多棘海盤(pán)車(chē)體壁脫鈣工藝的研究

李　曉,王　穎,*,李紅艷,吳志宏,劉天紅,孫元芹,劉　偉

(1.山東省海洋生物研究院,山東青島 266100;2.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所,山東青島 266071)

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多棘海盤(pán)車(chē)體壁脫鈣工藝的研究

李曉1,王穎1,*,李紅艷1,吳志宏1,劉天紅1,孫元芹1,劉偉2

(1.山東省海洋生物研究院,山東青島 266100;2.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所,山東青島 266071)

多棘海盤(pán)車(chē)體壁主要由膠原纖維形成的三維立體網(wǎng)構(gòu)成,孔洞由無(wú)機(jī)物填充,鈣含量高。為提取膠原蛋白或明膠,首先要對(duì)多棘海盤(pán)車(chē)的體壁進(jìn)行脫鈣處理。本文主要研究鹽酸對(duì)多棘海盤(pán)車(chē)體壁進(jìn)行脫鈣處理的工藝及脫鈣前后多棘海盤(pán)車(chē)體壁的變化情況。在對(duì)脫鈣工藝中的鹽酸濃度、脫鈣時(shí)間、料液比單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn),優(yōu)化結(jié)果表明:鹽酸濃度為1.0 mol/L,脫鈣時(shí)間為21 h,料液比為1∶10,體壁脫鈣率可達(dá)73.85%。多棘海盤(pán)車(chē)體壁在脫鈣處理后韌性增強(qiáng),內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得松散、粗糙。在脫鈣過(guò)程中,鹽酸逐漸滲透到體壁內(nèi)部,無(wú)機(jī)離子從內(nèi)部擴(kuò)散出來(lái)。

多棘海盤(pán)車(chē),脫鈣,體壁,鹽酸,內(nèi)部結(jié)構(gòu)

多棘海盤(pán)車(chē)(Asteriasamurensis),又名海星,屬棘皮動(dòng)物門(mén)(Echinodermata)海盤(pán)車(chē)綱(Asteroidea)鉗棘目(Forcipulate)海盤(pán)車(chē)科(Asteriidate)[1],是我國(guó)北方海域的主要品種[2]。多棘海盤(pán)車(chē)喜食貝類(lèi),是底棲生物群落的重要捕食者,大量聚集時(shí)會(huì)對(duì)扇貝、魁蚶、牡蠣、鮑魚(yú)等貝類(lèi)養(yǎng)殖和底播增殖造成嚴(yán)重危害[3-6]。

多棘海盤(pán)車(chē)的功效首載于《東北動(dòng)物藥》[6]。在沿海地區(qū),多棘海盤(pán)車(chē)黃[7](消化腺和生殖腺)常被作為食用點(diǎn)心或者藥物[8],科研人員也相繼從多棘海盤(pán)車(chē)黃內(nèi)分離獲得具有抗癌、抗菌、降血壓等多種生理和藥理活性[9]的皂甙、甾醇、多糖、生物堿類(lèi)等特殊化學(xué)物質(zhì)[10]。但是,目前對(duì)多棘海盤(pán)車(chē)的體壁利用研究較少。多棘海盤(pán)車(chē)體壁中的有機(jī)物主要為膠原蛋白,可提取膠原蛋白或明膠[6];無(wú)機(jī)物主要為羥基磷灰石(HAP)[Ca10(PO4)6(OH)2][11-12],由于羥基磷灰石特殊的排列方式,對(duì)提取膠原十分不利[13]。因此,在多棘海盤(pán)車(chē)的體壁利用之前,要除去其中的鈣,進(jìn)行脫鈣處理。多棘海盤(pán)車(chē)體壁成分與魚(yú)鱗相似,而目前對(duì)魚(yú)鱗脫鈣工藝研究較多[14-16],為多棘海盤(pán)車(chē)體壁脫鈣工藝的處理提供了借鑒。魚(yú)鱗脫鈣一般采用兩種方法——EDTA去鈣或者酸脫鈣[17],本文以多棘海盤(pán)車(chē)體壁為原料,采用鹽酸作為脫鈣液,研究脫鈣工藝的最佳條件及體壁在脫鈣前后的變化,旨在為多棘海盤(pán)車(chē)的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1. 1材料與儀器

多棘海盤(pán)車(chē)采自青島八大峽附近海域(2014年5月);鹽酸、乙二胺基四乙酸二鈉(EDTA)、鉻黑-T、乙二醇甲醚、三乙醇胺、氨水、氫氧化鈉、硫酸銅、氯化鈣、氯化銨、酒石酸鉀鈉均為分析純。

表2　多棘海盤(pán)車(chē)體壁的主要組成成分(干重,%)

FA1604N型電子分析天平上海精密儀器儀表有限公司;FMN10010-RO型純水機(jī)青島富勒姆科科技有限公司;A200型全自動(dòng)氨基酸分析儀德國(guó)安米諾西斯公司;S-3400N型掃描電子顯微鏡日本日立公司;IXRF systems能譜儀美國(guó)天美公司;JEE-420型真空噴鍍儀日本電子株式會(huì)社。

1. 2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1前處理樣品采集后,沖洗泥沙,用刀具將多棘海盤(pán)車(chē)沿腹面步帶溝剖開(kāi),分離生殖腺和體壁,洗凈體壁待用。

1.2.2理化成分的測(cè)定粗蛋白、粗脂肪、總糖、灰分和鈣分別參照GB 5009.5-2010凱氏定氮法、GB/T 5009.6-2003酸水解法、GB/T 9695.31-2008直接滴定法、GB 5009.4-2010食品中灰分測(cè)定法和GB 5009.92-2003食品中鈣測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。羥脯氨酸按照安米諾西斯氨基酸分析儀檢測(cè)方法進(jìn)行。

1.2.3脫鈣方法稱(chēng)取多棘海盤(pán)車(chē)體壁,先以0.1 mol/L的NaOH浸泡24 h,持續(xù)攪拌,去除附著在體壁上的色素及雜蛋白;用蒸餾水清洗至中性,隨即浸泡于一定濃度、一定體積的鹽酸溶液中,以脫除體壁中的鈣質(zhì)及其他無(wú)機(jī)成分。

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1酸濃度對(duì)脫鈣率的影響分別采取濃度為0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的鹽酸多棘海盤(pán)車(chē)與鹽酸的料液比1∶10,提取24 h,測(cè)定溶液中的鈣含量,計(jì)算脫鈣率。

1.2.4.2提取時(shí)間對(duì)脫鈣率的影響加入濃度為0.6 mol/L的鹽酸,多棘海盤(pán)車(chē)與鹽酸的料液比1∶10,改變反應(yīng)時(shí)間,使反應(yīng)時(shí)間分別為3、6、9、12、15、18、21、24 h,測(cè)定溶液中的鈣含量,計(jì)算脫鈣率。

1.2.4.3料液比對(duì)脫鈣率的影響多棘海盤(pán)車(chē)與鹽酸的料液比分別為1∶2.5、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,加入濃度為0.6 mol/L鹽酸,提取24 h,測(cè)定溶液中的鈣含量,計(jì)算脫鈣率。

1.2.5正交實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以酸濃度(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)3個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),因素水平見(jiàn)表1。

1.2.6鈣含量的測(cè)定[18]

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.2.6.1鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL的鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液,以蒸餾水補(bǔ)足至總體積20 mL,加入15 mL氨性溶液(pH10),3滴鉻黑-T指示劑,以EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,滴定終點(diǎn)溶液由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色,兩次取平均值。以EDTA滴定體積為橫坐標(biāo),鈣含量為縱坐標(biāo)作圖,得標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。

1.2.6.2浸酸溶液中鈣含量的測(cè)定取1 mL鹽酸脫鈣液,重復(fù)上述操作,記錄消耗EDTA體積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到脫鈣液中的鈣含量。由下式得到脫鈣率:

T=m×V/H×100

式中:T為脫鈣率(%);m為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的鈣含量(mg);V為鹽酸體積(mL);H為總鈣含量(mg)。

1.2.7體壁的固定方法及電鏡掃描樣品制備分別剪取未經(jīng)處理和處理后的多棘海盤(pán)車(chē)體壁,浸入8 ℃生理鹽水,之后在二甲胂酸鹽緩沖溶液(pH7.3)配制的3%的戊二醛溶液中浸泡2 h固定,固定后將標(biāo)本分兩次置入0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(pH7.4)中20 min,加入1%鋨酸在室溫下固定60 min,用50%、70%、90%、100%乙醇逐級(jí)脫水,浸透后以Spurr環(huán)氧樹(shù)脂包埋,聚合。樣品經(jīng)過(guò)固定干燥后,切開(kāi)橫斷面,斷面向上,用乳膠粘附在樣品樁上,放入JEE-4X真空噴鍍儀上,加導(dǎo)電層(Au),以觀測(cè)樣品斷面[19]。

1.2.8數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以O(shè)rigin8.0軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1多棘海盤(pán)車(chē)體壁基本理化成分

從表2可以看出,多棘海盤(pán)車(chē)體壁中的主要成分是蛋白和灰分,含有少量的脂肪和糖。對(duì)于陸生動(dòng)物而言,羥脯氨酸的常用換算系數(shù)為7.1;而水生動(dòng)物中一般采用11.1或14.1[20]。由羥脯氨酸含量按換算系數(shù)11.1,得膠原含量為20.79%,膠原約占蛋白總量的65.09%,體壁可用于提取明膠或膠原蛋白[6,14]。

多棘海盤(pán)車(chē)體壁灰分含量為60.39%,主要為羥基磷灰石,對(duì)提取膠原蛋白十分不利。本文較郝林華等[13]的測(cè)定結(jié)果(44.44%)和王長(zhǎng)云等[21]的測(cè)定結(jié)果(57.92%)偏高。可能是多棘海盤(pán)車(chē)采集地點(diǎn)、時(shí)間及檢測(cè)方法的差異導(dǎo)致了檢測(cè)結(jié)果的不同。多棘海盤(pán)車(chē)體壁灰分含量高于海水真鯛(Pagrosomusmajor)魚(yú)鱗[22](34.2%)和淡水鳙魚(yú)(Aristichthysnobilis)魚(yú)鱗[23](27.4%)。多棘海盤(pán)車(chē)體壁主要由膠原纖維形成的三維立體網(wǎng)構(gòu)成,孔洞由無(wú)機(jī)物填充[11],體壁韌性強(qiáng)、不易破碎,羥基磷灰石排列方式特殊。而魚(yú)鱗表面覆蓋一層以鈣為主的無(wú)機(jī)物,膠原纖維分布在無(wú)機(jī)層之下[23]。構(gòu)造的特殊性可能是多棘海盤(pán)車(chē)體壁灰分含量高的主要原因。

2.2多棘海盤(pán)車(chē)體壁的脫鈣工藝

2.2.1鹽酸濃度對(duì)脫鈣率的影響由圖1可得,當(dāng)鹽酸濃度在0.4～0.6 mol/L時(shí),隨著鹽酸濃度的提高,脫鈣率顯著提高,當(dāng)鹽酸濃度大于0.6 mol/L時(shí),鈣含量脫除的速度明顯變緩,且0.6 mol/L與0.8 mol/L的鹽酸脫鈣效果在第48 h時(shí)比較無(wú)顯著性差異。這與張豐香等[24]報(bào)道的利用鹽酸對(duì)魚(yú)鱗進(jìn)行脫鈣的結(jié)果類(lèi)似。

圖1　鹽酸濃度對(duì)脫鈣率的影響Fig.1　Effect of concentration on decalcification rate

2.2.2時(shí)間對(duì)脫鈣率的影響由圖2可知,脫鈣率在開(kāi)始的18 h隨酸處理時(shí)間的增長(zhǎng)出現(xiàn)迅速增加,在21 h時(shí)浸出液中鈣含量達(dá)到最大值,之后脫鈣率基本不隨時(shí)間增加而變化。段蕊等[25]的研究也表明,鈣離子的脫出并不是勻速的,在開(kāi)始的18 h非常快,在以后的18 h內(nèi),脫鈣的速度有所降低,21 h后脫鈣率的增加非常緩慢。

圖2　時(shí)間對(duì)脫鈣率的影響Fig.2　Effect of time on decalcification rate

2.2.3料液比對(duì)脫鈣率的影響從圖3中可以看出,隨著液料比的增加,脫鈣率呈波動(dòng)狀態(tài)。脫鈣率開(kāi)始呈增加趨勢(shì),在液料比為1∶10的時(shí)候達(dá)到最大值。當(dāng)液料比達(dá)到1∶15時(shí),效果最差,當(dāng)液料比>1∶15時(shí),脫鈣率反而隨著液料比的增加有增加的趨勢(shì)。

圖3　料液比對(duì)脫鈣率的影響Fig.3　Effect of solid-to-liquid on decalcification rate

2.2.4正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析見(jiàn)表3,方差分析見(jiàn)表4。

表3　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果L9(34)

表4　方差分析表

由表3及表4可知,影響脫鈣率的三個(gè)因素由大到小為:C>B>A,即料液比對(duì)脫鈣率的影響最大,其次是脫鈣時(shí)間和酸濃度,較優(yōu)水平組合是A3B2C2,料液比對(duì)脫鈣率的影響差異顯著(p<0.05)。

根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果,在乙酸濃度1.0 mol/L,脫鈣時(shí)間21 h,料液比1∶10的優(yōu)化條件下,重復(fù)5次實(shí)驗(yàn),測(cè)得其平均的鈣脫除率為73.85%。

2.3多棘海盤(pán)車(chē)體壁在脫鈣過(guò)程中的改變

2.3.1外觀形態(tài)變化圖4是未經(jīng)過(guò)脫鈣處理和經(jīng)過(guò)鹽酸脫鈣處理的體壁電鏡掃描照片。鹽酸處理前后,體壁縱切面的形態(tài)是有差別的。鹽酸處理前,體壁纖維板層緊密整齊,經(jīng)過(guò)切割后不松散;鹽酸處理后,體壁縱切面變得松散、粗糙,出現(xiàn)孔洞,說(shuō)明體壁在經(jīng)過(guò)鹽酸處理之后,形態(tài)從內(nèi)到外都發(fā)生了一定的改變。多棘海盤(pán)車(chē)體壁經(jīng)過(guò)鹽酸脫鈣處理后變得柔軟,韌性增強(qiáng),鹽酸逐漸向內(nèi)層滲透,浸潤(rùn)膠原纖維束,使鈣化層變薄,膠原纖維束之間變得疏松。而脫鈣后的魚(yú)鱗厚度減小,透明度增強(qiáng),韌性降低[12]。這體現(xiàn)了魚(yú)鱗與多棘海盤(pán)車(chē)壁內(nèi)部結(jié)構(gòu)的不一致。魚(yú)鱗是羥基磷灰石等鈣化層覆蓋在膠原纖維表面,而多棘海盤(pán)車(chē)體壁是羥基磷灰石填充膠原纖維形成的空洞。電鏡觀察脫鈣后的多棘海盤(pán)車(chē)體壁內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得松散、粗糙,并出現(xiàn)孔洞。

圖4　經(jīng)過(guò)不同處理的多棘海盤(pán)車(chē)體壁內(nèi)部結(jié)構(gòu)Fig.4　The internal structure of body wall after different treatment

圖5　經(jīng)過(guò)不同處理液處理多棘海盤(pán)車(chē)體壁內(nèi)部的能譜掃描Fig.5　The energy spectrum diagram of internal structure of body wall after different treatment

2.3.2能譜掃描變化圖5是鹽酸處理前后多棘海盤(pán)車(chē)體壁縱切面的能譜掃描圖譜。未經(jīng)過(guò)鹽酸處理,在體壁內(nèi)層都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)氯,但是鈣和磷的含量都較高。經(jīng)過(guò)鹽酸處理后,在體壁內(nèi)部纖維層的能譜掃描中出現(xiàn)氯,而鈣、磷等含量下降。說(shuō)明隨著鹽酸溶液逐漸向內(nèi)部擴(kuò)散,內(nèi)部結(jié)構(gòu)變疏松;而鈣、磷等溶解在酸液中,在濃度梯度的推動(dòng)下擴(kuò)散出來(lái)。能譜圖顯示脫鈣后,鹽酸溶液向多棘海盤(pán)車(chē)內(nèi)部滲透,金屬離子擴(kuò)散出來(lái),這點(diǎn)是與魚(yú)鱗一致的[12]。各種無(wú)機(jī)離子在擴(kuò)散過(guò)程中會(huì)滲入膠原層,因此脫鈣后的體壁在提取膠原蛋白前應(yīng)充分浸泡和清洗,防止灰分太多影響產(chǎn)品純度。

3　結(jié)論

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn),優(yōu)化鹽酸脫除多棘海盤(pán)車(chē)體壁中鈣工藝,結(jié)果表明:鹽酸濃度為1.0 mol/L,脫鈣時(shí)間為21 h,料液比為1∶10,體壁脫鈣率可達(dá)73.85%。多棘海盤(pán)車(chē)體壁在脫鈣處理后韌性增強(qiáng),內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得松散、粗糙。在脫鈣過(guò)程中,鹽酸逐漸滲透到體壁內(nèi)部,無(wú)機(jī)離子從內(nèi)部擴(kuò)散出來(lái)。

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Study on optimization and changes of bodywall ofAsteriasamurensisin the process of decalcification

LI Xiao1,WANG Ying1,*,LI Hong-yan1,WU Zhi-hong1,LIU Tian-hong1,SUN Yuan-qin1,LIU Wei2

(1.MarineBiology Institute of Shandong Provine,Qingdao 266100,China; 2.Institue of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071,China)

The collagen fibres of the bodywall fromAsteriasamurensisform a three-dimensional orthogonal web. Voids in the web contain ossicles and papulae. The inorganic substance is mainly calcium.In order to extract collagen fromA.amurensisbodywall,inorganic layer should be detached first. Optimization and changes of bodywall during the process of decalcification was studied. Changes under influential factors were described. These factors included concentration of hydrochloric acid,solid-to-liquid ratio,and decalcification time. On the basis of single factor experiment,the results by orthogonal experiment show that the optimal conditions were hydrochloric acid concentration 1.0 mol/L,solid-to-liquid ratio 1∶10,and decalcification time 21 h. After the decalcification,the de-calcification rate can reach to 73.85%. After the decalcification,the bodywall became thin and soft. The internal structure became loose and rough. As the decalcification went on,hydrochloric acid gradually penetrated into the internal structure,metal ions diffused from the inside.

Asteriasamurensis;decalcification;bodywall;hydrochloric acid;internal structure

2015-11-24

李曉(1985-),女,碩士,助理研究員,研究方向:水產(chǎn)品加工,E-mail:lixiaohappy9@163.com。

王穎(1971-),女,碩士,研究員,研究方向:水產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制,E-mail:food_rc@sina.com。

海洋公益性行業(yè)專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(201205027-3)。

TS254.1

A

1002-0306(2016)10-0307-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.054