串珠菌(3.85%)等5個種。這說明西藏羊八井地區傳統發酵牦牛酸乳中乳酸菌資源種類豐富,其中耐久腸球菌和干酪乳桿菌為主要的乳酸菌。西藏羊八井地區傳統發酵牦牛酸乳中分離的乳酸菌種與其他地區奶制品中分離的乳酸菌存在明顯差異,推測造成這些差異的原因主要包括所用原料、制作工藝、發酵條件等方面。實驗中分離到的乳桿菌可以進行后續的益生性能和發酵優良乳酸菌的篩選。

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Identification of lactobacillus isolated from fermented yak milk in Tibetan Yangbajing area

LIU Shan-chun1,2,ZHAO Xin3,QIAN Yu3,LI Jian4,5,CHEN Lian-hong4,5,CHEN Juan5,SUO Hua-yi1,2,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China; 2.Chongqing Engineering Research Center of Regional Food,Chongqing 400715,China; 3.Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China; 4.Institute of Qinghai-Tibetan Plateau,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China; 5.College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

The 26 strains isolated from traditional fermented yak milk in Yangbajing area were identified by morphological and molecular identification,including 18Enterococcusstrains,6Lactobacillusstrains,2Leuconostocstrains.Construct phylogenetic tree to analysis the genetic diversity oflactobacillusand compare with thelactobacillusthat were separated from other places,finding that they have rich biodiversity,EnterococcusandLactobacilluswere the most common culturable species.

Lactobacillus;yak yogurt;identification;16S rDNA

2015-11-09

劉珊春(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：發酵微生物，E-mail：liushanchun516@163.com。

索化夷(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：發酵微生物，E-mail：birget@swu.edu.cn。

國家公益性行業(農業)科研專項(201303085)；重慶市社會民生科技創新專項(cstc2015shmszx80021)；重慶市特色食品工程技術研究中心能力提升項目(cstc2014pt-gc8001)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)10-0208-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.034