腐敗楊梅中兩株細菌的分離與鑒定

蔣會芳,冉火苗,孔望君,辛志宏

(南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

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腐敗楊梅中兩株細菌的分離與鑒定

蔣會芳,冉火苗,孔望君,辛志宏*

(南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

以腐爛楊梅為研究對象,采用平板劃線分離與斜面純化技術,篩選出兩株編號為YMS-7和YMN-5的細菌,分別提取兩株菌的DNA后,擴增16S rDNA序列并克隆測序,獲得的基因序列在EzBioCloud數據庫中進行同源性比對,構建16S rDNA系統發育樹,結合生理生化分析,將YMS-7和YMN-5分別鑒定為類芽孢桿菌Paenibacillusagaridevorans與嗜氣芽孢桿菌Bacillusaerophilus。

楊梅,菌株鑒定,16S rDNA基因,系統發育分析

楊梅(MyricarubraSieb. et Zucc.)別名樹梅、珠紅、系楊梅科楊梅屬植物[1],主要產自我國的浙江、福建等省[2]。楊梅果實色澤鮮艷,味道甜美,富含多種營養成分。又因其性平、無毒且有止咳生津、消食利尿等功能,深受消費者喜愛[1]。然而,楊梅果實多汁柔嫩,極易在采摘、運輸過程中造成果實腐爛,嚴重制約了楊梅的異地銷售和鮮果出口[3-4],據報道,楊梅采后4 d,其病變率達到43.7%[5]。研究表明導致楊梅不易儲存的主要原因有:楊梅果實外表無結構致密的皮層,在采收、貯運過程中,極易受到碰傷、積壓等物理性因素的損害,使果實衰老劣變加速。楊梅采后自身生理生化特性的變化,進一步促進果實的衰老[6-7]。加之楊梅成熟時高溫多雨,適于微生物在果實中快速附著、定殖,尤其是病原微生物的生長繁殖,加速了楊梅的腐敗[8]。因此,分離鑒定浸染微生物是確定楊梅腐敗變質的關鍵問題。張宏等從楊梅中分離出微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)、托姆青霉(P.thomii)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、尖鐮孢(Fusariumoxysporium)、鏈格孢(Alternariaalternata)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)等六種病原真菌[9];王根鍔等從常溫貯藏的楊梅中分離出楊梅輪帚霉(Verticicladiellaabietina(Peck)Hughes)、桔青霉(P.CitrinumTom)、綠色木霉(TrichodermaViridepers.exFr.)等三種病原真菌[5]。曹宜[10]等從腐敗楊梅中分離出4株病原細菌和2株病原真菌,然而,其并未對病原細菌的種屬地位進行鑒定,只是從形態學的角度進行了初步的分類。因此,目前有關楊梅腐敗菌的研究,大多集中在病原真菌的分類鑒定方面,對腐敗細菌的分類鑒定研究尚未見報道。

傳統的細菌分類鑒定主要通過觀察菌種的形態和生理生化等表型特征來確定其種屬地位。然而,細菌種類繁多、形態特征較為相似,且少數形態特征和生理生化指標隨著環境的變化而不穩定,僅依靠形態、生理生化等表型特征來鑒定細菌,既需要豐富的細菌鑒定工作經驗又需要較長的檢驗時間,顯然,這種傳統的方法不能高效地分離鑒定出菌株的種屬地位,存在一定的局限性。20世紀60年代末,C R Woese開始采用寡核苷酸編目法對生物進行分類,他認為16S rRNA及其類似的rRNA基因序列作為生物系統發育指標最為合適[11]。自此以后,隨著核糖體數據庫的日益完善,分子生物學鑒定技術成為細菌分類和鑒定的有力工具。

本研究以腐爛楊梅為研究對象,采用稀釋梯度法和平板劃線分離技術得到兩株編號YMS-7和YMN-5的細菌,在形態學觀察和生理生化分析的基礎上,結合現代分子生物學技術,進行16S rDNA基因片段的擴增,構建16S rDNA系統發育樹,對其進行分類鑒定,確定其種屬地位。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

采自江蘇省南京市石湫鎮種植的楊梅裝入塑料保鮮袋,置于4 ℃冰箱保存14 d取出,選取腐爛的楊梅果肉為供試材料,分離細菌[10];微生物培養基所需材料購自南京壽德試劑器材有限公司;OMEGA細菌基因組試劑盒(Bacterial DNA Kit(50))及引物16S(F)/16S(R)、M13-47/M13-RV購自上海捷瑞生物工程有限公司;PCR相關試劑(包括Lodding Buffer等)購自南京諾唯贊生物科技有限公司;基因序列測定由上海美吉生物有限公司完成。

無菌工作臺SW-CJ-1FD蘇州凈化集團設備有限公司;Microfuge 22R臺式微量冷凍離心機美國Beckman公司;TP600型梯度PCR儀日本TaKaRa公司;DYCP-31DN電泳儀北京市六一儀器廠;JS-380C自動數碼凝膠成像分析儀上海培清科技有限公司。

1.2培養基

LB培養基(g/L):胰蛋白胨 10、酵母提取物 5、氯化鈉 10、瓊脂 18、pH7.0。

牛肉膏蛋白胨培養基(NA)(g/L):牛肉膏 5.0、蛋白胨 10.0、氯化鈉 5.0、瓊脂 18、pH7.2～7.4。

1.3菌株分離與純化

取數顆體積相同的單個腐爛楊梅,分別置于無菌研缽中研磨出汁液,得到楊梅原液,取1 mL原液置于9 mL無菌水中,制成10-1的楊梅稀釋液,同理,依次制備10-2、10-3、10-4、10-5、10-6楊梅稀釋液,取200 μL稀釋液分別涂布于NA培養基上,30 ℃培養2～3 d,挑取平板上菌落形態規則的單個菌落接種經劃線純化后,接于LB斜面得到單個純的菌落,置于4 ℃保藏。

1.4菌株生理生化特性測定

參考《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[12]、《常見細菌系統鑒定手冊》[13]和《微生物學實驗》[14]的方法,測定該菌株的生理生化特征。測定指標主要包括耐鹽性、接觸酶和氧化酶反應、淀粉水解、果膠水解、硝酸鹽還原、苯丙氨酸脫氫酶、糖醇類發酵產酸等。

1.5基因組DNA的提取

從保藏菌種的斜面培養基中挑取菌體轉接到LB液體培養基中,30 ℃搖床振蕩培養24 h。基因組DNA的提取采用細菌基因組試劑盒,按照說明書操作。提取的基因組DNA經1%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(120 V,30 min),溴化乙錠(EB)染色。4 ℃保存備用,或于-20 ℃中長期保存。

1.616S rDNA基因片段的PCR擴增

16S區域的擴增選擇原核生物 16S rDNA通用引物 16S(F)(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和16S(R)(5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′),PCR反應條件為:94 ℃預變性3 min,94 ℃變性 30 s,50 ℃退火45 s,72 ℃延伸100 s,共35個循環,最后72 ℃延伸7 min。

PCR擴增采用50 μL的反應體系,包括ddH2O 19 μL,2×Taq Master Mix 25 μL,引物16S(F)(10μmol/L)2 μL、16S(R)(10μmol/L)2 μL,DNA 2 μL。

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后4 ℃保存備用。

1.716S rDNA基因片段克隆測序

采用DNA提取試劑盒Ver.3.0回收PCR產物,純化的PCR產物與pMD19-T載體連接,然后轉化至大腸桿菌DH5α制備的感受態細胞中,使用氨芐抗性培養基LB瓊脂平板篩選白色單菌落,挑取白色單菌落于LB液體培養基中,37 ℃振蕩培養12 h,取1 μL菌液直接做PCR,引物為M13-47(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和M13-RV(5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′),電泳檢測是否含有目的片段。PCR反應條件為:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共30個循環,最后72 ℃延伸10 min。

PCR采用25 μL的反應體系,包括ddH2O 9.5 μL,2×Taq Master Mix 12.5 μL,引物M13-47(10 μmol/L)1 μL、M13-RV(10 μmol/L)1 μL,DNA 1 μL。

PCR擴增產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,EB染色,并用凝膠成像系統拍照記錄。

1.8目的DNA序列測序和系統發育學分析

將16S rDNA的單克隆PCR產物交由上海美吉生物有限公司進行測序。獲得基因序列后,利用DNAMAN拼接序列,在EzBioCloud中進行EzTaxon比對,下載與供試菌株序列同源性相近的模式菌株序列,利用MEGA 6.0軟件 Neighbor-Joining(N-J)方法構建系統發育樹,自展數為1000。

2　結果與分析

2.1生理生化分析

菌株YMS-7在LB培養基上生長良好,最適生長溫度為30 ℃,形成乳白色菌落,半透明,表面光滑濕潤,邊緣整齊,菌落無色素產生。生理生化反應測定指標顯示(表1),菌株YMS-7在含2% NaCl 的培養基中能夠正常生長,但在含5% NaCl 的培養基中無法生長;糖發酵產酸實驗結果表明,YMS-7能夠利用D-葡萄糖、海藻糖、D-蔗糖、D-乳糖、D-半乳糖、D-麥芽糖等多種碳源,但是不能利用D-果糖、D-甘露醇、D-木糖等碳源;接觸酶、氧化酶、硝酸還原反應等均為陽性;而V-P反應、甲基紅反應、檸檬酸鈉利用、淀粉水解、果膠水解以及苯丙氨酸脫氨酶等反應均為陰性。上述生理生化指標與文獻報道的模式菌株PaenibacillusagaridevoransDSM 1355T的生理生化指標高度相似[15]。

表1　菌株YMS-7、YMN-5與對照菌株的生理生化分析匯總表[15-16]

注:+,表示陽性;-,表示陰性;WH,表示白色;NR,表示未報道。

菌株YMN-5在LB培養基上生長良好,最適生長溫度為30 ℃,形成白色菌落,不透明,表面不光滑,邊緣不整齊,菌落無色素產生。生理生化反應測定指標顯示(表1),菌株YMN-5的耐鹽性可達10%,能夠充分利用D-葡萄糖、海藻糖、D-蔗糖、D-乳糖、D-半乳糖、D-麥芽糖、D-果糖、D-甘露醇、D-木糖等多種碳源發酵產酸,接觸酶、氧化酶、V-P反應、檸檬酸鈉利用、淀粉水解、硝酸還原反應等均為陽性,甲基紅反應為陰性。上述生理生化特征與文獻報道的模式菌株Bacillusaerophilus28KT的生理生化特征基本相符[16]。

2.216S rDNA的測序結果

菌株YMS-7與YMN-5的16S rDNA 基因片段經單克隆后得到的電泳圖譜,如圖1所示,菌株YMS-7基因片段大小約1.6 kb,基因測序之后得到該菌株的16S rDNA的基因片段全長為1614 bp;菌株YMN-5基因片段大小約1.5 kb,基因測序之后得到該菌株的16S rDNA的基因片段全長為1448 bp。瓊脂糖電泳檢測與序列測序得到的基因片段大小一致。

圖1　菌株YMS-7和YMN-5的16S rDNA基因的凝膠電泳圖Fig.1　Electrophoresis of PCR products of 16S rDNA注:1,菌株YMS-7;2,菌株YMN-5;M,DNA分子質量標準。

2.3系統發育學分析

系統發育樹是基于共同祖先的原則,是用來描述生物傳代譜系的常用表達方式,它可以直觀地表達分類群、物種或基因之間的親緣關系和進化方向[17]。

菌株YMS-7與YMN-5經PCR擴增得到16S rDNA、克隆測序序列,將序列提交到EzBioCloud中進行同源性搜索,結果如表2所示。從表2可以看出,菌株YMS-7與PaenibacillusagaridevoransDSM 1355T同源性最高(98.53%)。根據同源性比較結果,可以推測菌株YMS-7為類芽孢桿菌屬細菌;從表3可知,菌株YMN-5與Bacillusaerophilus28KT的16S rDNA同源性最高,達到99.31%。因此,推測菌株YMN-5為芽孢桿菌屬細菌。

表2　菌株YMS-7構建系統發育樹所用類芽孢桿菌屬16S rDNA序列登錄號

表3　菌株YMN-5構建系統發育樹所用芽孢桿菌屬16S rDNA 序列登錄號

YMS-7菌株構建系統發育樹所用的類芽孢桿菌參考菌株16S rDNA 序列登錄號見表2。選取OxalophagusoxalicusDSM 5503T(Y14581)[18]作為外組。如圖2所示,每一個種都形成一個獨立的分支,且菌株YMS-7與PaenibacillusagaridevoransDSM 1355T聚為一支,其自展支持率為99%。表明菌株YMS-7與PaenibacillusagaridevoransDSM 1355T親緣關系最近。同源性比對結果與系統發育樹分析得到的結果一致。因而進一步表明,菌株 YMS-7為類芽孢桿菌Paenibacillusagaridevorans。

圖2　基于菌株YMS-7 16S rDNA基因序列構建的系統發育進化樹Fig.2　Phylogenetic tree based on the 16S gene sequence of strain YMS-7

圖3　基于菌株YMN-5 16S rDNA基因序列構建的系統發育進化樹Fig.3　Phylogenetic tree based on the 16S gene sequence of strain YMN-5

YMN-5菌株構建系統發育樹所用的芽孢桿菌參考菌株16S rDNA序列登錄號見表3。選取MicrococcusluteusDSM 20030T(AJ536198)[16]作為外組。如圖3所示,菌株YMN-5與Bacillusaerophilus28KT聚為一支,其自展支持率為100%。表明菌株YMN-5與Bacillusaerophilus28KT親緣關系最近。與同源性比對結果一致,進一步表明,菌株YMN-5為嗜氣芽孢桿菌Bacillusaerophilus。

結合形態學特征和生理生化結果,以及基于16S rDNA 的系統發育樹分析,將菌株YMS-7鑒定為細菌界Bacteria、厚壁菌門Firmicutes、細菌綱Bacilli、芽孢桿菌目Bacillales、類芽孢桿菌科Paenibacillaceae、類芽孢桿菌屬Paenibacillacillus、類芽孢桿菌Paenibacillusagaridevorans。菌株YMN-5鑒定為細菌界Bacteria、厚壁菌門Firmicutes、細菌綱Bacilli、芽孢桿菌目Bacillales、芽孢桿菌科Bacillaceae、芽孢桿菌屬Bacillus、嗜氣芽孢桿菌Bacillusaerophilus。

3　結論

采用傳統的形態學鑒定與現代的分子生物學鑒定相結合的方法,對分離來自腐爛楊梅中的兩株細菌 YMS-7與 YMN-5進行分離鑒定。提取菌株基因組 DNA后,擴增16S rDNA基因片段,經過TA克隆后,進行基因序列測序,所得測序結果提交到EzBioCloud數據庫,進行有效種的序列相似性搜索,下載與供試菌株16S rDNA序列同源性相近的菌株序列,構建16S rDNA基因序列進化樹,進行系統發育分析,結合形態學特征和生理生化特性,依據細菌鑒定手冊標準菌株對照,將菌株 YMS-7與 YMN-5分別鑒定為類芽孢桿菌P.agaridevorans和嗜氣芽孢桿菌B.aerophilus。這兩株細菌均為首次從腐爛楊梅中分離鑒定得到。今后將對這兩株細菌的致腐性進行全面研究,了解它們的來源以及其導致楊梅腐敗的機理,為研制開發出抑制楊梅腐爛速率的拮抗菌提供腐敗細菌。

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Isolation and identification of two bacteria from rottenMyricarubra

JIANG Hui-fang,RAN Huo-miao,KONG Wang-jun,XIN Zhi-hong*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

In this study,two strains of bacteria coded as YMS-7 and YMN-5 were isolated from rottenMyricarubrausing plate streaking and slant culture methods. After extraction of DNA,16S rDNA from both strains were amplified for sequencing and homology analysis using EzBioCloud database. Two phylogenetic trees were established based on these sequences of 16S rDNA,combined with physiological and biochemical characteristics. Consequently,YMS-7 and YMN-5 were identified asPaenibacillusagaridevoransandBacillusaerophilus,respectively.

Myricarubra;identification;16S rDNA;phylogenetic analysis

2015-11-11

蔣會芳(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品營養與安全，E-mail：2013108086@njau.edu.cn。

辛志宏(1974-)，男，博士，教授，研究方向：食品營養與安全，E-mail：xzhfood@njau.edu.cn。

2015年農產品質量安全風險評估項目(GJFP2015012)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)10-0260-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.044