聚乙烯吡咯烷酮/K2HPO4雙水相體系分配α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的研究

馮志彪,張　鶴,姜　彬,屈玉霄,李　璇,王　奎

(東北農業大學理學院應用化學系,黑龍江哈爾濱 150030)

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聚乙烯吡咯烷酮/K2HPO4雙水相體系分配α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的研究

馮志彪,張鶴,姜彬,屈玉霄,李璇,王奎

(東北農業大學理學院應用化學系,黑龍江哈爾濱 150030)

本文研究了聚乙烯吡咯烷酮PVP/K2HPO4雙水相技術分配α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的工藝,考察了PVP分子質量、PVP濃度、K2HPO4濃度、pH、溫度等不同因素對雙水相成相行為和蛋白質分配行為的影響。研究結果表明:分配α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的最佳工藝:30 ℃,分子量10000 u的PVP濃度為16%(w/w),K2HPO4濃度為14%(w/w),pH為7.5。在此條件下,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分別分配在雙水相中的上相和下相,其分配系數分別為7.32和0.38,回收率為88.29%和74.07%。

α-乳白蛋白,β-乳球蛋白,雙水相體系,分配

α-乳白蛋白(α-LA)是一種天然乳清蛋白,是必需氨基酸和支鏈氨基酸的極好來源,是乳清蛋白中唯一能結合鈣的乳清蛋白。在哺乳動物乳中α-LA是很小的球狀蛋白[1],是乳糖合成酶的一部分[2],促進了催乳激素的反應,增加了乳糖的產量,同時人類α-LA可以被轉化成一種誘導腫瘤細胞凋亡的蛋白質[3]。β-乳球蛋白(β-LG)具有很強的脂肪酸結合力,一般作為功能性配料使用。β-LG能夠與VA和VE結合,由于這些脂溶性維生素必須使用溶劑或載體才能添加到食品中,故β-LG可用于強化脫脂食品[4]。因此,α-LA和β-LG擁有高含量的優質蛋白,能為某些特定需要的人群提供所需優質蛋白,為市場注入了新的活力。

雙水相萃取技術設備簡單、在溫和條件下進行簡單操作就可獲得較高的收率和純度。戚琦[5]等人利用聚乙二醇800u-PVP雙水相體系通過熒光法測定阿司匹林腸溶片中水楊酸的含量,其水楊酸的萃取率可達95.0%,回收率為94.7%～95.0%。練萍[6-7]等人分別用PEG600-PVP-(NH4)2-H2O雙水相體系萃取Cu2+和PEG1500u-PVP組合表面活性劑-(NH4)2SO4-H2O雙水相體系萃取Eu3+進行研究,討論了以偶氮氯磷Ⅲ作萃取劑,在該萃取體系中Eu3+、Pb2+、Cu2+的萃取行為。在一定pH條件下實現了Eu3+-Pb2+、Eu3+-Cu2+的定量萃取分離與測定,初步探討了組合表面活性劑相的萃取機理。

雙水相技術可以應用于蛋白質的提取。Chen[8]等人利用PEG與檸檬酸鉀雙水相分離α-LA和β-LG,觀察到α-LA主要分布于聚合物相,β-LG主要分布于檸檬酸鉀相。Rodrigues[9]等人利用PEG與硫酸銨雙水相分離α-LA和β-LG,α-LA分布在PEG相,β-LG分布在硫酸銨相,但硫酸銨會使蛋白質在界面沉淀。Monteiro[10]等人利用濁點萃取技術分離α-LA和β-LG,α-LA優先進入聚合物相和β-LG進入磷酸鹽相。Federico Jara[11]等人,采用羥丙基甲基纖維素提取乳清分離蛋白濃縮物(WPC)中的α-LA和β-LG,結果表明,分子量低的蛋白質α-LA和β-LG均被保留在WPC相,分配比例高達90%,但兩種蛋白未能分開。Mokhtarani[12]等人通過正交實驗考察了PVP濃度、磷酸鹽濃度、pH等因素對α-LA和β-LG在雙水相中分配行為的影響,因實驗中固定了PVP的分子量為3500 u,使得PVP相中的α-LA分配率僅為45.13%。Kalaivani[13]等人利用PEG與檸檬酸鹽形成雙水相分離α-LA,α-LA在聚合物相萃取率為98%。但利用雙水相萃取技術來分離萃取α-LA和β-LG國內尚未見報道。

PVP是一種合成水溶性高分子化合物,具有優異的溶解性能及生理相容性。本文就雙水相體系對α-LA和β-LG的分配行為進行研究,選擇不同分子量的PVP/K2HPO4雙水相體系分配提取α-LA和β-LG,對影響α-LA和β-LG在雙水相中分配行為的因素進行考察,并對分配機理進行初步的探討。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

乳清分離蛋白(WPI)蛋白質含量88%±4.5%,上海諾申食品貿易有限公司;α-乳白蛋白標準品、β-乳球蛋白標準品純度≥90%,美國Sigma公司;聚乙烯吡咯烷酮(PVP)Aladdin-阿拉丁試劑(上海)有限公司;乙腈、三氟乙酸純度≥99.9%,美國Dikma公司;K2HPO4等其他試劑均為分析純。

FE201EL20實驗室pH計梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;A150011型渦流混勻器南京佳俊生物有限公司;AL-04電子分析天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2500紫外可見分光光度計日本島津株式會社;Angilent1100高效液相色譜美國Angilent公司。

1.2實驗方法

1.2.1相圖繪制采用濁點法[14],將不同分子量(8000、10000、24000、40000 u)的PVP和K2HPO4配制成40%(w/w)的原液,準確稱量10 g的PVP原液加入錐形瓶中,然后滴加K2HPO4原液,混勻,直至出現混濁為止,再加入適量蒸餾水,使體系變澄清,計算加入PVP和K2HPO4在系統中的質量百分濃度,并繼續加入K2HPO4原液,使系統再次變混濁后再加入適量蒸餾水,使體系變澄清。重復以上操作得到多個濁點繪制相圖。

1.2.2雙水相體系的制備分別稱取一定量的40%(w/w)PVP和K2HPO4儲備液,然后再加入1 mL的蛋白溶液,置于10 mL刻度試管中,用蒸餾水滴加至10 g。將配制好的雙水相體系,于漩渦混合器上振蕩2 min,在室溫下靜止或在恒溫水浴鍋中靜置12 h后,直至上下相完全分離。讀取上、下相體積。用1 mL注射器分別吸取一定量的上、下相,用于考馬斯亮藍法[5]分別測定雙水相上下相中α-LA和β-LG的濃度及考察α-LA和β-LG的分配情況。

1.2.3標準曲線的制作配制濃度為0～0.30 mg/mL牛血清白蛋白溶液,根據Bradford法測定蛋白質含量,并以牛血清白蛋白含量為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。其回歸方程為y=6.8086x+0.0102,R2=0.9991,線性良好,可以用于測定雙水相中蛋白質含量。

1.2.4蛋白質主要參數的計算方法配制雙水相體系10 g,分相后記錄上、下相體積(Vt,Vb),采用Bradford法測定上、下相蛋白濃度(Ct,Cb),用下述公式計算系統的相比R,分配系數K和回收率Y。

相比R=Vt/Vb

分配系數K=Ct/Cb

萃取率Y(%)=RK/(1+RK)

計算出雙水相上下相中α-LA和β-LG的分配系數和萃取率,來確定α-LA和β-LG在雙水相中的分配行為。

1.3單因素實驗設計

1.3.1PVP分子質量對雙水相分配α-LA和β-LG的影響按照1.2.2配制雙水相,在室溫,pH=7.0的條件下,考察了不同分子量PVP(8000、10000、24000、40000 u)16%(w/w)與14%(w/w)K2HPO4形成雙水相體系對α-LA和β-LG分配的影響。

1.3.2PVP濃度對雙水相分配α-LA和β-LG的影響在室溫,pH=7.0條件下,用不同濃度(12%、14%、16%、18%、20%)分子量10000 u的PVP組成PVP/K2HPO4(14%w/w)雙水相體系測定α-LA和β-LG在構造的雙水相體系中的分配系數、相比和蛋白質回收率。

1.3.3K2HPO4濃度對雙水相分配α-LA和β-LG的影響在室溫,pH=7.0條件下用16%(w/w)PVP(分子量10000 u)與不同濃度(10%、12%、14%、16%、18%)的K2HPO4組成雙水相體系測定α-LA和β-LG的分配系數、相比和蛋白質回收率。

1.3.4pH對雙水相分配α-LA和β-LG的影響在室溫條件下,給出了不同pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)對α-LA和β-LG在PVP(分子量10000 u)/K2HPO4(w/w,16%/14%),雙水相體系中的分配系數、相比和蛋白質回收率的影響。

1.3.5溫度對雙水相分配α-LA和β-LG的影響在pH為7.5的條件下,調節體系溫度(20、25、30、35、40 ℃)考察α-LA和β-LG在PVP10000u/K2HPO4(w/w,16%/14%)雙水相體系中的分配系數、相比和蛋白質回收率。

1.4數據處理

使用Excel和Origin軟件進行數據處理和分析,每組實驗均重復三次,實驗數據為平均值。

2　結果與分析

2.1繪制PVP/K2HPO4雙水相體系相圖

繪制不同分子量的PVP與K2HPO4形成的相圖,如圖1所示。

圖1　PVP/K2HPO4雙水相系統相圖Fig.1　Phase diagram in PVP/K2HPO4 ATPS

不同分子量的PVP和K2HPO4溶液構成的雙水相體系,其臨界分相濃度有很大差別。從圖1可以看出,PVP分子量越大,分相臨界點越小,成相物質濃度較少時即可分相。這主要是因為在PVP/鹽雙水相體系中,由于靜電斥力作用隨PVP分子量增大體系中水化離子與PVP分子之間的不相溶性增強。另一方面,PVP的疏水性也隨其分子量的增大而增強。在同一PVP濃度下,PVP分子量越大形成雙水相所需的K2HPO4的濃度越低。即如圖1所示,各PVP的成相能力為:PVP40000 u>PVP24000 u>PVP 10000 u>PVP8000 u。

2.2雙水相體系組成對α-LA和β-LG分配行為的影響

2.2.1PVP分子質量對雙水相分配α-LA和β-LG的影響PVP/K2HPO4雙水相體系,上相為PVP相,下相為K2HPO4相。根據表1得出,Kα均大于1,說明α-LA主要分布在上相中,且Kβ均小于1,說明β-LG主要分配到下相中。同時隨著PVP平均分子量的增大,雙水相上下相界面出現一層蛋白薄層,原因是PVP與K2HPO4的憎水性程度差距拉大,增加了相界面張力,臨界濃度降低。相界面張力增加不利于蛋白質分配到聚合物相。此外,相粘度越大,分子之間的運動越困難,成相物質分子的空間阻礙作用就會增加,不利于α-LA進入PVP相,卻有利于β-LG分配在鹽相中,所以Kα、Kβ逐漸降低,α-LA在上相中的回收率逐漸減小,β-LG在下相中的回收率卻逐漸增大,結合分配系數、回收率和操作工藝等考慮,確定PVP10000 u與K2HPO4組成的雙水相體系作為分配α-LA和β-LG的體系,進行下一組實驗。

2.2.2PVP濃度對雙水相分配α-LA和β-LG的影響從表2可知,當K2HPO4濃度為14%時,隨著PVP濃度增加,由于體積排阻效應,兩種蛋白的相比R都隨之增加,α-LA和β-LG的分配系數先增加后降低,α-LA的回收率先增加后降低,而β-LG的回收率呈現遞減的趨勢。改變成相物質在雙水相體系中的總濃度,實際上是改變了操作的加料點。從雙水相的相圖可知,體系中成相物質的總濃度增加時,體系將遠離臨界點,同時系線長度增加,兩相性質的差別(如疏水性等)增大。對一定分子量的PVP,濃度增加到18%,相比增加,α-LA分配系數和回收率增加。但PVP濃度太高為20%,一方面,成相物質用量增加,成本增加;另一方面,PVP濃度增加,β-LG的回收率減少。綜合實驗結果考慮,選擇PVP的濃度為16%(w/w)。

表1　PVP分子量對α-LA和β-LG分配行為的影響

注:α代表α-LA,β代表β-LG。

表2　不同PVP濃度對分配α-LA和β-LG的影響

2.2.3K2HPO4濃度對雙水相分配α-LA和β-LG的影響根據表3所示,α-LA趨于分布在上相中,隨著K2HPO4濃度的增加,Kα呈現先增加后下降的趨勢,但當K2HPO4濃度過高時,體系中鹽析作用增強,α-LA部分被析出。從相圖可知,當K2HPO4濃度增加,會吸收體系中的水使PVP相體積減少,從而相比降低,加上鹽析的作用,鹽濃度過高時蛋白的回收率也會降低。β-LG主要分布在下相,Kβ隨著鹽濃度的增加顯示出先降低再升高趨勢,而當K2HPO4濃度為14%時,下相中β-LG的分配系數最低,且蛋白質回收率最高,考慮到兩種蛋白的分配系數與回收率,同時大量的磷酸鹽不但達不到提純的目的,反而還會造成原料的浪費。所以在該實驗中選用14%(w/w)的K2HPO4濃度比較合適。

2.2.4pH對雙水相分配α-LA和β-LG的影響由于溶液的pH影響蛋白質在溶液中的解離度,引起蛋白質的荷電性改變。另一方面,體系pH的改變,也會引起成相組分分子和相界面的電性變化。這些變化會導致被萃取物質與成相物質分子間作用的變化,使分配系數發生變化。因此,在雙水相萃取過程中,往往可以調節pH來改善被分離蛋白質的分配系數,以提高分離效率。根據表4可知,隨著體系中pH的增加,α-LA和β-LG的分配系數都逐漸降低,與Mokhtarani[15]的結論相符,由于相比的變化不大,Yα的變化不大,只有pH為8.0時最低,而Yβ呈現遞增趨勢,綜合α-LA和β-LG在兩相中的分配系數和蛋白質的回收率等因素,確定最佳pH為7.5。

表3　不同濃度K2HPO4對雙水相體系分配α-LA和β-LG的影響

表4　pH對雙水相體分配α-LA和β-LG的影響

2.2.5溫度對雙水相分配α-LA和β-LG的影響考慮到溫度過高會引起蛋白質的變性等問題,所以選取溫度范圍為20～40 ℃進行實驗,根據表5可知,隨著溫度的升高,相比R變化不大,α-LA的分配系數和回收率先變大又減小,溶液溫度上升后,由于分子運動加強,削弱了靜電排斥作用的影響,導致蛋白的分配系數提高。溫度繼續升高PVP的粘性減小,促使α-LA轉移到下相,而溫度的改變對β-LG的分配系數和回收率影響很小。在溫度為30 ℃時,α-LA的分配系數和回收率最大,β-LG的回收率也較大,所以確定最佳萃取溫度為30 ℃,與Sadeghi[16]探究關于PVP和不同鹽形成溶液平衡使用溫度一致。

表5　不同溫度對雙水相體系分離α-LA和β-LG的影響

3　結論

采用PVP/K2HPO4雙水相萃取技術分配α-LA和β-LG,分析了pH等5個因素對雙水相成相行為和蛋白質的分配行為的影響。綜合考慮α-LA和β-LG的分配效果,確立了該雙水相體系分配α-LA和β-LG的最佳工藝條件為在溫度30 ℃,PVP10000濃度16%(w/w),K2HPO4濃度14%(w/w),pH7.5。在此條件下,α-LA和β-LG分別分配在雙水相中的上相和下相,分配系數分別為7.32和0.38,回收率為88.29%和74.07%。雖然α-LA和β-LG的萃取率在PEG/鹽雙水相中比PVP/K2HPO4雙水相高一些,但是PVP常溫常壓下穩定,毒性低,價格相對PEG更經濟,更有利于實現工業化。PVP具有優良的生理惰性,不參與人體新陳代謝,又具有優良的生物相容性,對皮膚、粘膜、眼等不形成任何刺激,特別是在醫藥、食品、化妝品這些與人們健康密切相關的領域中,PVP/鹽雙水相必將展示其發展的良好前景。

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Study on partition ofα-lactalbumin andβ-lactoglobulin with PVP/K2HPO4aqueous two-phase systems

FENG Zhi-biao,ZHANG He,JIANG Bin,QU Yu-xiao,LI Xuan,WANG Kui

(Department of Applied Chemistry,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In the present study,the partitioning ofα-LA andβ-LG in aqueous two-phase system of polyvinylpyrrolidone-potassium phosphate was investigated. The partitioning of proteins in this system depends on PVP molecular weight,the polymer,salt weight percents,pH and temperature was used to study the effects of different parameters on partitioning ofα-LA andβ-LG. The optimum conditions of distribution ofα-LA andβ-LG were 16%(w/w)and 14%(w/w)of the amount of PVP weight percent 10000 u and K2HPO4separately,temperature for 30 ℃,and pH7.5.Results indicated thatα-LA andβ-LG were assigned in the phase of the upper and the bottom of the aqueous two-phase system respectively.The corresponding partition coefficients were 7.32 and 0.38,and the rate of partition were 88.29% and 74.07% according to the partition ofα-LA andβ-LG.

α-lactalbumin;β-lactoglobulin;aqueous two-phase system;partition

2015-10-26

馮志彪(1967-)，男，博士，教授，研究方向：應用化學，E-mail：fengzhibiao@neau.edu.cn。

黑龍江省教育廳面上項目(12531007)。

TS252.9

A

1002-0306(2016)10-0316-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.056