水塔老陳醋大曲酵母的分離鑒定及產乙醇和乙酸乙酯特性

董凱鋒,安　娜,李東樂,鄧漢森,車建途,*

(1.北京威力格生物科技有限公司,北京 102200;2.山西水塔醋業股份有限公司,山西太原 030404)

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水塔老陳醋大曲酵母的分離鑒定及產乙醇和乙酸乙酯特性

董凱鋒1,2,安娜1,2,李東樂1,2,鄧漢森1,車建途1,2,*

(1.北京威力格生物科技有限公司,北京 102200;2.山西水塔醋業股份有限公司,山西太原 030404)

采用傳統分離培養方法,從水塔老陳醋大曲中分離純化出21株酵母菌,利用26S rDNA D1/D2序列分析方法結合形態學特征,對分離純化的酵母菌進行鑒定,并用其發酵糯米糖化液,用靜態頂空-氣質聯用的方法測定發酵后乙醇和乙酸乙酯的含量。結果發現:21株酵母菌鑒定結果為2株弗比恩酵母(Cyberlindnerafabianii),8株扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、6株異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、3株葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)、2株東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)。21株菌株發酵后產物乙醇和乙酸乙酯的含量存在較大差別,其中產生乙酸乙酯和乙醇最多的菌株分別為異常威克漢姆酵母m12(含量為4.4415 g/L)和扣囊復膜酵母q25(含量為48.577 g/L);產生最少的則分別為扣囊復膜酵母q6(含量為0.0037 g/L)和東方伊薩酵母q12(含量為11.4555 g/L)。提示老陳醋大曲中不同種類的酵母菌在發酵中對乙醇和乙酸乙酯具有不同的貢獻。

老陳醋大曲,酵母菌,靜態頂空-氣質聯用,乙醇,乙酸乙酯

山西老陳醋歷史悠久,風味獨特,是我國的四大名醋之一。老陳醋釀造過程中大曲起到了關鍵作用。大曲是經過長期馴化,多種微生物彼此共存、順序生長和代謝互補的微生物群體[1]。從大曲中篩選優勢功能菌株,再將其應用于改善大曲的微生物群落結構是優化老陳醋大曲的重要措施之一。山西老陳醋相關的微生物研究多集中于產酸功能菌、紅曲霉、高糖化酶菌株,未見用分子生物學技術和傳統方法結合研究大曲中酵母菌的報道[2-5]。酵母菌是老陳醋釀造過程中產酒和生香的關鍵功能菌,直接影響釀酒過程,進而影響老陳醋的出品率和風味[1]。本實驗從山西水塔老陳醋大曲(簡稱大曲)中篩選出21株酵母菌,通過對其26S rDNA D1/D2測序進行菌株鑒定并分別發酵糯米糖化液,采用靜態頂空-氣質聯用法分析各菌株發酵產乙醇和產乙酸乙酯的含量,確定各菌株的發酵產乙醇和產乙酸乙酯的能力。為進一步優化老陳醋大曲提供數據支持。

1　材料和方法

1.1材料和儀器

大曲由水塔醋業股份有限公司提供;酵母膏、蛋白胨、瓊脂粉、葡萄糖購自北京奧博星生物技術有限責任公司;糯米購自市場;α-高溫淀粉酶、糖化酶購自四川省山野生物科技有限公司;氯化鈉分析純,購自天津市光復科技發展有限公司;Dream Taq Green PCR Master Mix購自Fermentas;Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR購自寶生物工程有限公司;富集培養基酵母粉1%,葡萄糖2%,蛋白胨2%,調pH至4.5培養基滅菌后再加入鏈霉素(終濃度30 μg/mL)、青霉素(終濃度為50 μg/mL),孟加拉紅0.033 mg/mL;YPD固體培養基2%酵母膏、1%蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂粉;YPD液體培養基2%酵母膏、1%蛋白胨、2%葡萄糖。

電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;全自動高壓蒸汽滅菌鍋上海博訊實業有限公司;DK-450B型電熱恒溫水槽上海森信實驗儀器有限公司;HWS智能型恒溫恒濕箱寧波江南儀器廠;HZQ-F100全溫振蕩培養箱太倉市豪誠實驗儀器制造有限公司;分光光度計、BK-FL2熒光顯微鏡重慶奧特光學儀器有限責任公司;GeneAmp PCR System 2720(ABI)賽默飛世而科技(中國)有限公司;ChampGel凝膠成像分析系統北京賽智創業科技有限公司;7890A-5975C型氣質聯用儀(GC-MS)美國安捷倫科技有限公司;HSS 86.50型全自動頂空進樣器意大利DANI公司。

1.2實驗方法

1.2.1酵母菌的分離純化將10 g曲粉加入100 mL無菌蒸餾水中,振蕩(28 ℃,200 r/min)20 min。取菌懸液3 mL接種于富集培養基中,振蕩(28 ℃,200 r/min)培養48 h,從中取出菌液1 mL加入9 mL無菌蒸餾水,配制成10-2菌懸液,再依次配制10-3、10-4、10-5、10-6菌懸液,取0.1 mL涂布于YPD固體平板上,28 ℃下恒溫培養24 h,挑選典型酵母單菌落,傳代4次后,4 ℃保存備用。

1.2.2酵母菌形態學觀察將酵母菌接種于YPD固體培養基平板中,28 ℃下培養3 d,觀察平板中菌落的形態,并挑起菌體制片,在顯微鏡下觀察酵母菌的細胞形態。

1.2.3酵母菌基因組DNA的制備按說明書(Instruction of Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR)方法分別制備21株酵母菌基因組DNA作為26S D1/D2擴增模板。

1.2.4PCR擴增rDNA 26S D1/D2正向引物NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′),反向引物NL-4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。反應體系(50 μL)為:模版5 μL(50 μg),引物各2 μL(20 pmol/μL),Taq DNA聚合酶Mix 25 μL,去離子水16 μL。

擴增程序:95 ℃變性5 min;95 ℃、1 min,55 ℃、1 min,72 ℃、2 min,共35個循環;72 ℃、10 min。對擴增產物進行測序。將rDNA測序結果輸入數據庫http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/,通過BLAST程序與數據庫中的序列進行比對分析。

1.2.5種子液制備將保存的菌種劃線轉接YPD固體培養基中,28 ℃培養2～3 d,重復劃線和培養三次以活化菌種。菌種活化后轉接于YPD液體培養基中,振蕩培養(28 ℃,200 r/min)1 d,得到種子液。

1.2.6糯米糖化液的制備和接種發酵預煮:稱取糯米1000 g,加水(料水比1∶3.4)攪拌均勻后75 ℃水浴1 h。

糊化:加750 μL耐高溫α-淀粉酶(酶活20000 U/mL),攪拌均勻,95 ℃保溫2 h。

糖化:待滅菌鍋自然降溫至90 ℃以下,取出糊化液冷卻至62 ℃,加入糖化酶2 mL(酶活100000 U/mL),62 ℃保溫1 h。

酒精發酵:按照每100 mL發酵液加入1 mL種子液。30 ℃生化培養箱中培養3 d后封口發酵7 d,得到酒精發酵液。

1.2.7酒精發酵液中乙醇和乙酸乙酯含量測定樣品前處理:精確取2.00 mL酒精發酵液上層液體,置于20 mL頂空瓶中,密封壓蓋;

頂空條件:加熱爐、取樣系統和傳輸管操作溫度分別為20、85、110 ℃;樣品在爐內加熱時間為20 min。選擇其中2個樣品做重復性測試。

氣相條件:色譜柱為HP-INNOWAX(60.0 m×250 μm,0.25 μm);色譜柱初始溫度40 ℃(保持3 min),以5 ℃/min的速度升至80 ℃,繼之以10 ℃/min升至200 ℃(保持5 min);氣化室和傳輸線溫度分別為250 ℃和220 ℃;載氣He;載氣流量1.0 mL/min;分流進樣(分流比100∶1)。

質譜條件:EI源;電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿150 ℃;掃描模式Scan;掃描質量范圍為30～500 u。

1.3數據分析

采用外標法對乙醇和乙酸乙酯進行定量。首先根據樣品中乙醇和乙酸乙酯峰面積的大致響應范圍,分別配制兩種物質的系列標準溶液,然后按照樣品測試的實驗條件,測試各標準溶液中二者的峰面積,最后利用最小二乘法計算乙醇和乙酸乙酯的線性回歸方程,結果如下:

乙醇低濃度標準溶液范圍:0～9.53 g/L,回歸方程:y=5606951.2x+791724.4,R2=0.998;高濃度標液范圍:9.53～296.87 g/L,回歸方程:y=2588367.9x+59013372.0,R2=0.992。

表1　26S D1/D2測序比對分析

乙酸乙酯低濃度標液范圍:0～0.75 g/L,回歸方程:y=101653279.3x-172461.2,R2=0.9997;高濃度標液范圍:0.75～13.11 g/L,回歸方程:y=72043695.8x+21651150.8,R2=0.9999。

2　結果與討論

2.1酵母菌菌落和細胞形態特征

從大曲中分離得到21株優勢酵母菌。依據酵母形態學特征,將菌株進行初步分類,選取其中10株具有代表性的菌株描述其菌落和細胞形態(圖1)。

圖1　酵母菌的菌落形態(Lane1,Lane3)和光學顯微鏡下的菌體形態(Lane2,Lane4,400×)Fig.1　Colony morphological phenotypes of yeasts isolated from DAQU(Lane1,Lane3)and the cellular morphology under light microscope(Lane2,Lane4,400×)

菌落m10、q28、m12、q13、m25、q34表面濕潤光滑,有光澤,凸起,邊緣整齊;m17和q10表面干燥,褶皺,邊緣為裂片狀,隆起;q7和q12表面濕潤,無光澤,邊緣絲狀延伸,隆起。細胞以出芽方式生殖,m10和q28為圓形,m12、q13、m17和q10為橢圓形,m25和q34既有橢圓形又有圓形,q7和q12為梭形。

2.2酵母菌26S rDNA D1/D2序列分析

從大曲中分離的21株優勢酵母菌26S rDNA D1/D2序列分析結果見表1。

由表1測序結果可知,21株酵母的鑒定結果為2株弗比恩酵母(Cyberlindnerafabianii)分別為m10、q28,8株扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)分別為q6、q33、q25、m11、m26、q10、q14、m17,6株異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)分別為q3、q13、q27、q19、m15、m12,3株葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)分別為m25、q2、q34,2株東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)分別為q7、q12。q3等菌種在NCBI數據庫中比對結果與異常威克漢姆酵母、異常畢赤酵母相似度均為99%,最新酵母分類學將部分異常威克漢姆酵母、異常畢赤酵母、異常漢遜酵母三種酵母歸為同物異名[6]。老陳醋大曲中微生物的分離鑒定多采用生理生化結合形態觀察的方法[7-8],而本研究對分離菌株進行26S rDNA D1/D2測序分析,使鑒定結果更加準確[9]。

2.3乙醇和乙酸乙酯含量

21株酵母酒精發酵液中乙醇及乙酸乙酯生成量如圖2所示。

圖2　靜態頂空-氣質法測得酒精發酵液中乙醇和乙酸乙酯含量Fig.2　The content of ethyl acetate and ethyl acetate in the fermented solution after fermentation with each of the yeasts using static headspace-GC-MS

圖2顯示,21株酵母均能利用糯米糖化液發酵產生乙醇,同種類酵母菌比較,多數菌株產生乙醇量較為接近,但某些種類菌株產生的乙醇量變化范圍比較大。如異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)產生的乙醇量最高(q19)為46.2845 g/L,最低(m12)為22.5805 g/L,相差一倍多。不同種類酵母菌之間比較,葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)m25、q2、q34發酵產乙醇相對較多,東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)q12、q7則相對較少,差別最大(q34與q12之間)能達到三倍以上;不同種類酵母菌產生乙酸乙酯差異明顯,依次為:異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)m12、m15、q13、q19、q27、q3>弗比恩酵母(Cyberlindnerafabianii)m10、q28>葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)m25、q2、q34>東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)q12、q7>扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)m11、m17、m26、q6、q10、q14、q25、q33。異常威克漢姆酵母菌(Wickerhamomycesanomalus)m12產乙酸乙酯最多,含量為4.4415 g/L,扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)q25產乙醇最多,含量為48.577 g/L。產生最少的則分別為扣囊復膜酵母q6(含量為0.0037 g/L)和東方伊薩酵母q12(含量為11.4555 g/L)。

從自然界中富集酵母產乙酸乙酯和乙醇的研究已有很多報道,如靳艷玲等[10]利用釀酒酵母發酵甘蔗產生乙醇量達到132.26 g/L;朱浩里等[11]以早秈稻糖化液為原料,用釀酒酵母發酵,發現乙醇得率為0.463 g/g;李銳利[12]從釀造用小曲中分離篩選得到一株高產乙酸乙酯酵母菌株產乙酸乙酯量為2.152 g/L;王濤等[13]從濃香型白酒釀造過程中篩選122株酵母,最高產乙酸乙酯的菌株為畢赤酵母產量為3.74 g/L。與本研究比較可發現分離出來的產乙醇量最高的酵母q25產乙醇的量明顯低,這可能是因為酵母發酵產乙醇受到各種發酵條件和酵母種類的影響,相關研究表明,扣囊復膜酵母一方面可以直接利用淀粉發酵[14],另一方面可以和釀酒酵母協同作用在酒精發酵中發揮作用[15];酵母m12產乙酸乙酯的量要略高,獲得的產酯性能優良的m12菌株可以進一步研究發酵特性,優化發酵條件,提高乙酸乙酯的產量,應用于老陳醋的生產過程。

3　結論

從山西水塔老陳醋釀造大曲中富集分離純化出21株酵母菌,對形態學初步鑒定完全符合酵母特征,進一步分子生物學鑒定結果為2株弗比恩酵母,8株扣囊復膜酵母、6株異常威克漢姆酵母、3株葡萄牙棒孢酵母、2株東方伊薩酵母。

采用靜態頂空-氣質聯用的方法測定21株酵母菌發酵后糯米糖化液的乙醇和乙酸乙酯含量,測定結果表明產生乙酸乙酯最多的菌株為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)m12,產量為4.4415 g/L,產生乙醇最多的是扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)q25,產量為48.577 g/L,產生最少的則分別為扣囊復膜酵母q6(含量為0.0037 g/L)和東方伊薩酵母q12(含量為11.4555 g/L)。

本實驗初步研究了從大曲中分離的21株酵母菌的產乙醇和乙酸乙酯的特性,為進一步研究、優化大曲提供了數據支持。

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Isolation and identification of yeats in Daqu for aged vinegar production and their capacity for producing ethly alcohol and ethly acetate

DONG Kai-feng1,2,AN Na1,2,LI Dong-le1,2,DENG Han-sen1,CHE Jian-tu1,2,*

(1.S&V Biological Science and Technology Co.,Ltd.,Beijing 102200,China; 2.Shanxi Shuita Vinegar Industry Co.,Ltd.,Taiyuan 030404,China)

Twenty-one yeast strains were isolated from Daqu,a starter participating in fermentation particularly for producing aged vinegar,via conventional yeast culture. The colony and cellular morphological characteristics of the yeasts were observed. The sequence analysis of 26S rDNA(D1/D2 region)from the yeasts was subsequent performed to further identify the strains. The fermentation with each of these yeasts was finally carried out,and ethyl alcohol,as well as ethyl acetate in fermented solution were detected using static headspace-GC-MS for investigation of their function. The results showed that the isolated yeast strains contained 2Cyberlindnerafabianii,8Saccharomycopsisfibuligera,6Wickerhamomycesanomalus,3Clavisporalusitand 2Issatchenkiaorientalisstrains. All isolated yeast strains had capacity to produce ethyl alcohol,but the concentrations were different between the strains. Ethyl acetate was also produced,which concentration was various in different strains. The highest levels of ethyl acetate and ethyl alcohol produced byWickerhamomycesanomalusm12 andaccharomycopsisfibuligeraq25 reached 4.4415 g/L and 48.4577 g/L respectively in fermented liquor,while the lowest levels bySaccharomycopsisfibuligeraq6 andIssatchenkiaorientalisq12 were 0.0037 g/L and 11.4555 g/L. These data indicated that the contribution of the yeast strains in Daqu on producing ethyl alcohol and ethyl acetate for aged vinegar might be different.

Daqu(used for aged vinegar production only);yeast;static headspace gas chromatographymass spectrometry;ethyl ethanol;ethyl acetate

2015-10-19

董凱鋒(1984-)，男，碩士研究生，主要從事發酵食品原理與技術方面的研究，E-mail：dongfeng2005485@163.com。

車建途(1952-)，男，博士，教授，主要從事分子微生物以及藥理學方面的研究，E-mail：chejiantu@126.com。

TS201.3

A

1002-0306(2016)10-0213-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.035