真空包裝牛肉冷藏過程理化和微生物變化

李　娟,盧士玲,王慶玲,*,孫丹丹,侯扶琴

(1.新疆石河子大學食品學院,新疆石河子 832000; 2.新疆喀爾萬食品科技有限公司,新疆石河子 832000)

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真空包裝牛肉冷藏過程理化和微生物變化

李娟1,盧士玲1,王慶玲1,*,孫丹丹1,侯扶琴2

(1.新疆石河子大學食品學院,新疆石河子 832000; 2.新疆喀爾萬食品科技有限公司,新疆石河子 832000)

將牛肉真空包裝貯藏在4 ℃條件下,每3 d測定其pH、揮發性鹽基氮(TVB-N)、菌落總數,并利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電脈(PCR-DGGE)技術來研究其貯藏過程的菌相變化。結果表明:4 ℃條件下,真空包裝冷卻牛肉菌落總數在12 d超過6.0 lg cfu/g,pH在貯藏21 d時超過6.0,TVB-N在貯藏18 d時超過25 mg/100 g,根據理化指標結果顯示可知真空包裝冷卻牛肉貯藏期為12 d;貯藏初期主要存在蒼白桿菌、巨球菌、Boseavestrisii;貯藏末期主要含有成團泛菌、乳酸桿菌、熱死環絲菌、慢生根瘤菌屬、廣布肉桿菌、美洲愛文氏菌、拉恩氏菌、腸桿菌。

PCR-DGGE,菌相,理化指標,真空包裝,冷卻牛肉,貯藏時間

牛肉含有優質蛋白質、維生素B和礦物質如鋅,硒,磷和鐵,能提高機體抗病能力。縱觀各類食用肉中消費量中,牛肉消費量排名第三僅次于豬肉和家禽肉,且中國為牛肉消費大國,據統計新疆2003年牛肉產量為37.8萬噸同比增長4.4%[1-3]。

研究表明,牛肉在貯藏過程中其質量、安全、營養狀況在很大程度上受到內因以及外因的制約,內因如牛肉中存在的酶、牛肉的纖維結構,外因如前處理、包裝方式、貯藏溫度等。牛肉在貯藏過程中理化性質以及微生物菌群在不同時期會發生不同變化,而這些變化也暗示著肉的品質變化,預示著牛肉食用的安全期,因此,研究牛肉在貯藏過程中的理化指標與微生物指標非常重要[4-5]。

本實驗將利用 pH、TVB-N來評價牛肉貯藏過程中理化指標變化,細菌總數、微生物種類來研究貯藏過程的微生物變化。

然而,自然界只有1%左右的細菌能夠用傳統的培養的方法鑒別,具有費時、費力等局限性;16S rDNA和變性梯度凝膠電泳是一種基于DNA的指紋圖譜技術,該技術理論上,在合適的溫度與梯度條件下能夠將具有一個堿基差異的DNA在聚丙烯酰胺膠上分開,簡化了細菌的鑒定,為研究貯藏過程中的菌相變化提供了便捷方法[6-7]。目前將DGGE技術應用于研究鮮肉牛變質過程菌相變化已有研究[8]。

因此,本實驗主要目的是利用理化指標結合PCR-DGGE技術分析4 ℃下真空包裝牛肉的貯藏期及貯藏期內的菌相變化,為客觀評價喀爾萬公司出廠牛肉的貯藏期以及哪些微生物導致牛肉品質變化提供理論基礎,也為進一步研究保鮮劑的選擇及使用提供一定科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

牛肉喀爾萬食品科技有限公司;PCA培養基;瓊脂糖Biowest;細菌基因組DNA提取試劑盒TIANGEN;聚丙烯酰胺回收試劑盒康為世紀生物科技有限公司;溶菌酶、尿素、過硫酸胺Solarbio;PCR相關試劑、DGGE相關試劑均為分析純;所用引物均由上海生工合成。

D-37520高速冷凍離心機德國LED熱電子公司;PCR儀美國Barloworld Scientific有限公司;Bio-RadDcode apparatus DGGE電泳儀、GelDoc 2000system凝膠成像儀美國Bio-Rad公司;DYY-8C水平電泳儀北京市六一儀器廠;SW-CF-1F超凈工作臺、海爾控溫冰箱、ZXRD-7-80搖床上海智誠有限公司;DNP-9272電熱恒溫培養箱、LDZX-40Ⅱ壓力滅菌鍋上海申安醫療器械廠;DZ-400/2C真空包裝機上海青浦食品包裝機械廠;HI8424NEW pH計上海加惠儀器儀表有限公司；半微量凱氏定氮儀北京市通潤源機電技術有限責任公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品處理牛肉后腿肉為當日清晨屠宰2 h內的肉,無菌操作條件下剔除多余脂肪,分成100 g左右的肉塊,真空包裝后貯藏于4 ℃備用。

1.2.2pH測定分別于0、3、6、9、12、15、18、21和24 d取肉樣10 g無菌剪刀剪碎,放入裝有90 mL蒸餾水的錐形瓶中,混勻振蕩30 min,過濾后測其pH。重復三次,取平均值[9]。參考標準:一級鮮度pH5.4～5.6;二級鮮度 pH5.7～5.9;變質肉pH≥6.0[4]。

1.2.3揮發性鹽基氮(TVB-N)測定采用GB/T 5009.44-2003《肉與肉制品衛生標準的分析方法》中的半微量凱氏定氮法,分別于0、3、6、9、12、15、18、21和24 d測定牛肉中的總揮發性鹽基氮。參考標準:一級鮮肉≤15 mg/100 g,二級鮮肉≤20 mg/100 g,變質肉≥20 mg/100 g。

1.2.4細菌總數的測定分別于0、3、6、9、12、15、18、21和24 d無菌條件下取25 g肉樣(兩個平行),無菌剪刀剪碎,加入225 mL滅菌生理鹽水112 r/min搖床振搖30 min。取1 mL上清液進行10倍梯度稀釋,選擇合適的稀釋梯度,每個稀釋度2個重復,采用PCA培養基于37 ℃培養48 h[10]。培養結束后計數,結果以lg cfu/g表示。指標的評價標準為:參考標準為:一級鮮度<4.0 lg cfu/g,二級鮮度 4.0～6.0 lg cfu/g,變質肉>6.0 lg cfu/g。

1.2.5細菌總DNA提取根據Vitor[11]等方法略有修改。肉樣(無菌操作取10 g樣品,無菌剪刀剪碎,放入90 mL滅菌生理鹽水中)112 r/min搖床振搖30 min,靜置5 min,取上清液4 ℃,2000×g離心5 min,取上清液于4 ℃,10000×g離心15 min,取沉淀于1.5 mL離心管中參照DNA提取試劑盒說明提取細菌總DNA。所提取的DNA溶于TE緩沖液中,于-20 ℃貯藏備用。

1.2.6PCR擴增上游引物為帶GC夾子的U968,下游引物為L1401。對細菌的16S rRNA的V6～V8區段進行PCR擴增,條帶片段約為450 bp。

上游引物GC(U968為5′-CGC CCG GGG CGC GCCCCG GGC GGG GCGGGG GCA CGG GGG GAA CGCGAA GAA CCTTAC-3′;下游引物L1401為5′-CGG TGT GTACAA GACCC-3′。

PCR反應體系為25 μL:DNA模板1 μL,GC-U968和L1401各1 μL,PCR Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 mL。

PCR反應程序:94 ℃預變性2 min,35個循環(94 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、30 min),最終72 ℃延伸5 min。

PCR產物經1.0%瓊脂糖電泳檢測后于-20 ℃貯藏備用。

1.2.7變性梯度凝膠電泳(DGGE)參照Wang[12]等方法稍作改動,對細菌16S rRNA基因V6～V8的擴增產物分別進行DGGE分析。采用Biorad Dcode apparatus電泳儀,聚丙烯酰胺膠濃度為8%(丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺37.5∶1),變性梯度為38%～58%(100%變性劑含有7 mol/L尿素和40%甲酰胺),在0.5×TAE緩沖液中,60 ℃恒溫條件下,200 V電壓下電泳10 min,85 V電壓下電泳16 h。

電泳結束后,將DGGE膠片用含0.5 mg/L溴化乙啶(Ethidium bromide,EB)染色20 min。回收染液,之后將DGGE膠片用ddH2O漂洗三次,每次5 min。

1.2.8DNA回收與純化將EB染色的DGGE膠片放置于紫外燈下用無菌手術刀切下不同位置的條帶,分別放入1.5 mL的滅菌離心管中,用聚丙烯酰胺回收試劑盒回收膠條,備用。

取3 μL回收的DNA為模板進行16S rRNAV6-V8區域擴增,引物為U968(5′-AAC GCG AAG AAC CTTAC-3′),L1401(5′-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3′),PCR擴增程序同1.2.6。產物經1.0%瓊脂糖檢驗后送往北京華大基因測序部測序。登錄NCBI,將所得序列與數據庫中的已知序列進行相似性比對。

1.3數據處理

實驗數據采用BioEdit、Quantity one 4.6.2、Origin 8.6進行處理。

2　結果與分析

2.1pH

由圖1可知,貯藏0 d的牛肉pH為5.98,隨著貯藏時間的延長pH先下降后上升。pH先下降是因為糖原酵解產生乳酸,三磷酸腺苷分解產生磷酸,乳酸和磷酸逐漸積累,從而使肉的pH下降。隨著牛肉成熟期的延長,肉中的蛋白質在細菌、酶作用下被分解為氨和胺類化合物等堿性物質而使pH升高,從圖1中也可知,從第15 d牛肉的pH迅速升高。

圖1　真空包裝冷卻牛肉貯藏過程中pH變化Fig.1　Change of pH value in vacuum-packaged chilled beef during storage

2.2揮發性鹽基氮

從圖2可見,冷卻牛肉中揮發性鹽基氮含量隨貯藏時間的增加而增加,這是由于氨及胺類物質的產生。TVB-N在第12 d時迅速升高,在15 d時達到23.46 mg/100 g。結合圖1、圖2可以看出,在貯藏15 d內pH隨著TVB-N含量的增加而降低,15 d后pH逐漸增加。以pH為評判標準的真空包裝冷卻牛肉在21 d才超出6.0,但以TVB-N為評判標準的真空包裝冷卻牛肉卻在15 d時已經超過25 mg/100 g。

圖2　真空包裝冷卻牛肉貯藏過程中揮發性鹽基氮變化Fig.2　The change of TVB-N in vacuum-packaged chilled beef during storage

2.3菌落總數

從圖3可以看出,隨著貯藏時間的延長,菌落總數呈不斷增長的趨勢。由于環境的改變,微生物需要適應新的環境即遲滯期,而使得前6 d微生物數量變化不大,從第9 d開始進入對數期,第12 d時有明顯的增長。在12 d菌落數已經超過6.0 lg cfu/g。從pH、TVB-N、菌落總數結果可以看出,以不同指標來衡量真空包裝冷卻牛肉的貯藏期存在顯著差異,因此需結合pH、TVB-N值及菌落總數來綜合判斷肉的新鮮度。

圖3　真空包裝冷卻牛肉貯藏過程中菌落計數Fig.3　Counts of total colonies in vacuum-packaged chilled beef during storage

2.4PCR-DGGE圖譜分析

由圖4可知,貯藏初期條帶也相對較多,表明牛肉樣品中初始微生物種類相對較多,隨著貯藏時間的延長,一部分條帶變弱或消失,一部分條帶由弱變強,還出現了一些新條帶,表明在貯藏過程菌相組成發生了變化。對圖4中標記的條帶1～18割膠、擴增、測序并在NCBI基因庫中進行相似性比較,結果如表1所示。由表1可知未知序列與已知序列相似性較高。

圖4　真空包裝冷卻牛肉16S rRNA基因V6～V8區DGGE圖譜Fig.4　DGGE profile of PCR products for the V6～V8 region of 16S rRNA gene extractedfrom vacuum-packaged chilled beef

結合表1可知貯藏初期真空包裝冷卻牛肉中主要存在蒼白桿菌(條帶5)、巨球菌(條帶10)、Boseavestrisii(條帶14),還有一些測序失敗條帶,圖中未標注,表明貯藏初期牛肉中的細菌種類相對較多。

隨著貯藏時間的推移,哈夫尼(條帶1)、檸檬酸桿菌(條帶3)、蒼白桿菌(條帶5)、顆粒鏈桿菌(條帶8)、胖桿菌(條帶7)、拉恩氏菌(條帶16)、不動桿菌(條帶18)在貯藏過程中間歇性出現或消失。

表1　DGGE條帶分離的主要細菌16S rRNA基因序列相似性比較

至貯藏后期主要優勢菌為成團泛菌(條帶2)、克雷伯氏菌(條帶4)、乳酸桿菌(條帶6)、熱死環絲菌(條帶9)、慢生根瘤菌屬(條帶12)、廣布肉桿菌(條帶13)、美洲愛文氏菌(條帶15)、腸桿菌(條帶17)。說明在貯藏過程中微生物的種類發生了變化,而這些變化可能與貯藏過程肉的酸堿度變化、肉本身所含有的營養物質(如蛋白質、維生素等)、肉的水分活度、真空包裝內的氣體成分變化、肉中的酶有關。

3　討論

本研究利用理化指標及菌落總數結合PCR-DGGE技術來探討真空包裝冷卻牛肉的貯藏期以及在貯藏期內的微生物變化。結果表明,真空包裝冷卻牛肉的貯藏期為12 d左右,貯藏末期主要有成團泛菌、拉恩氏菌、乳酸桿菌、熱死環絲菌、Bradyrhizobiaceae、廣布肉桿菌、美洲愛文氏菌、腸桿菌。根據Barakat[13]等研究發現真空包裝的畜禽肉在貯藏末期主要存在廣布肉桿菌、居魚肉桿菌、格氏乳球菌、乳酸乳球菌、糞腸球菌。Yuemei[5]等研究發現真空包裝鯉魚貯藏末期主要存在肉桿菌、氣單胞、愛文氏菌、乳酸菌、假單胞且貯藏期為12 d。Vasileios[14]表明包裝冷卻食品22 ℃條件下貯藏期為5 d且貯藏末期主要存在Leuconostocgasicomitatum、Leuconostocgelidum、Lactococcuspiscium。Fan Zhao[15]研究表明真空包裝冷卻豬肉貯藏期為21 d,貯藏第7 d為微生物多樣性的關鍵時間點,主要有微球菌、黃桿菌、腸桿菌、乳酸菌、肉桿菌。貯藏中細菌種類不同這可能是由于取樣的環境、初始微生物種類以及樣品不同等引起的菌相不完全相同。

Gill[16]研究表明真空包裝的條件下為乳酸菌、腸桿菌、腐敗希瓦氏菌、熱死環絲菌的生長提供了有利條件。真空包裝冷卻牛肉貯藏過程中,菌落總數不斷增加根據評判標準在貯藏12 d已經超過6 lg cfu/g。pH在5.4～5.7的牛肉能夠保持良好的冷卻肉品質,雖然高pH更適合于加工,但好品質的牛肉比生產價值更重要。本實驗中pH在貯藏初期處較高后下降再上升,這是由于貯藏過程糖酵解產生酸,酸濃度與pH成正比與肉品質成反比[17]。大多數腐敗衛生物的最低生長pH為5.5,有的也能在pH<5的條件下生長,如Clostridiumfrigidicarnis[18]。揮發性鹽基氮在貯藏過程不斷上升,這是因為蛋白質在微生物的作用下產生氨及胺類物質。當糖原酵解、三磷酸腺苷分解產生乳酸、磷酸,酸性環境為乳酸菌的生長提供了有利條件,乳酸菌利用肉中的營養物質產生代謝產物乳酸使肉中的pH進一步下降,但真空包裝肉中的糖原及三磷酸腺苷是有限的,隨著蛋白質的降解產生堿性物質,堿與酸發生酸堿結合從而使pH上升,這也為一些腐敗微菌的生長提供了條件[19]。熱死環絲菌是一種兼性厭氧菌能夠在高鹽(10%)、低pH(5.5～6.5)、4 ℃低溫條件下生長,在真空包裝下也能利用有限氧氣代謝,產生不良氣味[16]。因此,熱死環絲菌也是肉類腐敗的一個指標[20]。Jones等[21]發現清酒乳桿菌存在于貯藏12周的真空包裝牛肉中,因此乳桿菌也是肉類腐敗的指標。

4　結論

菌落總數在第12 d達到6.4 lg cfu/g,第21 d的pH為6.18,TVB-N值在15 d已經超過了20 mg/100 g,因此,中和微生物指標與理化指標可知真空包裝冷卻牛肉貯藏期為12 d左右;真空包裝牛肉貯藏初期微生物種類較少,有蒼白桿菌、Boseavestrisii、巨球菌;隨著貯藏時間延長肉的理化指標降低在貯藏末期主要含有成團泛菌、乳酸桿菌、熱死環絲菌、Bradyrhizobiaceae、廣布肉桿菌、美洲愛文氏菌、拉恩氏菌、腸桿菌;真空包裝冷卻牛肉貯藏過程中,肉中酸堿度變化為某些細菌的生提供了有利條件,如熱死環絲菌、乳酸菌。

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Physicochemical and microflora change of vacuum-packaged beef during chilled storage

LI Juan1,LU Shi-ling1,WANG Qing-ling1,*,SUN Dan-dan1,HOU Fu-qin2

(1.Food College of Shihezi Uninersity,Shihezi 832000,China; 2.Xinjiang Calvin Wan Food Science and Technology Co.,Ltd.,Shihezi 832000,China)

The microfloral change was explored by PCR-denaturing gradient gel eletrophoresis(PCR-DGGE)and pH,TVB-N,the total number of colonies were measured every three days in vacuum-packaged beef at 4 ℃. Results showed that,vacuum-packaged beef storaged at 4 ℃,the total number of colonies during the twelfth days of storage had more than 6.0 lg cfu/g,pH during the twenty-first days of storage more than 6.0,TVB-N during the eighteenth days of storage more than 25 mg/100 g,according to physical and chemical indicators showed that vacuum packaged chilled beef storage period for 12 days.Ochrobactrumsp.,Boseavestrisii,Macrococcuscaseolyticuspredominated in early stage during chilled storage,whereas in the end of storage periodPantoeaagglomerans,Brochothrixthermosphacta,Carnobacteriumdivergens,Bradyrhizobiaceae,Lactobacillussp.,EwingellaAmericana,Rahnellaaquatilis,Enterobacteriaceaepredominated.

PCR-DGGE;microfloral;physical and chemical indexes;vacuum package;chilled beef;storage time

2015-11-09

李娟(1989-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：畜產品加工與質量安全，E-mail:948733770@qq.com。

王慶玲(1981- )，女, 博士, 副教授，研究方向：食品安全與檢測，E-mail:Qingling1100@163.com。

宰后牛肉品質控制技術及應用研究(2014GY04)。

TS205.7

A

1002-0306(2016)10-0324-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.058