蕎麥對高脂膳食大鼠肝臟中脂代謝相關酶及血清中蛋白的影響

王　丹,張　嵐,馮小雨,張洋婷,宋春梅,*

(1.吉林醫藥學院公共衛生學院,吉林吉林 132013; 2.吉林省中醫藥管理局二級實驗室,吉林吉林 132013)

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蕎麥對高脂膳食大鼠肝臟中脂代謝相關酶及血清中蛋白的影響

王丹1,2,張嵐1,2,馮小雨1,2,張洋婷1,2,宋春梅1,2,*

(1.吉林醫藥學院公共衛生學院,吉林吉林 132013; 2.吉林省中醫藥管理局二級實驗室,吉林吉林 132013)

本文研究蕎麥(buckwheat,BW)對高脂膳食大鼠肝臟脂代謝相關酶及血清蛋白含量影響。將50只成年Wistar雄性大鼠隨機分為基礎對照組,高脂模型組,蕎麥低、中、高劑量組,30 d后取血及肝臟,測定相關指標。結果表明,與基礎對照組相比,高脂膳食大鼠體重增加,肝臟肝脂酶(HL)、脂肪酶(LPS)、脂蛋白脂肪酶(LPL)活性顯著降低(p<0.05)。與高脂模型組相比,蕎麥高劑量組大鼠體重增加量顯著降低(p<0.05);蕎麥中、高劑量組LPS、LPL活性顯著增高(p<0.05),HL活性降低。各組大鼠血清總蛋白(TP)及白蛋白(ALB)變化差異不顯著。相關性分析,蕎麥粉劑量與HL、LPS、LPL活性呈現正相關關系,LPL與HL活性呈極顯著正相關(p<0.01),LPS與LPL、HL活性呈顯著正相關(p<0.05)。綜上,蕎麥干預高脂膳食可調節機體脂代謝相關酶活性。

蕎麥粉,高脂膳食,肝臟肝脂酶,脂肪酶,脂蛋白脂肪酶

隨著人們生活水平提高,大多居民飲食結構趨向于高脂膳食,而高脂膳食可誘導機體出現血脂異常、胰島素抵抗、非酒精性脂肪肝等代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)[1],MS在發生、發展過程中,機體各種代謝及調節均發生著變化,可見高脂膳食對機體具有很大負面作用,因此調整人們的飲食結構尤為重要。

蕎麥是一種糧藥兼備的糧食作物,目前世界上有多個國家研究都發現蕎麥中的活性成分,比如蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素、微量元素等,具有較好的保健作用。Merendino N認為苦蕎麥芽菜由于含有較高含量有益成分,如蘆丁和槲皮素,可作為開發功能性食品的原材料,而且經過實驗證明,蕎麥芽可以降低血壓以及機體的氧化應激,對于治療慢性疾病具有較好的功效[2]。其中槲皮素成分可改善腦部氧化還原狀態,增加海馬腦源性神經生長因子的表達,從而改善小鼠的學習和記憶能力[3]。以上可以初步說明蕎麥對緩解疾病具有很好的作用。前期研究證明蕎麥可作為抗氧化因子,對高脂膳食引起的機體抗氧化活性受損及脂代謝紊亂具有很好的調節作用,因為長期高脂膳食會產生過量的活性氧自由基(ROS),ROS可能會激活一些信號通路導致機體出現嚴重氧化應激,脂質過氧化程度加重,抗氧化系統調節能力下降,導致血脂顯著升高[4]。而蕎麥可以通過調節氧化系統進而調節脂代謝紊亂。而脂代謝紊亂主要表現在甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)水平升高,高密度脂蛋白(HDL)水平降低,可能與脂代謝相關酶及其相關基因表達有直接關系。因此,本文將從脂代謝相關酶角度進一步研究蕎麥對脂代謝影響機制,通過構建高脂膳食大鼠模型,研究蕎麥粉對大鼠肝臟脂代謝相關酶肝臟肝脂酶(HL)、脂肪酶(LPS)、脂蛋白脂肪酶(LPL)及血清總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)含量的影響。為從分子細胞學角度進一步研究蕎麥降血脂機制奠定基礎,同時為預防和治療高脂膳食所導致的腦及心血管相關疾病并開發蕎麥降血脂產品提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蕎麥(F.esculentumMoench)吉林市市售,粗蛋白含量為9.20%±0.60%,脂肪含量為2.01%±0.30%,水分含量為10.16%±1.03%;膽固醇北京鼎國生物技術有限公司;雞蛋黃粉吉林金翼蛋品有限公司;豬油吉林市大商超市;LPS、HL、LPL活性測定試劑盒南京建成生物工程研究所;健康成年Wistar雄性大鼠50只,體重(200±20) g,由吉林大學動物實驗中心提供,許可證號碼為SCXK(吉)-2011-0004。

TD-5A離心機湖南凱達科學儀器有限公司;202-1AB電熱恒溫干燥箱天津市泰斯特儀器有限公司;FA1104N電子天平上海精密科學儀器有限公司;722可見分光光度計上海欣茂儀器有限公司;Selectra XL全自動血生化分析儀荷蘭威圖;電動玻璃勻漿機天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1高脂模型實驗動物分組及給藥方式將50只大鼠,隨機分為5組,每組10只,分別為基礎對照組、高脂模型組、蕎麥低、中、高劑量組,每天定時喂食(每200 g體重對應25 g飼料),飲水自由。基礎對照組喂食基礎飼料,高脂模型組喂食高脂飼料,蕎麥劑量組按照1、5、10 g/(kg·d)的低、中、高劑量喂食相應的蕎麥,連續飼喂30 d[5]。記錄大鼠初始體重和終體重,并記錄體重增加量。

各模型組飼料配方如下:

基礎對照組飼料配方:玉米粉17.5 kg、大豆粉15.0 kg、面粉12.5 kg、麩皮5.0 kg、葵花子油1.0 kg,另外加多種維生素和無機鹽。

高脂飼料配方:基礎飼料79%、蛋黃粉10%、豬油10%、膽固醇1%。

蕎麥低劑量組:蕎麥粉0.8%、基礎飼料78.2%、蛋黃粉10%、豬油10%、膽固醇1%。

蕎麥中劑量組:蕎麥粉4%、基礎飼料75%、蛋黃粉10%、豬油10%、膽固醇1%。

蕎麥高劑量組:蕎麥粉8%、基礎飼料71%、蛋黃粉10%、豬油10%、膽固醇1%。

為防止油脂被空氣氧化,每周做一次飼料。

1.2.2大鼠中血清及肝組織勻漿液的制備及相關指標的測定血清制備:實驗30 d,末次喂養后禁食12 h,不禁水,以10%烏拉坦7 mL/kg腹腔注射對大鼠進行麻醉,稱重,腹腔動脈取血,使用離心機3000 r/min,離心15 min,分離血清,分別測定TP和ALB的含量。

10%組織勻漿液制備:稱取肝組織塊1 g,放到冰冷生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙吸干稱重。加入冷生理鹽水9 mL,眼科小剪剪碎,電動玻璃勻漿機勻漿10 min,使用離心機3000 r/min離心10 min。取上清液,分裝于EP管中,分別測定肝臟LPS、HL、LPL的活性。測定方法嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2　結果與討論

2.1蕎麥對高脂膳食大鼠體重的影響

由圖1可以看出各組大鼠初始體重無顯著差異,在喂養期間,無死亡現象。

圖1　蕎麥粉對高脂膳食大鼠體重的影響(n=10)Fig.1　Effects of buckwheat on body weight in HFD rats(n=10)注:*表示與基礎對照組比較差異顯著(p<0.05);#表示與高脂模型組比較差異顯著(p<0.05);圖2～圖6同。

飼喂30 d后,稱量各組大鼠終體重發現,與基礎對照組相比,高脂模型組大鼠終體重顯著增加(p<0.05);與高脂模型組相比,蕎麥劑量組大鼠終體重差異不顯著(p>0.05)。與基礎對照組相比,高脂模型組體重增加量顯著增加(p<0.05);與高脂模型組相比,蕎麥高劑量組大鼠體重增加量顯著降低(p<0.05),蕎麥中劑量組大鼠體重增加量降低,但是差異不顯著(p>0.05),蕎麥低劑量組大鼠體重增加量略有增高,可能是因為蕎麥低劑量對大鼠體重減少作用較小,而且大鼠之間存在個體差異。蕎麥殼中含有膳食纖維成分,而且膳食纖維是食品營養中的第七大營養元素,對人體健康至關重要。膳食纖維主要是能夠促進過飽和狀態,抑制食欲[6],另外,膳食纖維能夠影響脂肪氧化和脂肪儲存[7],從而減少食物攝入來降低體重和體脂。從某種程度上說明了一定劑量蕎麥粉能減少機體脂肪的積累,可能具有減緩高脂膳食所引起的體重增加現象。

2.2蕎麥對高脂膳食大鼠肝臟中LPS活性的影響

LPS也稱三酰基甘油酰基水解酶,它通過作用位點將外源性甘油三酯分解為脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯,其活性強度與冠心病相關[8]。如圖2,與基礎對照組相比,高脂模型組大鼠肝臟LPS活性下降,而且具有顯著性差異(p<0.05),這可能是由于體內攝入脂類物質增多的緣故,對肝臟中LPS活性有一定影響。而LPS活性降低,會導致甘油三酯代謝紊亂。與高脂模型組相比,蕎麥組能夠增加大鼠肝臟中LPS活性。隨著蕎麥粉劑量的增加,LPS活性逐漸增高。其中,中、高劑量組效果呈現顯著性(p<0.05)。同時也說明蕎麥粉能夠通過提高LPS活性,促進體內脂肪分解,對防止脂類物質積累有重要意義。

圖2　蕎麥粉對高脂膳食大鼠肝臟LPS的影響(n=10)Fig.2　Effects of buckwheat on LPS activity of liver in HFD rats(n=10)

2.3蕎麥對高脂膳食大鼠肝臟中HL活性的影響

HL存在肝內皮細胞表面,是參與脂蛋白代謝的酶,一方面HL可以協助完成高密度脂蛋白膽固醇(HDL-Ch)的逆向轉運,另一方面HL參與LDL的清除,與動脈粥樣硬化發生發展有著很大的關系[9]。Itamar Grosskopf等人研究低分子肝素對膳食后代謝過程中機體乳糜微粒清除作用,發現乳糜微粒清除率與HL活性也呈現正相關關系[10]。

如圖3,與基礎對照組相比,高脂模型組大鼠肝臟中HL活性下降,而且具有顯著性差異(p<0.05)。HL的活性降低,可能會降低機體對LDL的清除作用,而且協助HDL-Ch逆向轉運的能力減弱。HL調節細胞內脂質貯存消耗會增加脂肪酸的過氧物酶體增生激活受體α及其靶基因的表達,HL在內質網中具有活性且表達增強會導致脂肪酸與三酰甘油及膽固醇酯結合程度顯著降低[11]。

圖3　蕎麥粉對高脂膳食肝臟HL活性的影響(n=10)Fig.3　Effects of buckwheat on HL activity of liver in HFD rats(n=10)

與高脂模型組相比,蕎麥低、中劑量組大鼠肝臟中HL活性降低,且具有顯著性差異(p<0.05),而且隨著蕎麥劑量的增加,HL活性逐漸增高,但是低于高脂模型組,可能蕎麥對高脂膳食大鼠肝臟中HL活性調節作用并不明顯。

2.4蕎麥對高脂膳食大鼠肝臟中LPL活性的影響

LPL存在于肝外組織毛細血管內皮細胞表面,主要催化血漿中乳糜微粒(CM)和極低密度脂蛋白(VLDL)中的甘油三酯(TG)水解,在CM和VLDL降解中發揮重要作用。相關研究表明體外口服脂肪酶,脂肪酶能明顯改善高脂乳劑誘導的大鼠的高三酰甘油和高脂性脂肪肝情況[12]。如圖4,與基礎對照組相比,高脂模型組大鼠肝臟中LPL活性降低。LPL活性降低表明高脂膳食導致小鼠機體的TG分解能力下降,可以初步推斷高脂膳食可能會通過影響機體肝臟脂代謝相關酶的作用,進而導致機體脂代謝紊亂。

圖4　蕎麥粉對高脂膳食肝臟LPL活性的影響(n=10)Fig.4　Effects of buckwheat on LPL activity of liver in HFD rats(n=10)

與高脂模型組相比,蕎麥組能夠增高大鼠肝臟中LPL活性。隨著蕎麥劑量的增加,LPL活性逐漸增高,其中中、高劑量組效果顯著(p<0.05)。說明蕎麥粉可能會通過提高LPL活性而使CM和VLDL中的TG水解,進而加快脂肪在體內分解速度,減少脂肪在體內的積累,最終可能抑制VLDL、TG水平的升高[13]。前期研究也證明了蕎麥粉能夠降低高脂膳食大鼠血清及肝臟中TG水平[14]。研究表明LPL是血脂清除和組織攝入脂肪酸的限速酶,它的表達在轉錄和轉譯等多個不同水平上嚴格控制,以應對不同的生理信號刺激。如果膳食脂肪的代謝調控出現問題,將會導致高甘油三酯血癥,誘發心血管疾病、胰島素抵抗和肥胖等相關疾病[15]。

2.5蕎麥粉與肝臟脂代謝相關酶活性的相關性分析

由表1進一步得出不同劑量蕎麥粉、LPL、HL、LPS四者相關程度。蕎麥粉劑量與LPS呈現極顯著正相關關系(p<0.01),LPL與HL呈現極顯著正相關關系(p<0.01),LPS與LPL、HL呈現顯著正相關關系(p<0.05),然而蕎麥粉劑量與LPL、HL呈現正相關關系,但是不顯著(p>0.05)。

表1　蕎麥粉,LPL,HL,LPS之間相關性分析(n=10)

注:*表示相關性顯著(p<0.05);**表示相關性極顯著(p<0.01)。

2.6蕎麥粉對高脂膳食大鼠TP及ALB的影響

TP主要反映肝臟的儲備能力。當TP偏高時,說明肝臟儲備能力較低,不利于肝細胞修復,以及人體需求。由圖5可以看出,五組大鼠血清中總蛋白的含量基本相同,各組之間均沒有顯著性差異(p>0.05)。可見,雖然30 d高脂膳食對大鼠肝臟脂代謝有較大影響,但是并未導致肝臟儲備能力下降以及肝臟相關疾病的發生。然而卻不能判斷如果繼續并且長期高脂膳食是否會影響大鼠肝臟的功能,因此,從血液中TP角度研究高脂膳食對機體肝臟功能的影響以及蕎麥對肝臟的保護作用有待進一步探討。

圖5　蕎麥粉對高脂膳食大鼠血清中TP含量的影響(n=10)Fig.5　Effects of buckwheat on TP content of serum in HFD rats(n=10)

ALB由肝臟合成,是正常人體血清總蛋白中的主要蛋白質成分,ALB在維持血液膠體滲透壓、體內代謝物質運輸、營養等方面起著很重要的作用。肝臟疾患時常常檢測ALB含量來協助診斷,判斷預后。由圖6可以看出高脂模型組大鼠血清中白蛋白的含量略低于對照組,但是差異并不顯著(p>0.05)。而蕎麥劑量組大鼠血清中白蛋白的含量略高于高脂模型組,但是差異也不顯著(p>0.05),所以不能說明30 d高脂膳食對大鼠機體中ALB的影響以及蕎麥的作用。ALB含量變化程度與肝病的嚴重程度有關[16],ALB半衰期約為19 d,所以當肝臟病變時,往往要到一定時間和一定的程度時,ALB才能夠有一定變化。但是長期高脂膳食對ALB的影響而導致肝臟病變有待于進一步研究。此外,高脂膳食能夠引起機體肥胖,肥胖程度越高,氧化應激水平和炎癥反應越強,血管收縮活性物質水平越高,造成血壓上升[17],相關醫療部門采用多元線性回歸模型分析發現ALB與門診高齡老年人的收縮壓及舒張壓呈現相關性[18]。由此也可以推斷ALB與高脂膳食引起的血壓上升可能也存在一定關系,進而可以推斷蕎麥粉對于高脂膳食引起高血壓可能具有一定調節作用,但是對于其作用機制還有待進一步研究。

圖6　蕎麥粉對高脂膳食大鼠血清中ALB含量的影響(n=10)Fig.6　Effects of buckwheat on ALB content of serum in HFD rats(n=10)

3　結論

本實驗通過構建高脂膳食大鼠模型研究蕎麥粉對高脂膳食大鼠肝臟中脂代謝相關酶及血清中蛋白含量的影響。與高脂模型組相比,蕎麥劑量組大鼠終體重降低(p>0.05);蕎麥低、中劑量組體重增加量差異不顯著,其中蕎麥高劑量組體重增加量顯著降低(p<0.05);蕎麥粉劑量組大鼠肝臟中LPS及LPL活性增高,其中中、高劑量差異顯著(p<0.05);蕎麥粉低、中劑量組大鼠肝臟中的HL降低;蕎麥粉劑量組血清中的TP及ALB差異不顯著。另外對蕎麥粉劑量、LPL、HL、LPS之間進行相關性分析,發現蕎麥粉與這三項指標都呈現正相關關系,與LPL呈現極顯著正相關,LPL與HL呈現極顯著正相關關系(p<0.01),LPS與LPL、HL呈現顯著正相關關系(p<0.05)。綜上所述,用蕎麥粉干預高脂膳食,可以通過調節高脂膳食大鼠肝臟脂代謝相關酶作為靶點調節脂代謝,另外通過測定血清中蛋白含量預示蕎麥對肝臟保護作用,這是蕎麥治療高脂膳食引起的相關疾病的一個重要作用機理。本研究的結果為今后以脂代謝相關酶為靶點進一步研究蕎麥有效成分及其配伍規律,制定以有效成分為質量控制指標的新藥質量標準,穩定并提高療效奠定了基礎。

[1]王清勇. 普羅布考預處理對高脂飲食誘導肥胖大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制[D]. 長沙:中南大學,2014.

[2]Merendino N,Molinari R,Costantini L,et al.A new “functional” pasta containing tartary buckwheat sprouts as an ingredient improves the oxidative status and normalizes some blood pressure parameters in spontaneously hypertensive rats[J]. Food Funct,2014,5(5):1017-1026.

[3]孫紅,夏淑芳,陳洪建. 槲皮素對高脂膳食小鼠學習記憶能力的影響[J]. 營養學報,2012,34(4):353-357.

[4]李龍囡. 抗氧化功能因子對高脂膳食小鼠脂代謝的調節作用及其機制研究[D]. 無錫:江南大學,2013.

[5]保健食品檢驗與評價技術規范[M]. 北京：中華人民共和國衛生部,2003:35-37.

[6]扈曉杰.巖藻黃素和豆渣膳食纖維對肥胖的預防作用及其機理研究[D]. 杭州:浙江大學,2013.

[7]劉芳麗. 膳食纖維減肥功效的機理探討[J]. 食品研究與開發,2007,28(4):156-159.

[8]陳忠,馬根山,黃峻. 脂蛋白脂酶與血脂代謝及冠心病關系研究進展[J]. 心血管病學進展,2005,26(3):320-322.

[9]張曉剛,陳運貞. 肝脂酶與脂蛋白代謝[J]. 國外醫學:臨床生物化學與檢驗學分冊,2002,23(1):48-49.

[10]Itamar Grosskopf,Aviv Shaish,Assaf Ray,et al.Low molecular weight heparin-induced increase in chylomicron-remnants clearance,is associated with decreased plasma TNF-αlevel and increased hepatic lipase activity[J]. Thrombosis Research,2014,133(4):688-692.

[11]Bruce Erickson,Senthamil Paramadayalan Selvan,Kerry WS Ko,et al. Endoplasmic reticulum-localized hepatic lipase decreases triacylglycerol storage and VLDL secretion[J]. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids,2013,1831(6):1113-1123.

[12]蔡潔娜,胡志明,張犁,等.口服脂肪酶對高脂性模型大鼠脂代謝和脂肪肝的影響[J]. 廣東醫學,2014,35(7):989-992.

[13]沃興德,崔小強,唐利華. 姜黃素對食餌性高脂血癥大鼠血漿脂蛋白代謝相關酶活性的影響[J]. 中國動脈硬化雜志,2003,11(3):223-226.

[14]王丹,葛紅娟,張笑,等. 蕎麥粉對高脂膳食大鼠脂代謝的影響[J]. 現代食品科技,2015,31(6):23-28.

[15]黃海,米楊,田苗苗. 膳食脂肪的餐后代謝與脂蛋白脂肪酶研究進展[J]. 食品科學,2015,36(9):235-241.

[16]馮志偉,馮朔,瞿幸華. 忻州地區健康成人血清總蛋白、清蛋白及清蛋白/球蛋白比值的參考范圍調查[J]. 國際檢驗醫學雜志,2011,33(16):1958-1959.

[17]周青青. 白藜蘆醇對高脂膳食小鼠氧化還原狀態和血壓調節作用[D]. 無錫:江南大學,2012.

[18]汪漢,張桂麗,蔡盈盈. 門診高齡老年人血清白蛋白水平與血壓的相關性[J].中華高血壓雜志,2014,22(1):82-84.

Effects of buckwheat on lipid metabolism enzymes of liver and protein of serum in high-fat diet rat

WANG Dan1,2,ZHANG Lan1,2,FENG Xiao-yu1,2,ZHANG Yang-ting1,2,SONG Chun-mei1,2,*

(1.Department of Public and Health,Jinlin Medical College,Jilin 132013,China; 2.Lever Two Laboratory of Administration of Traditional Chinese Medicine of Jilin Province,Jinlin Medical College,Jilin 132013,China)

The aim of this study was to point out the effect of buckwheat on lipid metabolism enzymes of liver and protein of serum in high-fat diet rats. Fifty male Wistar rats were assigned randomly to the following groups:control diet,high-fat diet(HFD)and low,medium,high dosage BW group. The relevant index of livers and serum were detected after 30 days. The results showed that weight of HFD group were increased and activity of HL,LPL and LPS were decreased significantly than control diet group(p<0.05). Compared with HFD group,the increasing weight of high BW group rats were decreased(p<0.05),activity of LPL and LPS in medium and high dosage of BW group were increased significantly(p<0.05),activity of HL were decreased. TP and ALB of serum in these groups had no significant difference(p<0.05). BW and HL,LPS,LPL had positive correlation through correlation analysis,LPS had highly significant positive correlation with HL(p<0.01),LPS had significant positive correlation with LPL and HL(p<0.05). In conclusion,BW may regulate the activity of lipid metabolism enzymes by interference high fat diet.

buckwheat(BW);high-fat diet(HFD);lipoprteinlipase(LPL);lipase(LPS);hepaticlipase(HL)

2015-10-19

王丹(1988-),女,碩士,助理實驗師,研究方向:植物蛋白工程,E-mail:wangdan19881011@163.com。

宋春梅(1964-),女,碩士,教授,研究方向：營養與慢性病,E-mail:1209816131@qq.com。

吉林省科技發展計劃基金(201105089)。

TS210.1

A

1002-0306(2016)10-0351-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.064